（分析化学专业论文）氨基酸、核苷酸等相关物质的液相色谱分析研究.pdf

郑州大学硕十学位论文 中文摘要 在自然界中，生物体所需能量的基本储存单元a t p ( 核菅酸) 参与了生命化学过程中 的几乎每一个反应，氨基酸是与生命起源和生命活动密切相关的蛋白质的基本组成单 位，是合成人体激素、酶和抗体的原料。它参与人体新陈代谢和各种生理活动，是生命 有机体的重要组成部分，已成为生命科学中重点研究的内容。近年来，随着色谱技术、 液质联用技术的不断发展，大大促进了对氨基酸类、核苷类物质的分离分析研究。它们 已成为生物化学、生化制药、生物工程中的重要研究对象。本文对氨基酸类、核苷类物 质进行了以下三方面的研究： 1 通过对色谱分离柱、流动相组成、检测波长、洗脱方式、离子模式等色谱条件进 行系统的考察，建立了分离分析n 磷酰化芳香族氨基酸与相应氨基酸的h p l c e s i ，m s 法，并对三种n 磷酰化芳香族氨基酸的纯度和稳定性进行了评价。 2 在前章研究基础上，建立了简单、快速、准确、重现性好的h p l c 方法，成功 用于二十种氨基酸和二十种n 磷酰化氨基酸的分离分析。二十种氨基酸和n 磷酰化氨 基酸的油水分配系数的对数与容量因子的对数呈良好的线性关系，表明该h p l c 方法可 用于磷酰化产物的油水分配系数测定，以便于对磷酰化产物的分配系数和稳定性进行评 价。 3 利用e s i m s 技术，对2 - a m p ，y - a m p ，5 - a m p 和37 5 - a p a 的m s 进行了研 究，找出了特征离子。研究建立了六个n 磷酰化氨基酸与腺苷反应体系中的单磷酸腺 苷和二腺苷单磷酸产物的h p l c e s i m s 分离分析方法，该法可以快速、简便、准确地 鉴别和定量该复杂反应体系中的痕量的z - a m p ，3 - a m p ，5 - a m p 和3 5 - a p a 。 关键词：氨基酸，n 磷酰化氨基酸，腺苷，单磷酸腺苷，二腺苷单磷酸，液相色谱， 液质联用 郑州大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nn a t u r e , n u c l e o t i d e sh a v ea l m o s tp a r t i c i p a t e di ne v e r yr e a c t i o no fl i f ec h e m i s t r y p r o c e s s i n g a m i n oa c i d sa r eb a s i cu n i t so fp r o t e i n s w h i c ha r en e a r l yc o r r e l a t e d 、i ml i f e o r i g i n t h e ya r em a t e r i a l so fs y n t h e s i z i n gh o r m o n e ，e n z y m ea n da n t i b o d y m e a n w h i l e ，a m i n o a c i d st a k ep a r ti nb o d y sm e t a b o l i s m s ，p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s t h e ya l s op l a yap i v o t a lp a r t i ns y n t h e s i z i n gp r o t e i n so fo r g a n i s ma n dh a v eb e e nas i g n i f i c a n ti n v e s t i g a t i o no b j e c t r e c e n t l y ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u e sp e o p l eh a v eb e e np a y i n g m o r ea t t e n t i o nt oa m i n oa c i d sa n dn u c l e o t i d e s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h r e ea s p e c t so nt h es t u d y o f a m i n oa c i d sa n dn u c l e o t i d e sh a v e b e e nc a r d e do u t 1 ap r a c t i c a lm e t h o dw a ss e tu pt oa n a l y z en p h o s p h o r y la r o m a t i ca m i n oa c i d sa n d t h e i rc o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i d s t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so nt h es e p a r a t i o n , s u c ha s t h e s e p a r a t i o nc o l u n m , d e t e c t i o nw a v e l e n g t h , m o b i l ep h a s em e d i u m , e l u t i o nm o d ea n di o n i z a t i o n m o d e 。