（材料学专业论文）跨血脑屏障磁性复合功能超微载体的研究.pdf

摘要 通过赖氨酸对壳聚糖进行修饰，增加了壳聚糖的氨基含量，改善了中性条件 下的水溶性，对不同制备工艺条件下所制备的赖氨酸修饰壳聚糖进行了讨论，得 出了赖氨酸修饰壳聚糖的最优条件：搅拌速度为1 2 0 0r p m 、温度为2 0 、油水 相比为1 、反应时间为6h 。通过对产物的溶解度、红外吸收光谱和核磁共振波 谱测试，验证了赖氨酸化学键合于壳聚糖之上，并得出产物的溶解度为0 4 8g ， 赖氨酸的取代度为3 2 7 8 。 以制备的赖氨酸修饰壳聚糖为壳层材料，以四氧化三铁为核，用共沉淀法制 备了磁性超微载体。透射电子显微镜和激光粒度仪分析表明载体粒子表面光滑， 粒径分布均匀，为1 0 0 n m 左右；v s m 磁性能分析仪和z e t a 电位仪测试表明载 体粒子具有良好的超顺磁性和较高正电性。然后将跨膜肽t a t 和叶酸( f o l a t e ) 连接到赖氨酸修饰壳聚糖超微磁性载体粒子表面，形成具有跨膜和磁性及受体介 导复合靶向功能的超微磁性载体粒子( t a l - f a - l c m n p s ) ，采用紫外分光光度计 对构成复合功能载体系统的各组分进行了定量分析，证实了该复合功能超微载体 ，系统的成功构建。 ， 在此基础上，将制备的四种磁性载体粒子：赖氨酸修饰壳聚糖超微载体 ( l c m n p s ) 、叶酸介导赖氨酸修饰壳聚糖超微载体( f a l c m n p s ) 、具有t a t 跨膜功能的赖氨酸修饰壳聚糖超微载体( 吖小l 歪n p s ) 和具有复合靶向功能的 超微载体( 吖山f a l c m n p s ) 通过琼脂糖凝胶电泳，分别确定其与d n a 的复合 情况。然后以9 咖t c 放射性标记不同载体粒子，对s d 大鼠尾静脉和颈动脉分别进 行注射，单光子发射型计算机断层显像仪( s p e c t ) 检测，考察不同载体粒子携带 质粒d n a 通过大鼠血脑屏障的情况，并通过不同组别、不同给药方式、不同磁 场作用时间及阴性对照组( 放射性元素咖t c 颈动脉注射) 的对比确定了最优化治 疗方法。结果显示，颈动脉给药、磁场作用于大鼠头部3 0 m i n 时， d n a 口瓜f a - l c m n p s 具有最好的跨血脑屏障效果。 关键词：壳聚糖衍生物磁靶向跨膜肽叶酸血脑屏障基因载体 a b s t r a c t l y s i n ec h e m i c a l l ym o d i f i e dc h i t o a nw i t hg o o dw a t e rs o l u b i l i t yw a ss y n t h e s i z e d i n t h i s p a p e r , a n dt h e c o o r d i n a t i o nc o n d i t i o n s ( s t i r r i n gr a t e 、t h er e a c t i o nt i m e 、 t e m p e r a t i o n 、d m f h 2 0 ) w e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a ls w e l l e np a r a m e t e r sw e r ei p 1 2 0 0r p m 、t = 2 0 、d m f h 2 0 = i 、仁6h 。i t sc o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r ew a s c h a r a c t e r i z e db yf t - i r 、1 h - n m ra n d1 c - n m ra n dt h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o nw a s 3 2 7 8 w h i c hw a sc a l c u l a t e db y1 h - n m r t h e nt h el y s i n em o d i f i e dc h i t o s a nw a su s e da sm a t r i xt op r e p a r em a g n e t i c m i c r o s p h e r e su s i n gc o - p r e c i p i t a t i o nm e t h o d t h em i c r o s p h e r e sw e r ea n a l y s i s e db y x p s ，t e m ，x r d ，v s ma n dz e t ap o t e n t i a la n a l y z