（生物医学工程专业论文）植物细胞氧化迸发机理研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 - a b s t r a c t v e r t i c i l i u md a h l i a ek l e bi sak i n do fp a t h o g e n i cf u n g u sw h i c hc a nc a u s ec o t t o n w i l t d i s e a s e r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) a n d c a l c i u ma r e i m p o r t a n ts i g n a l s u b s t a n c e so ft h ep l a n td e l e n s er e s p o n s e i ti sam e a n i n g f u lt h i n gt os t u d yo nt h es i g n a l t r a n s p o r tp a t h w a y so f r o sa n dc a l c i u mw h e nc o t t o nc e l l sa r et r e a t e db yt h ef u n g u s ， w h e nt h ec o t t o nc e l l sh a db e e ni n d u c e db yt h ef u n g ie l i c i t o r ，t h ef r e ec a l c i u mi n t h ec e l lw a l li n c r e a s ed i s t i n c t l yi n2 - 3 m i n w h e t h e ri nt h ee n v i r o n m e n tw i t he n o u g h c a l c i u mo rn oc a l c i u m t h ec a l c i u mi nt h ec o t t o np r o t o p l a s ti n c r e a s ed i s t i n c t l ya f t e rt h e i n d u c t i o n t h er e s u l ts h o w st h a te x c e p tt h ec a l c i u mp o o l si nt h ee e l lw a l l t h es e c r e t i o n o fc a l c i u mp o o l si nt h ec y t o p l a s ma l s op l a yv e r yi m p o r t a n tr o l ei nt h ed e f e n s er e a c t i o n a l s ow h e nt h ec o t t o nc e l li n d u c e db yt h ef u n g ie l i c i t o r , t h ei - 1 2 0 2i n c r e a s ed i s t i n c t l y a l o n gt h em e m b r a n ei n 3 - 5 m i n i ts h o w st h a tt h eg e n e r a t i o no fh 2 0 2h a p p e n so nt h e c e l lm e m b r a n e t h er e s u l ts h o w st h a tc a l c i u ma n dh 2 0 2t a k ep a ni nt h ed e f e n s es i g n a l t r a n s p o r ti nt h ep l a n tc e l la ss e c o n dm e s s e n g e r s b ya d d i n gt h ee g t a a n dh 2 0 2 ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec a l c i u ma n dh 2 0 2 s i g n a lc a nb es t u d i e d t h er e s u l ts h o w st h a tt h ee x t r a c e l l u l a rc a 2 + i sp r e r e q u i s i t ef o r o x i d a t i v eb u r s ti nf u n g a le l i c i t o r - t r e a t e dc o t t o nc e l l s t h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 a l s oc a ni n d u c et h ei n c r e a s eo fc a l c i u mi nc o t t o nc e l l t h e r ei sac l o s er e l a t i o nb