h a v eb e e no p t i m i z e da n da c h i e v e d w i t l lt h i sh p l c e s i m sm e t h o d ，t h ep u r i t ya n d s t a b i l i t yo f t h r e en - p h o s p h o r y la r o m a t i ca m i n oa c i d sw e r ei n v e s t i g a t e d i 2 b a s e do nt h ep r e c e d i n gi n v e s t i g a t i o n , as i m p l e ，f a s t ，a c c u r a t ea n dr e p r o d u c i b l em e t h o d h a sb e e nd e v e l o p e df o rs e p a r a t i n go ft w e n t yn ( 0 ，0 - d i i s o p r o p y l ) p h o s p h o r y la m i n oa c i d s u s i n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h eg o o dr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e o i l w a t e rp a r t i t i o nc o e f f i c i e n t ( l o g p ) a n dc a p a c i t yf a c t o r ( l o g k 7 ) o f d i p p a f to nn h 2b o n d e d p h a s ew a so b s e r v e d ，w h i c ha se x p e c t e dc o u l db ea p p l i e dt op r e d i c tt h el o g pv a l u e so ft h e a m i n oc o m p o u n d sm o d i f i e dw i t hn ( 0 ，o - d i i s o p r o p y l ) p h o s p h i t ei nt h ef u t u r e 3 t h i sw o r kr e p o r t e dt h ef u l ls c a ne l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y 饵s i m s ) a n de s i m s m sf o rt h ef o u rn u c l e o t i d e s ( 2 - a m p , 3 - a m p , 5 - a m pa n d3 - 5 - a p a lu n d e rb o t h p o s i t i v ea n dn e g a t i v ep o l a r i t y t h e i rs p e c i f i ci o n sw e r eo b t a i n e d ，t h eo p t i m a lc h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o nf o rt h e s er e l a t i v en u c l e o t i d e sw a sa c h i e v e d , a n dt h e s ec o m p o u n d si nt h er e a c t i o n m i x t u r ew e l es u c c e s s f u l l yc h a r a c t e r i z e da n dm e a s u r e db yh p l c e s i - m s t l l i ss t u d y p r o v i d e da l la c c u r a t ea n dr e l i a b l em e t h o df o rt h er e f e r e n c eo ft h er e s e a r c ho nt h er e l a t e d r e a c t i o ns y s t e m k e y w o r d s ：a n q i n oa c i d ，n ( o ，0 一d i i s o p r o p y l ) p h o s p h o r y la m i n oa c i d ，a d e n o s i n e ，a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ，d i a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e ，h p l c ，h p l c - m s l i 郑州大学硕士学位论文 第一章氨基酸、核苷类物质的分析研究进展 在自然界中，生物体所需能量的基本储存单元a t p ( 核苷酸) 参与了生命化学 过程中的几乎每一个反应，氨基酸是与生命起源和生命活动密切相关的蛋白质的 基本组成单位，是合成人体激素、酶和抗体的原料。