e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p a r t i c l e s w e r es p h e r i c a la n du n i f o r mi nd i m e n s i o nw i t hp a r t i c l ed i a m e t r e r so f 10 0 n m ，a n dh a dg o o ds u p e r m a g n e t i cc h a r a c t e r i z a t i o n ，m e ya l s oh a dm a n yp o s i t i v e c h a r g eo nt h e i rs u r f a c e w ec o u p l e dt a ta n df o l a t eo nt h es u r f a c eo fl y s i n em o d i f i e dc h i t o s a nm a g n e t i c m i c r o p h e r e s t of o r mt a tm e d i a t e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sh a v i n gc o m p o s i t e t a r g e t i n gf u n c t i o n a n d a l lo ft h e c o m p o n e n t s o ft h et a t - f a - l c m n p sw a s q u a n t i t i v e l yi n v e s t i g a t e db yu vr e s p e c t i v e l y a d d i t i o n a l l y , c o m b i n a t i o no f d n a a n df o u rk i n d so f m n p sw a so b s e r v e df r o m a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s u g g e s t i n gt h a tt h el c m n p sc o u l db ean o v e lk i n do f m a g n e t i ct a r g e t i n gg e n ec a r r i e r s t h eb i o d i s t r i b u t i o na n dt h ea b i l i t yf o rc r o s s i n gb b b o f9 9 t c 1 a b e l e dm n p sa n dd n a c o m p l e x e s w e r ef u r t h e ri n v e s t i g a t e db ys i n g l ep h o t o n e m i s s i o nc o m p u t e dt o m o g r a p h y ( s p e c t ) t h er e s u l t ss h o w e dt a t - f a - l c m n p sa n d d n a c o m p l e x e ss u c c e s s f u l l yp a s s e dt h eb l o o d - b r a i nb a r r i e ru n d e rt h em a g n e t i cf i e l d f o r3 0 m i na f t e rb e i n gi i l j e c t e dt h r o u g ht h ec a r o t i d k e yw o r d s ：c h i t o s a nd e r i v a t i v e s ，m a g n e t i ct a r g e t i n g ，t a t , f o l a t e b l o o db r a i n 。b a r r i e r ，g e n ev e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丕盗基堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者盛名：夕争识手臼签字日期：幻7 年7 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨盔盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：夕争讼辜巨j 导师签名： 签字日期：力力7 年z 月2 同 瑶己泰 l f 签字日期：力卢7 年。