e t w e e n t h ec a l c i u ma n d h 2 0 2 i ti ss u p p o r t e dt h a tt h ec a l c i u mp o o l si nt h ec e l lw a l lp l a yav e r y i m p o r t a n tr o l ei nt h ed e f e n s es i g n a lt r a n s p o r ti nc o t t o nc e l l t h i sp a p e ra l s os t u d i e dh o wt h es a l i c y l i ca c i de f f e c tt h ec a l c i u ma n do x i d a t i v ei n t h e p l a n tc e l l s t h ep a p e ra l s os t u d i e do nt h ee f f e c to f s a l i c y l i ca c i da n d1 - 1 2 0 2 0 1 1t h e d a h l i a e k l e b w h e nt h es u s p e n s i o n c u l t u r e dc o t t o nc e l l sm y 6 ( s e n s i f i v e ) a n dm y s ( t o l e r a n t ) h a d b e e ni n d u c e db yt h ee l i c i t o rh 4a n d1 6 4w h i c hm a k ef r o mw i t hd i f f e r e n tv i r u l e n c et h e h i g h e ro x i d a t i v eb u r s tc a nb ed e t e c t e di nh i g h e ri n c o m p a t i b i l i t ys y s t e m ( 1 6 4 - - m y s ) ， t h ev i r u l e n c eo fe l i c i t o r sf r o m v 6 4d e c r e a s ew h e nt h e yw e r et r e a t e db yl o w c o n c e n t r a t i o n s a l i c y l i ca c i d ( 1 m m o l l ) a n dh 2 0 2 ( 0 2 m m o l l ) ，b e c a u s et h e y c a n i n d u c eh i g h e ro x i d a t i v eb u r s tc o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r o la n da h e a dt h ep e a kt i m e ，t h e s ac a na h e a dt h e p e a k o f1 2 m i n ，a n dh 2 0 2c a na h e a dt h e p e a k o f6 m i n t h i s p h e n o m e n o nh a dn e v e rb e e nr e p o r t e d k e y w o r d s ：c o t t o nv e r t i c i l i u md a h l i a ek l e b o x i d a t i v eb u r s tc a l c i u m i l j j j q 华中科技大学硕士学位论文 第一章绪论 在自然环境中，植物总是处于大量病原体的威胁之下，因此需要不断地抵 抗病原微生物的侵害。在这种长期相互影响的共进化过程中，除了天然的结构 屏障和体内已存在的毒素之外，植物逐渐形成一系列复杂而行之有效的保护 机制来抵御病原微生物的侵染【1 , 2 1 。植物可以识别入侵的病原体，启动体内的 防御反应，这些防御反应表现为植物对病原具有杀伤或抗性作用【1 3j 。许多反应 是通过控制甚至清除病菌，降低病菌引起的损伤而达到保护自己的目的。否则， 当植物感染了敏感的病菌后，病菌会繁殖并扩散到整个植株上，引起植物严重 伤害甚至死亡。 1 1 植物防御反应及防御信号 植物抗病常常表现为限制病菌生长和扩散，控制在感染部位的小区域内。 植物以三种方式产生对植物的抗性：】植物不能满足病原体生存的营养条件； 2 植物自身具有的组成型防御系统，如植物表面的木质、栓质、蜡质、角质等 结构屏障，以及植物凝集素( 1 e c t i n s ) 和酚类等小分子物质；3 。感知和识别 病原的侵袭，从而产生积极主动的防御反应，包括超敏反应、病程相关蛋白和 植保素的合成等等。在上述三种非亲和性互作中，只有第三种防卫机制才是诱 导性的和特异性的，它被称为小种特异性抗性、基因对基因抗性或超敏反应 ( h r ) 抗性。 植物诱导性防卫反应的历程大致可以分为三个阶段：( 1 ) 植物细胞对病原 微生物的识别。( 2 ) 胞内信号的转换和传递。( 3 ) 防卫反应的开启和系统获得性 抗性( s a r ) 的产生d , 4 1 。 