它参与人体新陈代谢和各种 生理活动，对动植物体内蛋白质的合成起着关键作用，是生命有机体的重要组成 部分，已成为生命科学中重点研究的对象之一。近年来，随着色谱技术、液质联 用技术的不断发展，大大促进了对氨基酸、核苷类物质的分离分析研究。它们已 成为生物化学、生化制药、生物工程中的重要研究对剔h 1 。 1 氨基酸和磷酰化氨基酸的分析研究进展 1 1 氨基酸及其分析研究进展 迄今为止，自然界中已发现1 8 0 多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸 只有2 0 多种，称为基本氨基酸或蛋白质氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式，一 种是以游离态存在于生理体液( 血浆、尿) 、食品( 酒、饮料) 中，另一种是以结合 态存在于肽和蛋白质中1 4 。组成蛋白质的2 0 种氨基酸中，异亮氨酸、亮氨酸、赖 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸，在体内不能合成，必须由 食物供给，称为必需氨酸，其余可以在机体内通过转化合成，称为非必需氨基酸。 在深入研究氨基酸作用的过程中，建立实用、快速、灵敏的分析方法具有重要的 学术意义和实际应用价值。 氨基酸含量的分析方法主要有氨基酸自动分析仪法和高效液相色谱法 ( h p l c ) 睁】。由于氨基酸自动分析仪使用范围窄、结构复杂、价格昂贵等缺点， 使其应用范围大大受到限制。而h p l c 技术则因高效、简便、快速准确、价格低 廉等优点，已在许多实验室部分或全部代替了氨基酸自动分析仪，广泛应用于多 种生物样品内氨基酸的检测。随着h p l c 的发展，使用h p l c 技术分析氨基酸也获 得了迅速发展。 1 9 5 8 年，s p a c k m a n 等1 6 j 首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生相结 合的方法分析蛋白质水解生成的氨基酸，同时提出了构建氨基酸自动分析仪的细 节，建立了传统氨基酸分析技术。c l a r k e 等 7 1 在1 9 9 9 年采用阴离子交换色谱一积分 郑州大学硕七学何论文 脉冲安培法直接对蛋白水解液中的氨基酸进行分析，成功地测定了2 2 种基本氨基 酸，检出限达至u p m o l 水平，分析结果与茚三酮法一致。其后，反相h p l c 与各种 柱前衍生相结合的氨基酸分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成了 具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。不仅使氨基酸能在传统的荧光检测器上 进行检测，也能在所有h p l c 仪器配备的紫外检测器上进行检测。a l l e n 掣8 】利用 反相分离等度洗脱法，对芳香族氨基酸进行了荧光检测。郑家概等【9 】采用柱前衍 生液相色谱一荧光法，测定了婴幼儿血浆中的部分游离氨基酸。a t k i n 等【1 川以柠檬 酸钾缓冲溶液为流动相进行淋洗，h p l c 紫外法测得了蛋白质中1 3 种重要的氨基 酸成分。唐爱国【1 1 】发展了一种不需衍生处理，等度洗脱后直接检测、快速定量血 清中苯丙氨酸与酪氨酸的h p l c 紫外分析方法。陈文掣1 2 1 在提取和纯化烟样之 后，采用在线衍生反相高效液相色谱法测定了烟样中的游离氨基酸和亚氨基酸。 曲冬梅等【l3 】则采用反相高效液相色谱一变波长紫外检测法，在1 0m i n p q 直接测定 了芳香族氨基酸。万丹晶等【1 4 1 分别用r p h p l c 法和氨基酸分析仪法测定了多维 氨基酸片中1 8 种氨基酸的含量，并对两种方法进行了比较。马嵬等【1 5 】用反相高效 液相色谱一紫外法检测了5 种原味发酵型酸奶中游离氨基酸的含量，并用十二烷基 硫酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳分析了酸奶乳清蛋白组成。 大多数氨基酸本身紫外吸收较弱，也没有荧光性质，不能直接检测。传统的 氨基酸离子交换色谱分析法，操作繁琐，成本高；目前多用的反相高效液相色谱 法，分析周期至少需要半小时以上；后来发展起来高效毛细管电泳法【1 6 - 2 0 ，虽然 有较大改进，但仍需要采用化学衍生技术及梯度洗脱以提高其分离、检测性能。 新发展起来的l c - m s m s 联用技术，结合液相色谱对复杂基体化合物的高分离能 力，充分利用三级四极质谱仪的分离和定性能力，提供了可靠、精确的相对分子 量和结构信息，显著提高了分析氨基酸的准确度、灵敏度，且操作非常简单，节 省了样品准备时间和分析时间。 