月日 ， 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论弟一早三：酉了匕 基因治疗是将人类的正常基因或有治疗作用的外源目的基因，通过一定的基 因转运系统导入人体靶细胞或直接注入人体，表达具有功能的蛋白质，以补充、 纠正基因的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。自从1 9 9 0 年美国国立卫生研究院和 其下属重组d n a 顾问委员会批准了美国第一例临床基因治疗申请以来，基因治 疗对象已从单基因遗传病扩展到多基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病以及艾滋 病等感染性疾病【。目前，全球已有1 0 2 0 种基因治疗方案用于临床，其方法有直 接体内疗法和间接体内疗法。前者是指将外源基因装配于特定的真核细胞表达载 体，直接导入体内；后者是指将治疗基因连接至载体并在体外导入受体细胞，筛 选转化细胞扩增后回输体内。随着人类基因组研究的迅速进展，人们对生命基因 基础的认识将达到一个新的水平，一旦基因治疗在临床上实现，将改变医药界的 面貌，开创基因作为药物的新纪元，对医药工业产生深远的影响【2 】。 目前基因治疗所面临的最大挑战是：首先要使质粒d n a 分布于特定的细胞， 再使d n a 到达特定的细胞器一细胞核内，最后还要使其插入特定的d n a 位点。 利用纳米技术，可使d n a 通过主动靶向作用定位于细胞，将质粒d n a 浓缩至5 0 2 0 0 r i m 大小且带上负电荷，有助于其对细胞核的有效入侵，而最后质粒d n a 插入 细胞核d n a 的准确位点则取决于纳米粒子的大小和结构。裸露的外源基因d n a 难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，因而难以表达，所以需要有一载体，携 带基因进入细胞并使其不易被降解，使基因表达提高。 基因治疗要取得突破，必须解决三个关键问题：即基因导入系统、基因表达 的可控性以及更多更好的治疗基因。 1 、高效的靶向性基因导入系统 基因治疗的首要问题是将治疗基因输送到并进入特定的靶细胞，从而使其在 该细胞中得到高效表达，这对于恶性肿瘤治疗尤为重要。如果一个治疗基因不能 导入到大多数肿瘤细胞，至少要求它尽可能不进入或较少进入正常细胞。 2 、外源基因表达的可控性 这是目前基因治疗中十分关键的问题。在可预见的未来，许多基因可以在人 体中表达。但如果这些基因导入后表达处于无调控状态，将会造成严重的后果。 因此，基因导入后，在体内的可调控性或可诱导性将成为关键。最理想的可控性 第一章绪论 是模拟人体内基因本身的调控形式。这是今后长期的追求目标，但是难度极大， 一是需要全基因或包括上下游的调控区及内含子，二是一个长片段进入细胞及其 整合，涉及整合的位点。最终的理想是实现定点插入。 3 、治疗基因的多种类性 目前，在已用于临床的治疗基因仅集中于少数基因。尤其是，对极大部分多 基因疾病，如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病的致病基因 还有待阐明。这将有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。这不仅 限于这些致病基因的发现，同时包括已知和目前尚未知功能的表达调控序列的确 定，以及其相互作用规律的阐吲3 1 。可以预期，2 l 世纪在以上方面将会有十分重 要的进展和突破。 随着人类基因组计划的初步完成，分子病毒学和材料学的发展，在原有以病 毒载体为主的基础上，新型基因治疗载体不断出现。 1 2 基因治疗载体 基因治疗的载体分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。 1 2 1 病毒性载体 病毒是天然的基因转运系统，病毒在感染宿主时，病毒的核酸能够进入哺乳 动物细胞并在细胞内进行复制、转录和翻译，生成子代病毒野生型病毒株可经过 修饰去除致病基因而保留其感染和复制能力，构建能够携带外源目的基因的载 体。病毒性载体有：反转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒 相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、脊髓 灰质炎病毒载体和杂交病毒载体。目前临床试验中最常用的是反转录病毒载体， 其次为腺病毒载体1 4 5 】。这些病毒载体转染率高，但作为一种改造的病毒，其价 格昂贵，容易引发机体强烈的免疫反应并可能致癌，其安全性还不高，临床应用 还很困难。 