1 1 1 植物细胞对病原微生物的识别 在植物与病原相互作用中，植物寄主能够感知并识别由病原微生物直接或 间接产生的信号物质，由于这些物质往往能够引起植物的超敏反应，从而引起 一系列有效的防御反应，故被称为激发子( e l i c i t o r s ) 。而感病品种则不能有效的 识别病原、转导防御信号并诱发防御反应【3 5 1 。 激发子诱导植物发生防御反应的信号转导首先是激发子与植物受体之间 的相互识别。早在4 0 年代，f l o r 根据亚麻对秆锈菌的抗性遗传分析，提出基 华中科技大学硕士学位论文 因对基因学说( g e n e f o r g e n et h e o r y ) 。此学说提出亲和与不亲和病原分别带有 毒( v i r ) 与无毒( a v r ) 基因，亲和与不亲和寄主分别带感病( s ) 与抗病( r ) 基因。病 原无毒基因和寄主抗病基因为显性基因，病原有毒基因和寄主感病基因为隐性 基因。带无毒基因的病原与带抗病基因的寄主互作时寄主表现抗性，其它情况 下寄主表现为感病。寄主抗性由寄主抗病基因的直接或间接产物与病原无毒基 因的直接或间接产物相互识别，从而激发寄主的防御反应【6 7 j 。 外源性激发子包括小种特异性激发子和非特异性激发子，无毒( a v r ) 基因的 产物是小种特异性激发予。它们可以触发r 基因决定的特异性防卫反应。从 病原细胞壁可以得到多种非特异性的外源性激发子，它们可以诱导植物产生不 同的防卫反应如植保素的积累、离子流变化、活性氧变化、防卫基因的表达和 h r 细胞死亡等 5 6 , 7 1 。 高等植物的细胞膜受体可能负载对病原微生物的识别，植物细胞的抗病基 因蛋白r 蛋白 8 】可以识别植物性的内源性激发子和病原性的外源性激发子充当 了受体。当寄主植物细胞的抗病基因蛋白在质膜上直接与激发子相结合，或者 当激发子激活膜上内嵌蛋白激酶的结构域时，下游的一系列防御反应的信号转 导系统被激活1 7 , 8 1 。 1 1 2 细胞信号的跨膜传导和传递 当植物细胞识别激发子，激发子与细胞质膜上的受体结合后，细胞内信号 的转换和传递就开始。首先是g 蛋白的激活，g 蛋白则能激活磷脂酶c ，产生 两种重要的信号分子：肌醇三磷酸( i p 3 ) 和甘油二脂( d a g ) ，i p 3 可以诱导细胞 内的器官释放c a n 来调节细胞质内的c a 2 + 浓度，d a g 可以活化蛋白质激酶【4 1 。 由受体接受信号向细胞内传导的过程可能与受体的磷酸化和脱磷酸化有 关。激发子和受体相互作用可以引发质膜蛋白、胞质蛋白和核蛋白的磷酸化， 某些蛋白激酶抑制剂抑制了蛋白磷酸化和防卫基因的表达1 5 】。 目前普遍被认为活性氧( a o s ) 、钙离子( c a 2 + ) 、水杨酸( s a ) 、茉莉酸 ( j a ) 、茉莉酸甲酯( m j ) 和乙烯为植物细胞内活跃的信号物质 7 8 ，9 1 。 1 1 3 防卫反应的开启和系统获得性抗性( s a r ) 的产生 植物受非亲和病原物侵染后，经过几天到一周时间，被侵染的植物在未侵 染部位产生新的抗性，从而对病原菌的再次侵染甚至其他病菌的感染均具有很 华中科技大学硕士学位论文 强的抗性。这种抗性水平可以扩展到整个植株，通常称为系统获得性抗性 ( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) p , n o 植物系统获得性抗性的获得是防卫基因的激活与防卫反应的开启的结果。 在真核生物中可逆性磷酸化是调节基因转录活动最常见的机制。研究表明，这 种机制在植物防卫基因的活动中也存在 3 , 6 , 9 , 10 】。由激发子所诱导的信号传导的 终点是激发子响应性顺式因子与转录因子之间的相互作用。目前已经从分离到 的防卫基因中找到了许多激发子响应性顺式因子【7 】。如玉米p r m s 基因、欧芹 p a l l 基因以及水稻p a lz b 8 基因。至此激发子在基因水平上诱导了防卫反应 的开启。 1 2 钙信号和活性氧的研究现状 对植物抗病信号的研究，几十年来已取得了很多成果。目前c a ”和活性 氧已被公认为胞内第二信使f j l 6 9 j 。 1 2 1 钙信号的产生及功能 已经有许多强有力的证据证实f c a 2 + c y t 作为植物的第二信使 1 5 , 1 6 , 1 7 1 在信 号事件中扮演中心角色，参与细胞内多种生理生化活动，特别是防御反应的激 活【i “。另外钙在植物细胞中还扮演着特殊的角色，对植物细胞的结构和生理 功能有重要作用，能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，参与植株生 长发育的调节过程f 4 , 15 , 1 6 】。已知触摸、病原物侵染、植物激素、逆境( 包括盐胁 迫、氧化胁迫、低温、高温、干旱等) 等因素均能引起胞内c a ”水平的改变。 这种变化能够启动细胞内系列生理生化过程，对外源信号进行传递和放大。 与动物细胞相似，植物细胞可以通过细胞质中的c a 2 + 浓度迅速的变化对外界刺 激作出反应1 3 , 7 , 16 。