孙咏梅等曾在1 9 9 7 年使用小型气质联用仪测定了血清中1 5 n 甘氨酸的丰 度值，并用代数法分析了质谱重叠碎片峰数据。徐继林等【2 2 l 建立了测定海洋微 藻中游离氨基酸的负化学电离( n c i ) 源g c m s 分析方法，为海洋微藻中游离氨基 酸的研究提供了科学依据。m a 等【2 3 】用液相色谱大气压离子化质谱f l c a p i m s ) 测定了鼠脑中的谷氨酸和y 氨基丁酸。韩俊等【矧采用电喷雾离子化质谱法对基因 郑州大学硕十学位论文 重组l 天门冬酰胺酶i i 产品进行了一级结构分析，为基因重组蛋白质药物的一级 结构分析和质量控制提供了新途径。k w o n 等1 2 5 用高效液相色谱大气压微波等离 子体离子化质谱( h p l c a p m i p i m s ) 钡i j 定了非衍生化氨基酸。q u 等郾l 用离子对 反相液相色谱同位素稀释串联质谱测定了人血液中的非衍生化氨基酸。2 0 0 3 年， 孙自勇等【2 7 】对液相色谱与电喷雾电离串联质谱仪偶联( l c e s i m s m s ) 技术分析 蛋白质序列的方法进行了综述，并以尿激酶原的一个酶解片段的l c e s l m s m s 图谱为例，报告了人工排列多肽氨基酸序列的方法。曹书霞等网采用电喷雾一离 子阱质谱技术，对水溶液中氨基酸分子之间以及和溶液中金属离子之间的相互作 用进行了系统的研究。g e o r g 等t 2 9 1 用h p l c m s m s 在1 5 m i l l 内成功分离鉴定了植 物组织中的1 9 种游离氨基酸，大大缩短了分析时间。近来，李慧等【3 0 1 建立了测定 大鼠脑海马组织中氨基酸类神经递质的高效液相色谱一质谱一质谱( l c m s m s ) 分 析方法。王一红等【3 1 j 在无衍生处理条件下，直接对1 8 种氨基酸进行了反相液相色 谱分离和质谱检测，该法适合测定各种样品中的游离氨基酸。杨英等1 3 2 1 用胰蛋白 酶酶解r h l l 1 1 ，采用h p l c 测定肽图，用电喷雾一四极杆一飞行时间质谱 ( e s i q t o f m s ) 技术分析了肽段的精确相对分子质量，并通过串联质谱( m s m s ) 测定了肽段的氨基酸序列。 1 2 磷酰化氨基酸及其分析研究进展 在生命化学中，磷具有重要地位。目前，在生命过程中还未发现不含磷的生 命体。在人体中磷的含量大约占元素总量的1 ，占d n a 分子量的9 3 3 1 。生物 体所需能量的基本储存单元a t p 在参与生命化学过程中的每个反应时，其新陈 代谢过程也是常以含磷衍生物为中间体而进行的。氨基酸则是与生命起源和生命 活动密切相关的蛋白质的基本组成单位，是合成人体激素、酶和抗体的原料，参 与人体新陈代谢和各种生理活动，在生命中显示特殊作用。几乎所有的细胞活动 皆是靠蛋白可逆磷酰化来调控的【3 4 】。 以往的生命起源学说都是以蛋白质为中心的。5 0 年代初，d n a 双螺旋模型 及蛋白质合成遗传控制的中心法则的发现，从根本上改变了生命起源的观念。然 而，在前生命的化学进化中，先有核酸还是先有蛋白质仍然是悬而未决的问题。 正是考虑到氨基酸是前生命化学进化中的关键分子，而磷对现存生命活动调控起 中心作用，故此，把磷和氨基酸的有机结合物一磷酰化氨基酸作为研究对象。磷 郑州大学硕七学位论文 酰化- 氨基酸系统具有自催化、自组装的功能，它提供了一个能把蛋白质合成 和核酸合成这两个过程偶联起来的最小分子模型。对该系统的深入研究将总结出 磷与氨基酸及糖、核苷之间的相互作用的基本规律，进而揭示核酸和蛋白质之问 相互作用的机制【35 1 。 a t h e r t o n 及t o d d 等人在1 9 4 5 年发现- f a t h e r t o n - t o d d 反应【3 6 , y q ，使得合成磷酰 胺及其酯类衍生物得到了快速发展。赵玉芬教授领导研究小组不断地改进和发展 了a t h e r t o n - t o d d 反应，并把该反应扩展到水相，使氨基酸与二烷基亚磷酸酯在水、 醇、四氯化碳和三乙胺存在下直接反应，对氨基酸成功地进行了磷酰化改造【3 8 1 。 用磷酰基作为氨基保护基，创立了氨基酸及小肽的直接磷酰化的方法。稳定的 氨基酸在n 磷酰化后性质变得异常活泼，可进行自身成肽 3 9 - 4 6 1 、成酯m - 4 9 1 、磷 上酯交换5 3 1 、磷酰基的n o 迁移等反应f 5 4 ，5 5 1 。研究组在实验过程中还发现， n - 磷酰化氨基酸能够在没有任何其它催化剂、脱水剂和能量给体( 如a t p ) 的情况 下，与核苷反应生成核苷酸寡核苷酸( 在无水吡中) 【5 6 , 5 7 1 ，这与生命体中酶催化条 件下的蛋白质的合成以及酸碱催化的人工合成截然不同【5 8 1 。因而，n 磷酰化氨 基酸被认为是生命起源过程中核酸、蛋白质共同起源的最小模型【5 9 , 6 0 1 。进一步研 究水溶液中n 磷酰化氨基酸成肽、成核苷酸的反应及其二者之间的相互关系，不 仅可为核酸、蛋白质共同起源的学说提供更有力的实验证据，而且对于研究生命 起源过程中基于蛋白质和核苷的相互作用的原始遗传密码的起源，探索新的多肽 和寡核苷酸的化学合成途径 6 1 - 6 7 ，都具有十分重要的意义。 