1 2 2 非病毒载体 非病毒载体是病毒载体的重要补充途径，尽管转染效率低，但由于免疫原性 低、安全性高引起广泛关注。 非病毒载体主要有阳离子脂质体载体，阳离子多聚物以及复合载体等。 ( 1 ) 阳离子脂质体载体 2 第一章绪论 阳离子脂质体是一种单一的阳离子两亲性化合物，或更为普遍的是正离子类 脂分子c y t o f e c t i n 和中性脂质体的混合物。它们控制核酸转移的原理为：带正电的 问题。尽管阳离子脂质体在某些方面要优 于病毒型基因载体，如低的免疫原性、易 3 第一章绪论 复合物的尺寸和尺寸分布随着p l l 相对分子质量的增大而增大 1 0 j h 。 由于外源基因进入核内所需要的核定信号序列中含有较多的碱性氨基酸， 因此多聚赖氨酸可能参与核定位过程，而使p l l - d n a 复合物的转染效率比其它 阳离子多聚物基因复合物的高。然而由于p l l 较低的转染效率和较高的细胞毒 性，需要对p l l 进行改性，使其成为亲水性、生物相容性并具有靶向性的高分子 材料从而提高它的转染效率，降低毒性。因此可以通过改变聚合物的物理化学及 生物性能来调节其作为基因载体的转运性能。 靶向化p l l 可以将其乳糖化，如在研究中发现脂质体或乳糖化多聚赖氨酸包 埋的重组表达质粒经腹腔途径导入人体内后，均以肝脏为主要分布器官，而糖化 多聚赖氨酸的肝脏靶向导入作用优于脂质体。也可以将完整的e g f 或合成的 e g f c 环肽段与对d n a 有结合力的多聚赖氨酸极性化学偶联来作为d n a 转移载 体，起到靶向性作用。 树枝状多聚物 树枝状高分子是二类新型高分子聚合物，表面正电荷密度高，导致荷载d n a 的浓缩，其静电效应可能受直径及其分子量大小的影响。树状高分子因其表面氨 基而具有极强的缓冲力，可作为弱碱基对抗溶酶体酸化作用，加速d n a 或复合 物的释放，从而提高基因转染效率， 树状高分子复合物的进入核能力随不同细胞类型而有所不同。最近，有研究 发现树状高分子介导基因入胞核时，部分树状高分子与d n a 复合物并未发生分 离，因此推测其所介导的进入核过程也可以是以树状高分子d n a 复合物的形式 进行的。树状高分子在能有效介导d n a 转染的浓度水平下未显示出细胞毒性作 用，对树状高分子在体内和体外细胞毒性研究表明，树状高分子表现出浓度及大 小依赖的毒性，其分子和浓度越大，细胞毒性越强。 树状高分子在有血清存在时仍保持较高的转染活性，且在干燥后仍保有转染 能力。这对皮肤细胞的转染提供了体内体外的技术支持。此外，树状高分子在体 内的作用特性也有初步研究报道。不同途径导入也会影响复合物靶向细胞的特异 性及转染效率 1 2 , 1 3 。 s i 0 2 目前己有一系列关于无机硅壳类纳米颗粒的研究报道。李杜等研究表明以无 机二氧化硅为外壳制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性，对细胞的生长和代谢 没有明显的影响；何晓晓等将氨基化后s i 0 2 颗粒用于转染，将质粒d n a ( p i r g f p ) 导入c o s 一7 细胞系，并实现了其在细胞内的高水平表达。研究者认为：一是这 种纳米颗粒复合物易与细胞膜融合而被受体细胞高效率吞噬；二是这种复合物对 d n a 的结合能力很强：三是这种复合物的形成对d n a 有保护作用，可免受d n a s e 4 第一章绪论 i 降解。k n e u c e r 等发现在硅胶表面进行阳离子共价修饰后，将表达半乳糖苷酶的 质粒固定于硅纳米微粒后，有效地转染了c o s 一1 细胞l u od 等用致密的硅纳米 粒子把d n a 载体复合物以单分子层浓缩于细胞表面提高转染率8 5 倍。 无机纳米颗粒基因载体具有低分散性，可重复合成性，良好的生物亲和性， 较低细胞毒性，代谢产物少，无免疫排斥反应，稳定性好等许多优点。 目前，无机材料制备纳米颗粒非病毒基因载体存在一定局限性：一方面必须 对纳米颗粒再进行阳离子聚合物或氨基硅烷化等功能化修饰，程序化较复杂；另 一方面对纳米颗料的大小有一定的要求从而使其在基因载体的研究与应用中受 至0 限铝0 【1 4 , 1 s j 。 壳聚糖及壳聚糖衍生物 甲壳素是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物，主要存在于蟹壳、虾 壳等的甲壳中，学名聚( 1 - 4 ) 2 氨基2 脱氧b d 葡聚糖。从结构上说甲壳素、 壳聚糖与纤维素极其相似，即吡喃糖环碳二位置上纤维素是羟基，甲壳素是n 乙酰基，而壳聚糖是氨基【l6 1 。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素的脱乙酰基产物，来源丰富，制各简单，且具 有很好的生物相容性，在体内能被溶菌酶等降解并代谢，且其分解产物对人体健 康无害。