这种变化以二种方式体现，c a 2 + 浓度迅速增加以及c a 2 + 振 荡( o s c i l l a t i o n ) ，振荡的方式( 如振幅、频率) 取决于接受信号的细胞类型以及 刺激的强度和性质【1 6 ，1 8 】。 早在1 9 5 7 年，h o d g k i n 和k e y n e s 埔】就通过一个简单而重要的试验( 注射 4 5 c a 及4 2 k 到鱿鱼轴突中，几小时后观察表明4 2 k 已经均匀分布在轴突中而 4 5 c a 仍在注射部位，证实在细胞质中钙不是自由的离子，钙必定依赖于扩散以 外的机制实现在细胞质中的运动。植物细胞通过c a 2 + 通道和c a 2 + 泵调节胞内 c a ”水平变化。 华中科技大学硕士学位论文 图1 详细描绘了钙信号的产生和传递途径【1 6 】 圈1 植物中主要c a 2 + 传送途径示意圈 a c a 1 ，a c a 2 ，a n da c a 3a r ea r a b i d o p s i sc a 。+ a t p a s e s b c a1i sab r a s s i c ao l e r 口c e dc a ”a t p a s e c a xii sac a 2 + h + a n t i p o r t e rf r o ma r a b i d o p s i s b c c l ，b r i o n i c ac a ”c h a n n e l ；i n s p 3 r ，p u t a t i v el n s p 3r e c e p t o r ； r y r ，p u t a t i v er y a n o d i n er e c e p t o r ， v d c c 2 v o l t a g e - d e p e n d e n tc a ”c h a n n e l2 ： v v c ac h a n n e l v a c u o l a rv o l t a g e - g a t e dc a ”c h a n n e l 在对植物细胞钙信号的研究过程中，细胞钙库的重要性已得到公认”， 但是细胞壁钙库在c a 2 + 内流中的作用的研究尚未见报道，细胞壁中所蕴含的大 量c a ”除了担当结构组分之外，必定还具备其它功能，对此进行进一步研究是 4 华中科技大学硕士学位论文 十分有意义的工作。 1 2 2 活性氧的产生及功能 活性氧是泛指那些含有氧原子的但比氧具有更活泼的化学反应性的氧的 某些代谢产物及其衍生物。活性氧在某些情况下可能对寄主植物和病原微生物 造成严重的毒害。植物中主要的活性氧包括超氧阴离子( 0 2 。) 、羟自由基( o h 一) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 等2 2 0 ，“1 。 活性氧迸发( o x i d a t i v eb u r s t ) 被认为是h r 的特征性反应，也是植物对 病原菌的早期反应之一1 2 , 2 2 。d o k e 2 3 1 首先报道了马铃薯与晚疫病菌 ( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n ) 互作过程中有活性氧产生，随后的研究表明，细 菌，真菌，病毒，植物细胞壁成分，重金属离子，机械胁迫和损伤都能诱导 a o s 生成【2 , 2 1 , 2 4 。 在植物一病原体的相互作用中，分子氧( 0 2 ) 的第一个单电子还原物超 氧阴离子( 0 2 ) 的产生需要微量的能量，此能量一般由生物体系中的n a d ( p ) h 提供的，随后的产物过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟自由基( o h ) 可自发形成，或在有适当 的反应物时产生，这些反应不需要额外的能量。植物一病原体相互作用中活性 氧的产生实际上分两个阶段：第一阶段发生在病原体加入后几分钟内，相对时 间较短，为非专一性反应，即亲和( 可致病，不引起过敏反应) 和非亲和( 引起过敏 反应) 病原体均诱导该反应：第二阶段相对时间较长，通常在接种后2 3 小时 后发生，表现出专一性| 2 , 3 , 6 , 2 1 】。 已经证明植物与哺乳动物在防御反应中产生活性氧的途径是相似的，即植 物一病原体相互作用中活性氧的产生与n a d ( p ) h 氧化酶相关【7 , 2 5 】。过氧化物 酶的催化是植物一病原体相互作用中活性氧产物的另一个来源。 活性氧水平的大量提高被认为是一种氧化或呼吸的突发，一般称之为活性 氧迸发，是超敏反应( h r ) 重要的早期事件，在感染不同病菌后数分钟或数小 时后发生。 首先活性氧具有抗微生物活性的功能，活性氧能够直接杀死入侵微生物， 直接使用h 2 0 2 可以抑制真菌的孢子萌发和细菌的生长。其次活性氧具有强化 细胞壁的功能，在一些非亲和反应中，活性氧可使酪氨酸残基与细胞壁上的蛋 白发生交联，在h 2 0 2 存在时，过氧化物酶能介导松柏醇，羟基肉桂醇以及其 _ _ 0a1 华中科技大学硕士学位论文 它细胞壁成分的聚合和交联，从而增加细胞壁的强度，作为物理屏障起着延缓 和阻止病原菌的侵入和扩散，避免细胞受第二次感染。 另外，在植物h r 形成时，活性氧引起宿主细胞质膜损伤 2 , 2 1 1 及细胞死亡 【6 ，22 1 。