此外，质谱方法研究表明，磷酰化氨基酸具有明显的质谱增敏效应，能显著 提高质谱信号的灵敏度等；n 磷酰化氨基酸除了具有多种化学性质之外，还具有 广泛的生物活性，具有一定的生物学意义。单个的磷酰化氨基酸也具有很重要的 药理和生理功能。如：n 磷酰化天冬氨酸及盐用来治疗神经衰弱和体虚；n 磷酰 化组氨酸和n 一磷酰化赖氨酸及赫有防衰强心的功效；n 磷酰氨基酸对胰蛋白酶具 有一定的抑制活性，并且，其抑制效果随着氨基酸种类的不同而不同；部分n - 磷酰氨基酸( 磷酰化组氨酸、磷酰化半胱氨酸等) 对r n a 和d n a 有切割作用，在此 基础上可望将其发展成为一种人工酶【6 ”。总之，n 磷酰化氨基酸研究既有很大 的理论意义，同时在免疫、医药、农药、保健、化妆品、生物技术等领域有着广 阔的应用前景，建立快速有效的磷酰化氨基酸分析方法具有重要的实际应用价 郑州大学硕士学位论文 值。 目前，磷酰化氨基酸的分析方法主要有核磁法( n m r ) 、光谱法、质谱法和液 相色谱质谱法。冯玉萍等 6 9 1 在1 9 9 4 年用1 3 c ，3 1 p 核磁谱分析了稀土离子d l a 等) 与n 二异丙氧基磷酰基甘氨酸( d i p p - g l y ) 、甘氨酸( g l y ) 的络合作用，以了解氨 基酸磷酰化后产生的变化与影响。万明球等( 7 0 l 应用拉曼光谱，研究了磷酰化氨基 酸对人红细胞膜的作用。周义东等【7 l 】利用n d ：y a g 激光器激发固体纯磷酞化芳香 族氨基酸样品，发现取代基的导入使芳香环荧光峰红移，而对磷酰基的荧光峰的 影响则为紫移。1 9 9 7 年，胡鑫尧等7 2 1 通过傅里叶变换红外光谱( f t i r ) 技术研究证 明了磷酰化氨基酸可以自聚成肽。同时，韩立群掣7 3 1 也用偏振c a r s 法研究了五 种氮磷酰化氨基酸的自聚成肽反应，和肽键的振动谱特性。尹应武等 7 4 , 7 5 用快 原子轰击质谱( f - a 3 一m s ) 鉴定了二十种混合氨基酸，并对n 一磷酰化氨基酸的水解 反应和伴随的去磷酰化反应特性进行了机理探讨。王宗义等 7 6 】用液相色谱电喷 雾离子化质谱( l c e s i m s ) 法分离鉴定了碘化酪蛋白水解产物中的碘化氨基酸。 赵玉芬等【7 刀以亚磷酸二异丙酯为磷酰化试剂j c r j - 2 0 种常见的静氨基酸进行了磷酰 化，用核磁共振谱、红外光谱和质谱鉴定分析了所得产物的结构及其谱图特征规 律。陈忠周等利用葡聚糖凝胶柱分离，用电喷雾二级质谱( e s i m s m s ) 对n 磷 酰化氨基酸在没有缩合试剂的水溶液中与氨基酸成肽反应的产物进行了鉴定和 分析。曹书霞等 7 9 - 8 1 1 曾用液相色谱质谱联用分离鉴定了小肽混合物，随后又用 电喷雾离子阱多级质谱对b 环糊精和n 二异丙氧基磷酰化氨基酸的相互作用以 及n 一苯乙氧基磷酰化氨基酸的裂解规律进行了探讨。 2 核苷和核苷酸分析研究进展 核苷是核糖或脱氧核糖与嘌呤碱或嘧啶碱生成的糖苷。核苷类是核酸的重要 组成部分，它是嘧啶或嘌呤的核糖或2 去氧核糖的苷，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷 等( 如图1 1 ) 。作为生命活动的必需物质，核苷不仅与机体的能量代谢及酶的生物 活性等有关，而且是细胞合成d n a 和r n a 的原料，并可以调控蛋白质表达与细 胞的分裂增殖。如：恶性肿瘤细胞在细胞快速增殖时需要摄取大量核苷，以满足 合成d n a 和r n a 的需要，利用核昔类衍生物干扰肿瘤细胞d n a 和r n a 合成，可 以达到阻碍癌细胞扩散以治疗癌症的目的【8 2 1 。 郑州大学硕士学位论文 h 0 h 0 n h 2 h 0 胞苷 乌苷 屎苷 腺嘌呤 图1 1 五种核昔的结构 核苷中核糖和脱氧核糖的一个羟基被磷酸基酯化后就即得到核苷酸。核苷酸 是组成生命的核酸大分子的基本结构单位，是一类在代谢上极为重要的生命物 质，同时还是d n a 和r n a 的前体以及它们的分解产物，它几乎参与细胞的所有 代谢过程。所以，它是一切生物有机体不可缺少的组成部分，是生命遗传信息的 携带者和传递者，不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、 细胞分化等起着重要作用，而且对于生物异变也有重要作用。有些核苷类物质也 是l 临床上常见的抗癌药物，可用于多种癌症的治疗8 3 1 。因此，对核苷及核苷酸的 研究不仅对工业、农业、医学等领域有着广泛影响，而且对加快揭示生命奥秘的 进程、完善基因工程技术有着深刻的意义。在深入开展核苷及核苷酸的研究中， 建立快速的分析方法十分必要。 核苷及核苷酸的分离分析已成为人们关注的研究方向，研究对象非常广泛， 涉及细胞 8 4 1 、矿物质【8 5 1 、食品【8 6 1 、血浆( s 7 1 等领域。分析研究核苷酸的方法有： 光谱法 8 8 , 8 9 、质谱法【蛐】、色谱法【9 0 0 1 、电泳法 1 0 1 - 1 1 3 l 等。 自c o h n 在1 9 4 9 年发表了用离子交换色谱成功实现了核苷的分离之后， h o r v a t h 的课题组也分别于1 9 6 7 年和1 9 6 9 年报告了用高效液相色谱法( h p l c ) 分离 了核苷和碱基f 1 14 1 。2 0 0 0 年，b r i a n 等 1 1 5 】以蒸发光散射检测器( e l s d ) 为离子交换 一 丫一 斟 洲o e 郑州大学硕士学位论文 色谱检测器，解决了核苷酸h p l c 分析中的基线漂移问题。廖飞等 1 1 6 采用 s h i m p a kw a x i 柱，3 0m m o l l 的p h4 0 磷酸钾溶液为流动相，离子变换h p l c 法 分析了环核苷酸磷酸二酯酶反应体系。黄晓兰等7 1 利用二极管矩阵紫外检测器， 反相高效液相色谱法同时对1 5 种核酸水解产物进行了辅助定性及峰纯度鉴定，并 将此方法应用于测定酵母抽提物中的核苷酸，取得了满意的结果。李家胜等1 1 1 8 1 用h p l c 梯度洗脱法测定鸡肉中核菅酸及其降解物。刘海静等0 1 0 等用h p l c 法对 卡介苗素中游离核苷酸进行分离及含量测定。霍小敏等n 2 0 】采用反相高效液相色 谱法( r p h p l c ) ，很好地分离了酵母r n a 降解的4 种核苷酸。王向红等1 2 1 建立了 同时测定枣果中环磷酸腺苷( c a m p ) 和环磷酸鸟苷( c g m p ) 的反相高效液相色谱分 析方法。徐骁等【1 2 2 也用r p h p l c 法测定了环腺苷酸( c a m p ) 和环鸟苷酸( c g m p ) 的含量，并确认了犬气管平滑肌组织中环核苷酸磷酸二酯酶( p d e ) 活性的存在。 韩伟等1 1 2 3 1 探讨了变性高效液相色谱分析法( d h p l c ) 在基因组研究中的效 能，检测了白种入和汉族人r d h 8 基因序列中单核苷酸多态性( s n p ) 位点。李杰等 t z 4 1 采用s p h e f i g e l c 1 8 色谱柱，以含0 5 乙腈的0 0 2m o l lk h 2 p 0 4 缓冲液为流动 相，高效液相色谱一紫外检测了血清中假尿嘧啶核苷。赵筱萍等【1 2 5 1 用1 2m o l f l h c l 0 4 沉淀蛋白，苯硼酸柱进行固相萃取富集样品中的核苷酸，建立了测定k 5 6 2 及k 5 6 2 a 细胞内核苷类代谢物含量的高效液相色谱法。近年来，将高效液相色 谱法用于不同来源虫草及其发酵品中多种核苷、碱基的研究越来越多 1 撕1 2 舶，对 全面评估虫草制品的质量有重要意义。 张运涛等【1 2 9 1 利用液一质联用技术( l c e s i m s ) 对啤酒酵母甘露聚糖乙酰解产 物进行分析。邹耀洪等 1 3 0 采用高效液相色谱一质谱( l c m s ) 联用法，复合定性了 蘑菇柄中的5 鸟苷酸和其它5 i 核苷酸。k a m e l 等 1 3 1 1 用h p l c e s i m s 技术分离 鉴定了四种核苷类抗病毒药物。x u 等 1 3 2 用h p l c 仍a d e s i m s 方法分离鉴定了 抗癌药物c a p e c i t a b i n e 及其核菅代谢物。2 0 0 4 年，d r i e s s c h e 等1 1 3 3 用微型化的 l c e s i m s m s 分离分析了m e l p h a l a n 修饰的寡聚脱氧核苷酸。z h a o 等【l ”1 进行 了血清中5 - a z a c y t i d i n e 的分离鉴定，并进行了药代动力学研究，获得了重要的 动力学参数。最近，h a i n k 等 1 3 5 用液相色谱法在4m i n 成功实现了9 种核苷酸 快速分离分析。 郑育芳等1 1 3 6 1 以十二炕基磺酸钠( s d s ) 一十水合四硼酸钠一磷酸二氢钠为缓冲 郑州大学硕士学位论文 液( p h6 9 6 ) ，通过苯基硼酸亲和色谱柱对尿中核苷进行纯化，用胶束电动力学毛 细管色谱法测定了尿中核苷。贾丽等 1 3 7 1 建立了一种用于同时测定5 种核苷酸毛细 管区带电泳法。孙迎节等【1 3 8 】采用毛细管区带电泳法分离测定了虫草素和腺苷， 首次报道了九州虫草中虫草素的存在。阮婧华等 1 3 9 探讨了用不同溶剂提取天然 冬虫夏草的效果及毛细管电泳法测定其中核苷及其碱基含量的可行性。汪宇等 1 4 0 i 也用高效毛细管电泳测定法比较了天然蛹虫草及其培养物中核苷类化合物的 含量。周文峰等【1 4 ”报道7 5 种5 ，- 核苷酸的毛细管区带电泳分离，讨论7 p h 、缓 冲溶液浓度及分离电压对分离的影响，5 种主要呈味核苷酸及其近似物在1 0r a i n 内实现了基线分离。陈英杰等【1 4 2 1 应用毛细管电泳法分别对3 5 名健康成人及3 2 名 恶性肿瘤患者尿中1 3 种核苷进行了检测，可用于恶性肿瘤的辅助诊断。c a h o u r s 等b 4 3 1 采用毛细管电泳一质谱联用法( c e m s ) 分离检测了一种p p b 级的抗h i v 核苷 类药物，该法灵敏、快速，还可用于两种或两种以上核苷的同时检测。 