直接被病原体侵染的一些植物细胞可发生程序化细胞死亡，使侵入的微生 物失去最直接的能量和物质来源。 活性氧引起的细胞死亡不仅可以限制病原菌的活动，0 2 或h 2 0 2 释放也 可引起自身保护机制的激活。活性氧可以作为信号分子诱导各种抗病反应 1 2 , 2 1 , 2 4 。如活性氧能够诱导植保素的合成。有证据表明低水平的h 2 0 2 能长距 离的作用于一些细胞【26 1 ，诱导寄主细胞产生系统获得性抗性1 引，阻止次级感染 的发生。 1 2 3 活性氧与钙信号之间的关系 过氧化氢和钙离子都是植物细胞信号传递链中重要的第二信使。大量文献 都证实胞质钙增加与活性氧是密切相关的 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 ，有观点认为胞外钙的内流 是氧化迸发的先决条件，其证据是钙的螯合剂或钙通道阻塞剂能够抑制钙的瞬 间内流并阻止氧化迸发。如d o k e 小组的m i u r a 2 7 】等发现细胞外钙螯合剂e g t a 、 钙通道阻塞剂v e r a p a m i 、d i l t i a z e m 、c o c l 2 、l a c l3 ，都能有效抑制由激发子 引起的氧化迸发。s c h w a c k e 和j a b s 都依据其实验结果得出结论认为对真菌激 发子诱导云杉细胞培养物【2 8 1 及细菌激发子诱导的欧芹细胞中1 2 9 的活性氧迸发 而言，胞外钙的存在是必要的先决条件。但同时也有实验证据表明活性氧可能 作为信号物质触发胞质钙离子浓度的增加【3 0 1 。存在此分歧的原因在于，细胞 信号的传递途径本身是一个复杂交错的网络。 另外细胞壁钙库在氧化迸发过程中所扮演的角色也是引人注目的问题，细 胞壁作为植物细胞中最大的钙库f 1 8 , 3 1 , 3 2 , ，其存储和转运钙的能力不容忽视， 但一直缺乏明确的实验证据予以证明。解决这些问题，必须依赖于对植物细胞 中防御信号传递途径的进一步深入的研究。 1 3 本课题的主要研究内容及其意义 本课题的重要研究内容为： 一： 植物防御反应中钙释放与局部防御信号氧化迸发之间的关系，确定 6 华中科技大学硕士学位论文 细胞壁钙库对氧化迸发的意义。 二： 研究系统防御信号与钙释放和氧化迸发之间的关系，探索水杨酸的 细胞信号途径。 三： 研究水杨酸和h 2 0 2 对病原微生物的影响。 完成上述研究内容，将有助于澄清氧化迸发发生机制上的一些有歧义的观 点，例如氧化迸发产生是由细胞膜上的酶催化还是由细胞内的酶催化。此外关 于棉花抗病反应机制尚未见诸报道，本论文填补了此空白。 华中科技大学硕士学位论文 第二章激发子诱导植物完整细胞及原生质体 钙释放的比较研究 目前c a 2 + 已经被公认为是植物细胞防御信号传递的第二信使【9 ”，即某 种外源刺激可以通过细胞质自由c a 2 + 的变化引起细胞防御反应，因此细胞质 c a 2 + 的变化受到了广泛的关注。引起细胞质c a ”升高的主要因素是细胞外钙的 内流和细胞钙库中钙的释放1 1 6 ) i g a 9 】。由于病原微生物作用植物细胞后，能检测 出的最初变化是细胞质膜的电位去极化和离子流，包括c i _ 外泌和c a ”的内流 等1 15 , 1 6 】。故认为防御反应中细胞c a ”信号的产生与c a ”的内流密切相关。但 是没有文献报导细胞壁钙库在c a ”内流中的作用。 尽管已经发展了几种新的测定细胞内钙的技术1 33 ，”，3 “，但是化学荧光标记 p 4 ”1 仍是目前通用的研究细胞内钙的技术，这是因为用荧光显微镜能够很方便 和直接地对荧光探针所标记的细胞内钙离子浓度进行实时检测。在各种化学荧 光试剂( f u r a 2 ，f l u 0 3 ，i n d oi ，r h o d 2 ) 3 7 , 3 8 , 3 9 , 4 0 中，f 1 u 0 3 a m 目前得到 广泛应用。f l u o 3 a m 为f l u o 3 的乙酰羟甲基酯( a m ) 形式，本身不发出荧 光，可穿透细胞膜进入细胞质，进入胞内的f l u o 3 a m 可被细胞质中的酯酶水 解为f l u o - 3 游离态形式，从而束缚在胞内。当细胞内存在游离c a 2 + 时，f l u o 3 能够与之相结合，并发出荧光，且荧光强度与游离c a 2 + 的浓度成比例关系， 因此可以利用荧光强度的变化来检测c a 2 浓度的变化。其激发波长为 4 9 0 5 1 0 r i m ，激发峰值5 0 6 n m ，发射波长为5 2 0 5 5 0 n m ，发射峰值为5 2 6 n m t 4 1 1 。 本章将借助f l u o 3 荧光探测技术，比较棉花叶表皮细胞和叶肉细胞原生 质体在病原真菌一大丽轮枝菌激发子诱导下细胞质c a ”的变化，以分析植物细 胞钙库在植物细胞防御反应中的作用。 2 1 材料与方法 2 1 1 生物材料的准备 1 植物材料 植物材料包括棉花黄萎病感病品种鄂棉18 号和耐( 抗) 病品种中棉12 华中科技大学硕士学位论文 号，所有棉种均由华中农业大学吴征斌教授惠赠。 植物材料的栽培：取适量腐殖土，于1 4 0 1 6 0 ( 2 干热灭菌2 小时，分装于 1 2 5 m l 的一次性塑料杯中( 杯底穿孔) 。