参考文献 【1 b h u s h a nr ，b r u c k n e rh m a r f e y sr e a g e n tf o rc h i r a la m i n oa c i da n a l y s i s ：ar e v i e w a m i n oa c i d ，2 0 0 4 ，2 7 ( 3 - 4 ) ：2 3 1 - 2 4 7 2 h u s e kp ，s i m e k p a d v a n c e si na m i n oa c i d a n a l y s i s l c g c n o r t h a m e r i c a , 2 0 0 1 ，1 9 ( 9 ) ：9 8 6 9 9 9 【3 p o i n s o tv ，b a y l ec ，c o u d e r cf r e c e n ta d v a n c e si na m i n oa c i da n a l y s i sb y c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 3 ，2 4 ( 2 2 2 3 ) ：4 0 4 7 - 4 0 6 2 【4 】于泓，牟世芬氨基酸分析方法的研究进展分析化学，2 0 0 5 ，3 3 ( 3 ) ：3 9 8 - 4 0 4 【5 】吕艳，冯凤琴反相高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成浙江农业科 学，2 0 0 6 ，( 2 ) ：2 l1 - 2 1 4 f 6 s p a c k m a ndh ，s t e i nwh ，m o o r es a u t o m a t i cr e c o r d i n ga p p a r a t u sf o ru s e i nt h e c h r o m a t o g r a p h yo f a m i n oa c i d s a n a l c h c m ，1 9 5 8 ，3 0 ( 7 ) ：11 9 0 1 2 0 5 7 c l a r k eap ，ja n d i kp ，r o e k l i nrd ，l i uy ，a v d a l o v i cn a ni n t e g r a t e d a m p e r o m e t r yw a v e f o r n lf o rt h ed i r e c t , s e n s i t i v ed e t e c t i o no f a m i n oa c i d sa n da m i n o s u g a r sf o l l o w i n ga n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n a l c h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ( 1 4 ) ：2 7 7 4 2 7 8 1 【8 a l l e nkr ，d e g gtj ，r u s h w o r t hp a ，e ta 1 m e a s u r e m e n to fp h e n y l a l a n i n ea n d r 郑州大学硕+ 学位论文 t y r o s i n e i np l a s m ab yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gt h ei n h e r e n t f l u r o s c e n c eo f a r o m a t i ca m i n oa c i d s j a n n c l i n b i o c h e m ，1 9 9 9 ，3 6 ( 2 ) ：2 0 7 2 11 9 1 郑家概，牟德海，马丽果等血浆中游离氨基酸的高效液相色谱分析食品研究 与开发，2 0 0 4 ，2 5 ( 5 ) ：1 3 2 1 3 4 【1 0 a t l c i nge ，f e r d i n a n dw a c c e l e r a t e da m i n oa c i da n a l y s i sw i t hl i t h i u mc i t r a t e b u f f e r s e f f e c to fr e s i ne r o s s l i n k a g eo ne l u t i o np a t t e r n sa n dt h ea v o i d a n c eo f m i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o no fc o l u m n s j o u r n a l o f c h r o m a t o g r a p h y ，1 9 7 1 ，6 2 ( 3 ) ：3 7 3 3 8 1 【l l 】唐爱国高效液相色谱法快速直接测定血清苯丙氨酸与酪氨酸【j 】湖南医科 大学学报，2 0 0 0 ，2 5 ( 2 ) ：2 0 9 - 2 1 2 【1 2 】陈文，王光辉，李丹等反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸氨基 酸和生物资源，2 0 0 2 ，2 4 ( 1 ) ：5 4 - 5 6 【1 3 】曲冬梅，弓爱君，高鹤永等反相高效液相色谱法直接检测芳香族氨基酸氨 基酸和生物资源，2 0 0 4 。