选取上述品种的植物种子若干，经过 脱绒( 棉花种子) 、消毒和浸种，置入盛有无菌湿润滤纸的培养皿中，封口膜 封住培养皿边缘，以防止水分蒸发，3 0 ，黑暗、温育2 4 3 6 h 后取出已经萌 发的棉籽，植入杯中，每杯2 株。温度2 5 ，自然光照，湿度7 0 。 2 微生物材料 微生物材料为棉花黄萎病致病菌一一大丽轮枝菌( v e r t i c i l i u md a h l i a ek l e b ) 的高毒株( v 4 4 ) ，由华中农业大学棉花抗病育种室惠赠，本室保存。 2 1 2 设备与试剂 荧光显微镜( 0 l y m p u sb h 2 r f c a ) 倒置光学显微镜( 上海徕卡显微镜有限公司e m e d 一2 ) 离心机( 上海安婷科学仪器厂l x j i ib ) f l u o 一3 乙酰甲酯( f l u o 一3 a m ) ( 美国m o l e c u l a rp r o b ei n c ) 二甲亚砜( d m s o ) ( 国产分析纯) f d a ( f l u e r e s c e i n d i a c e t a t e ，s i g m a 公司) 纤维索酶( c e l l u l a s eo n o z u k a r 1 0 ) ( y a k u l t h o n s h ac o l t d ) 果胶酶( m a c e r o z y m er 1 0 ) ( p r o d u c to f y a k u l t 北京经科化学试剂公司分装) 2 1 3 病原激发子的制各 将保存在马铃薯蔗糖斜面上的大丽轮枝菌v 4 4 接种到5 0 m l 查氏液体培养 基中，于2 5 ，转速1 2 0 r m i n 下培养3 d ，然后转到2 5 0 m l 含相同成分的新鲜 培养基中，继续培养至充满菌丝体。用布氏漏斗，两层滤纸抽滤得菌丝体。将 菌丝体洗涤后，加入到同体积的p h 6 8 的5 0 m m o l l 磷酸缓冲液中，2 0 0 0 0 r m i n 匀浆4 5 m i n ，2 ，0 0 0 g 离心2 0 r a i n ，收集沉淀，加适量蒸馏水，在1 2 1 高 压灭菌l 小时，过滤收集滤液，得到大丽轮枝菌激发子，按文献1 4 2 1 测总糖含 量，4 保存。 2 1 4 植物叶片下表皮细胞和叶肉细胞原生质体的制各 1 棉花叶片下表皮的制备 华中科技大学硕士学位论文 取健康棉花中上部完全展开的叶片，放在载玻片上，先用m e s k o h 缓冲 液浸润，用镊子撕取下表皮组织且避开叶脉，然后用毛笔刷去粘附于表皮上的 叶肉细胞，仅剩下半透明的叶片下表皮。最后用手术刀切下已除去叶肉细胞的 下表皮，用m e s k o h 缓冲液反复冲洗，并保存在m e s k o h 缓冲液中，室温 下预处理2 3h ，使表皮细胞活性降低。镜检前弃去缓冲液， 2 植物叶肉细胞原生质体的制各与活力测定 用移液枪吸取2 m l 酶液至3 5 m m 培养皿中，将撕去下表皮的棉花叶片放在 酶液上，去掉下表皮的一面朝下，使酶液与叶肉细胞充分接触，用封口膜封住 培养皿边缘，置于2 5 ，黑暗条件下酶解，可适当摇动( 不超过3 0 转分) 。 3 4 小时后，将培养皿置于倒置显微镜下观察，如有足量原生质体游离， 即可利用2 5 0 目尼龙网过滤酶液，除去未被酶消化的叶组织。 将滤液置于1 0 m l 离心管中，5 0 0 转分钟离心2 3 分钟。搜集沉淀。 于1 0 m 离心管中加3 m l0 5 m 蔗糖+ c p w ( k h 2 p 0 42 7 2m g l ，k n 0 31 0 1 0 m g l ，c a c l 2 2 h 2 0 1 4 8 0 0m g l ，m g s 0 4 2 h 2 02 4 6 0m g l ，k io 1 6m g l ， g u s 0 4 5 h 2 00 0 2 5m g l ，p h 5 8 ) ，将上述沉淀溶于0 5 m 甘露醇( 9 ) + c p w 中，混匀，加于0 5 m 蔗糖+ c p w 上，5 0 0 转分离心3 分钟，收集二层间悬浮的 原生质体( 尽量吸含甘露醇的一侧) 。加0 5 m 甘露醇+ c p w ，离心，洗涤卜2 遍，洗净酶液和残余的细胞碎片。 搜集原生质体，加入适量的原生质体培养基( n t 培养基) “，利用血球 计数板计算原生质体密度，调节其最终密度为1 0 5 m l 。嚣于培养皿中待用。 以上实验中所用的器皿和材料( 0 2 u m 的微孔滤膜，3 5 0 目的尼龙网，1 0 m l 带塞刻度离心管，移液枪头，培养皿，镊子等) 均经过1 2 l 高压灭菌或过滤 除菌。 3 原生质体的活力测定 取0 5 m l 上述原生质体培养物，加入0 2 m g m l 的f d a 丙酮溶液，使f d a 的最终浓度为o 0 1 ，室温下静置1 0 m i n 。5 0 0 转分离心3 分钟，搜集沉淀， 用新鲜缓冲液洗涤2 次，去除缓冲液中的f d a 。负载后在荧光显微镜下观察， 发绿色荧光的为活性细胞。 