2 6 ( 1 ) ：7 1 7 3 【1 4 】万丹晶，陈妙芬，翟咏虹用h p l c 法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中1 8 种氨基酸药学服务与研究，2 0 0 6 ，6 ( 3 ) ：2 1 2 - 2 1 4 【1 5 】马嵬，金素钰，郑玉才酸奶中游离氨基酸含量及乳清蛋白组成分析中国乳 品工业，2 0 0 6 ，3 4 ( 6 ) ：2 0 2 2 【1 6 】沈佐君，吴琳高效毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸 j 】中华医学检 验杂志，1 9 9 8 ，2 1 ( 3 ) ：1 - 6 【1 7 】周琼，陈绩光，莫金垣等毛细管电泳在氨基酸分析中应用的进展现代医学 仪器与应用，2 0 0 2 ，1 4 ( 1 ) ：9 1 l 1 8 】陈九武，王志强毛细管电泳在氨基酸分析检测中的应用进展氨基酸和生 物资源，2 0 0 4 ，2 6 ( 3 ) ：6 5 - 6 9 【1 9 】赵书林，沈江珊单细胞中d 一天冬氨酸和d 一谷氨酸的毛细管电泳分析高等学 校化学学报，2 0 0 5 ，2 6 ( 9 ) ：1 6 1 3 1 6 1 7 2 0 1 程燕，白敏，石运伟等手性氨基酸的毛细管电泳拆分研究。分析测试学 报，2 0 0 6 ，2 5 ( 2 ) ：5 2 5 【2 l 】孙咏梅，张林，许志勤等气质联用分离测定1 5 n 甘氨酸方法的研究营养学 郑州大学硕士学位论文 报，1 9 9 7 ，1 9 ( 2 ) ：2 0 2 0 2 0 6 2 2 1 徐继林，叶芳挺，严小军海洋微藻中游离氨基酸的n c i 源g c m s 分析药物分 析杂志，2 0 0 6 ，2 6 ( 8 ) ：1 1 2 8 1 1 3 1 2 3 m ad ，z h a n gj s n g a h a r ake t a 1 s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f g a m m a - a m i n o b u t y r i ca c i da n dg l u t a m i ca c i di nt h eb r a i no f 3 m e r c a p t o p r o p i o u i c a c i d - t r e a t e dr a t su s i n gl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a t m o s p h e r i c p r e s s u r ec h e m i c a l i o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y j c h r o m a t o g r b ，1 9 9 9 ，7 2 6 ( 1 2 ) ：2 8 5 2 9 0 2 4 】韩俊，盛龙生，杨仲元等重组l 一天门冬酰胺酶i i 的液相色谱电喷雾离子化质 谱法分析药学学报，2 0 0 1 ，3 6 ( 1 ) ：4 6 5 0 【2 5 k w o njy ，m o i n im a n a l y s i so fu n d e r i v a t i z e da m i n oa c i dm i x t u r e su s i n gh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y d u a lo s c i l l a t i n gn e b u l i z e ra t m o s p h e r i c p r e s s u r e m i c r o w a v ei n d u c e dp l a s m ai o n i z a t i o n - m a s ss p e c t r o m e t r y j a m s o c m a s ss p e e t r o m ，2 0 0 1 ，1 2 ( 1 ) ：11 7 1 2 2 2 6 q uj ，w a n gym ，l u oga ，e ta 1 v a l i d a t e dq u a n t i t a t i o no fu n d e r i v a t i z e da m i n o a c i d si nh u m a nb l o o ds a m p l e sb yv o l a t i l e i o n - p a i rr e v e r s e d - p h a s el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dt oi s o t o p ed i l u t i o nt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，7 4 ( 9 ) ：2 0 3 4 2 0 4 0 【2 7 1 孙自勇，吴盛，王石泉等液相色谱与串联质谱偶联在蛋白质序列分析中的应 用基础医学与临床，2 0 0 3 ，2 3 ( 2 ) ：1 2 6 1 3 1 【2 8 1 曹书霞，杨晓丽，陈晓岚等氨基酸复合物的电喷雾质谱研究分析测试学报， 2 0 0 4 ，2 3 ( 3 ) ：6 4 - 6 5 2 9 g e o r gj ，s u s a