l o 华中科技大学硕士学位论文 2 1 5 植物叶片下表皮组织钙信号原位测定 下表皮负载f t u o 3 取上述下表皮组织置于5 m l 小烧杯中，悬浮于1 m l m e s k o h 缓冲液中， 加入5 0 u m o l l 的f l u o 3 母液，至终浓度为1 0 u m o l l ( 比负载原生质体时提高 一倍) ，轻微振荡。混匀。置于4 冷藏室中轻微振荡2 小时，取出后用新鲜 m e s k o h 缓冲液洗涤2 次，置于室温2 5 ，静置1 小时。用新鲜m e s k o h 缓冲液反复洗涤，去除未负载入细胞的f l u o 一3 ，以降低观测时的背景值。 载玻片经碱处理，盐酸浸泡，水冲洗，经蒸馏水浸泡，取出后于3 7 缓慢烘干， 待用。盖玻片用乙醇浸泡( 消除它对荧光的吸收作用) ，取出后3 7 缓慢烘干，待 用1 4 4 】。 下表皮细胞钙信号的原位测定 将上述制备好的棉花下表皮细胞置于载玻片上，小心展开，加1 2 滴 m e s k o h 缓冲液，用2 块盖玻片把表皮条固定在载玻片上( 两块盖玻片之间留 一小缝隙，这样有利于固定表皮，在加样时不易冲动1 ，使激发子最终糖浓度为 5 0 u g m l ( 如无具体说明，本章其他实验中均采用5 0 u g m l 的糖浓度外加激发 子进行诱导) 。打开汞灯，在荧光显微镜视野里找到一个荧光较亮的保卫细胞 并放置中央，进行记录并保存结果。每个实验重复4 5 次。取其中的一个图 像进行分析。 2 1 6 植物叶肉细胞原生质体钙信号原位测定 原生质体的固定 称取低熔点琼脂糖1 0 m g ，溶于l m l 原生质体悬浮液中，配制为1 溶液， 置于3 5 恒温水浴中溶解，吸取5 0 u l 加入9 6 孔板中，待其凝固后，即可滴加 激发子以及其它外源药物对细胞进行处理。每次实验从细胞样品处理到实验数 据收集应在2 3 小时内完成，避免细胞死亡，影响实验结果。 原生质体f l u o - 3 负载与钙信号测定 取上述原生质体充分洗涤，置于1 5 m l 的e p p e n d o r f 管中，悬浮于新鲜培 养基中，加入f l u o 3 母液至终浓度为5 u m o l l 。2 5 避光孵育3 0 m i n 。其优点 在于：管内液面的表面积小，液体不易干燥。用新鲜培养基洗涤3 次，去除剩余 染料，如上述方法固定后加入9 6 孔板，每孔1 0 0 u l ，即可滴加激发子以及其它 华中科技大学硕士学位论文 外源药物对细胞进行处理并对结果进行观察。 2 2 结果与分析 已知细胞内c a 2 + 的变化，受细胞生理状态的影响1 16 1 。为确保实验结果的 可靠性和重现性，所选用的细胞材料必须尽可能保持最大活性，对于游离细胞， 还必须对细胞进行贴壁处理，以保证作用环境的稳定。图2 1 一一图2 4 显示 了所制备的植物细胞材料的状态。 图2 1 棉花叶片下表皮显微结构图2 2 去下表皮的棉花叶片结构 ( 可见光4 0 0 倍，如未标注以下均为4 0 0 倍) 图2 1 显示下表皮保卫细胞和表皮细胞间连接样式，注意未诱导处理的保 卫细胞的气孔是开放的。 图2 2 显示叶肉细胞间连接样式。 图2 3 左图显示新鲜制备的游离的棉花叶肉细胞的原生质体，右图显示经 低熔点琼脂糖固定的原生质体。在光学显微镜下可以看到的致密的完整的球状 原生质体大多数都是有活力的，而边缘不整齐，有裂缝，形状不规则的原生质 体已经失活，不适合作为实验中的观测对象。 华中科技大学硕士学位论文 图2 4f d a 染色的棉花叶肉细胞原生质体 图2 4 左图显示可见光下的原生质体( 4 个) ，右图显示同一位置，经f d a 染色后的原生质体( 1 个) 。f d a 是一种荧光探针，能够准确标记具有活力的 细胞，使之具有明亮的荧光，可在荧光显微镜下观察到。 华中科技大学硕士学位论文 由图可知，原生质体是很容易失活的。由于原生质体活力是保证细胞能响 应刺激的前提条件，因此收集到原生质体后，需对其活力进行检测，以保证实 验材料的可信度。此外在诱导实验前必须确定在有限的观察视野内有有活性的 原生质体。对于下表皮材料，气孔的状态( 开放和关闭) 可能是应该注意的控 制环节。 图2 5 一图2 7 显示叶片下表皮组织和叶肉细胞原生质体受大丽轮枝菌激 发子作用时钙信号的产生。 图2 5 负载f l u o 3 的中棉1 2 叶片下表皮组织受激发子诱导后的荧光变化( 2 0 0 倍) 图2 5 左图显示可见光下观察到的受激发子诱导的叶表皮组织。可以看到 气孔关闭。右图显示根据荧光观察到的受激发子诱导的叶表皮组织。可以看到 关闭的气孔处，即保卫细胞的内侧壁较外侧壁有强烈的荧光。表皮细胞的荧光 也表现出沿壁扩展和分布不均匀的特点。 图2 6 a 显示可见光下的两个原生质体，注意两个原生质体紧靠在一起， 可能细胞间联系未被彻底消化掉；图2 6 b d 显示该原生质体受大丽轮枝菌激 发子诱导后发生的荧光变化，在相隔5 s 的间隔内，由一个原生质体的一部分 出现荧光到二个原生质体全亮起来，荧光强度呈现出在细胞中逐渐增加和在细 华中科技大学硕士学位论文 胞间扩展的过程。 图2 ，6 c 图2 6 d 华中科技大学硕士学位论文 图2 6 负载f 1 u o 3 的中棉1 2 叶肉细胞原生质体受激发子诱导后的荧光变化 图27 外加e g t a 时负载f l u o 3 的中棉1 2 叶肉细胞原生质体 受激发子诱导后的荧光变化( 2 0 0 倍) 图示外加e g t a 不能消除已负载f l u o 一3 的原生质体受激发子诱导后荧光 产生和增强。 从图中可以观察到，棉花下表皮细胞和原生质体在静息状态下荧光强度很 弱或没有荧光，说明细胞内游离c a 2 + 浓度很低。图2 5 一一图2 7 则表明病原 激发子可以诱导生活的植物细胞产生强烈的钙信号。 由于f l u 0 3 a m 的荧光探测原理是f l u o 3 a m 进入细胞，被酯酶分解，释 放f l u 0 3 ，与游离钙结合，受一定波长的光激发后发射荧光。f l u o 一3 与a m 分 离，不能进入其它膜性结构中，因此，叶下表皮组织保卫细胞的内侧壁的高荧 光强度和表皮细胞荧光强度沿壁扩展表明( 1 ) 病原激发子可以刺激细胞壁钙 库释放游离c a ”；( 2 ) 细胞壁有非专一性酯酶，可以水解f l u o 3 a m ，释放 f l u o 一3 ，并与细胞壁释放的游离c a ”结合；( 3 ) 保卫细胞内侧壁较外侧壁有较 高浓度的钙库或者受激发子作用时能释放较多的游离c a ”。尽管细胞壁的酶解 减少了进入保卫细胞和表皮细胞的细胞质的f l u o 3 a m 量。但是图片仍显示有 细胞内荧光产生，荧光强度表现出分布不均一性，表明该负载技术仍可用于完 1 6 华中科技大学硕士学位论文 整植物细胞c a 2 + 的观察。通过细胞膜进入细胞质后，荧光染料的酯化分子乙酰 甲氧基( a c e t o x y m e t h y l ，a m ) 被分解，根据检测出的荧光强度的区域性差异，即 能够反映细胞内膜性结构分布的差异。上述结果和c a 2 + 在细胞内不均匀发生与 分布有助于说明完整细胞中细胞壁和细胞区域化对防御过程中c a ”信号的产 生起着非常重要的作用。 由于c a 2 + 不可能在细胞内和细胞间自由扩散i ”】，因此图2 6 中荧光强度由 一个原生质体内逐渐增加和在两个相邻原生质体间扩展的过程表明细胞的钙 信号的扩展可能是正反馈信号传递过程，该过程可以通过细胞问缝隙连接启动 相邻细胞的相同过程( 见讨论) 。由于e g t a 是专一的c a ”螯合剂，e g t a 不 能通过细胞膜，因此图2 7 的结果还表明在病原激发子诱导的植物细胞c a ” 信号产生中，细胞内c a ”库也起着同样重要的作用。 此外，受刺激后保卫细胞或表皮细胞c a 2 + 浓度增加慢于叶肉细胞原生质 体。原生质体在激发子处理1 r a i n 内即可观察到荧光强度的显著增高，而在下 表皮细胞中这一过程到2 。3m i n 时才被观察到。这极可能是因为细胞壁和细胞 间隙的空间阻碍所致。 鄂棉18 的所有材料受激发子作用后均不表现上述荧光强度改变，故未列 出结果。 2 3 讨论 2 3 1c a “荧光探针的正确选择 由于化学家的努力，现在已有多种用途的c a ”荧光探针面世1 4 1 1 ，生物学 家使用c a ”荧光探针的主要目的就是探测细胞内c a 2 + 的分布和变化。例如利 用对c a 2 + 敏感的荧光探针f l u o 一3 ，可以观测到花粉管生长过程中c a 2 + 从胞内 钙库释放【45 1 ，利用水母荧光蛋白使科学家对细胞质及细胞核内c a 2 + 的分布有 了更进一步的认识1 46 ，”1 ，这在以前都是无法想象的。大量的数据表明实验过程 中荧光探针的正确选择是影响实验结果的关键步骤。 按文献”4 4 8 】观点，荧光探针的选择依据主要是1 仪器性能；2 工作目的； 3 实验体系。我们使用的是普通荧光显微镜，目的是进行细胞内荧光定性和 观察细胞内荧光的动态变化，因此应尽量选用毒性小、特异性高的探针，f l u o 3 华中科技大学硕士学位论文 与i n d o 一1 、f u r a - 2 等探针相比，它的荧光发射峰波长较长，荧光选择性强，自身无 荧光、与游离c a 2 + 结合后才发出荧光，能有效地避免非特异性染色。f l u o 一3 不需 要紫外光激发，避免了紫外光对活细胞样品的损伤，是目前最常用的细胞内 c a 2 + 测定试剂。我们在实验中也选用了f l u o 一3 作为探针。 使用任何一种探针，都需要充分认识其作用机理，这样才能正确合理分析 其探测到的结果。f l u o 3 a m 通过细胞膜进入细胞质后，荧光染料的酯化分子 乙酰甲氧基( a c e t o x y m e t h y l ，a m ) 被分解，f l u o 3 与a m 分离，而不能进入其他 膜性结构中，因此f l u o 3 只能检测细胞质内游离的c a ”水平。这也导致荧光 探针的区域化，即由于膜分隔，不同区域荧光探针浓度不同。因此实验过程中， 荧光信号的增强可能归因于c a 2 + 浓度的增加，但也有可能是不同区域荧光探针 浓度不同所导致的。此外和任何细胞荧光试剂一样，由于细胞环境引起的光漂 白现象，甚至组织的不同区域、亚细胞结构的光学特性不同都是我们在分析结 果中需要注意的。随着技术的进步，据称，利用荧光比例分析方法已经能够克 服这一问题“。 2 3 2 植物细胞荧光探针负载技术 植物细胞中荧光探针的负载困难一直是影响植物细胞c a 2 + 测定的主要技 术关键1 3 5 , 4 9 。在利用荧光显微镜测定植物细胞内