目前，利用壳聚糖制备缓释、控释制剂已取得较好的效果，所制成的微 球对特定器官组织的靶向性及微球中药物的缓释性已成为近年来新剂型研究的 热点【1 7 1 。 纤维素( c e i h i l o s c ) 甲壳质：( 1 ，o - 2 - z , 院i 秃聚糖：聚( 1 4 ) 2 氨基 基2 脱氯口胁葡萄糖2 - 脱氧廿d - 葡萄糖 图i - 2 f i g1 - 2 纤维素、甲壳素与壳聚糖的结构简图 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc e l l u l o s e 、c h i t i na n dc h i t o s a n 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物 功能。壳聚糖及其分解产物无毒性，具有生物相容性和生物可降解性，有抗菌消 炎，促进伤口愈合，抗酸，抗溃疡，降血脂和降胆固醇等多种作用，同时还具有 很强的凝血作用，经硫酸化后，能转变成肝素类似物而起到抗凝血作用。肿瘤细 胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此壳聚糖在酸性环境中对肿瘤细胞表面 第一章绪论 具有选择性吸附和电中和作用【1 8 】。此外壳聚糖还具有直接抑制肿瘤细胞的作用， 通过活化免疫系统显示抗癌活性，与现有的抗癌药物合用可增强后者的抗癌效 果。壳聚糖在酸性条件下，是一种线性高分子电解质，其溶液具有一定的粘度， 溶液的浓度越高或分子量越大，粘度就越大。壳聚糖因含有游离氨基，其氮原子 上还有一对未结合的电子，使氨基呈弱碱性，能结合一个氢离子，从而使壳聚糖 成为带正电荷的电解质。 壳聚糖用作基因转导载体系统的优势在于【1 9 】： 1 ) 其氨基质子化后带大量正电荷，易与带负电荷的d n a 结合，能形成稳定的聚 电 解质复合物； 2 ) 对壳聚糖进行修饰可制成靶向性配体，如将其半乳糖苷化后，制得肝实质细 胞靶向载体； 3 ) 可与溶酶体原( 1 y s o s o m o l y t i ca g e n t s ) 合为一体减少d n a 在内涵体和溶酶体 内的降解； 。 4 ) 可保护d n a 不受血清中核酶的降解，提高生物利用度； 5 ) 具有生物相容性和生物可降解性； 6 ) 由于壳聚糖在胃肠道中的黏附性和传送特性，还能用作口服基因载体。 l ，o _ _ o o _ o b 毒= 0 _ - - _ - j _ - - 一 m d n a 图1 3壳聚糖和d n a 相互作用的关系图 f i gl 3i n t e r a c t i o no fc h i t o s a na n dd n a 壳聚糖由于其有较高的正电荷和较低的细胞毒性，可作为基因载体。现已有 报道，壳聚糖作为基因载体有较高的转染效率。其转染效率主要由高聚物的分子 量( m w ) 、壳聚糖和d n a 的化学计量比、血清的浓度、转染介质的p h 【2 们。 6 跏q夥； o i 瞄。 第一章绪论 壳聚糖为酸溶性高分子，在复合物制备过程中，很多情况下要在酸性条件下 操作，容易造成对寡核苷酸的破坏和对细胞的毒性1 2 。所以对壳聚糖进行结构改 性在制备基因载体过程中是相当必要的。壳聚糖常见的改性方法是在壳聚糖的羟 基和氨基上引入其他的基团，如糖基化壳聚糖、季铵盐改性的壳聚糖、羧甲基壳 聚糖等等。本实验采用的壳聚糖改性方法是在壳聚糖的氨基上引入赖氨酸，改善 壳聚糖水溶性的同时增加壳聚糖的生物相容性。同时使壳聚糖的单体单元上又引 入一个氨基，提高壳聚糖的正电性，可以静电吸附更多的d n a 。再次，赖氨酸 上有较长的烷基链，分子链的蜷曲可以浓缩更多的d n a 。改性后的产物可以在 p h 为7 4 的p b s 缓冲液之中稳定存在，提高基因载体复合物的稳定性，提高基因 进入细胞核的几率，并且由于烷基链的相互作用，使得d n a 壳聚糖的复合物进 入体内后相互作用，更加容易释放d n a ，提高基因表达的转染效率。 ( 3 ) 复合载体 为了提高基因载体的靶向性，阳离子多聚物包裹的超微磁性粒子已有所研 究。超微磁性粒子的研究始于2 0 世纪7 0 年代末，u g e l s t a d 成功地在重力条件下制 各了尺度均一的单分散的聚苯己烯磁性微球阱1 。由于磁性微球的超顺磁性，这给 目标生物产品的分离带来了革命性的发展：而且由于其在磁场环境下可以快速富 集，因此为实现靶向承载基因提供了可能。超微磁性粒子基因载体是纳米技术与 现代生命科学结合的产物，由于它具有小尺寸效应、良好的靶向性、生物相容性、 生物降解性和功能基团等优点，即：具有磁响应性和纳米微球的特殊性质，研究 涉及生物医药领域的许多方面，包括固定化酶及蛋白，生物细胞、大分子的分离， 药物和基因的运载与靶向，免疫，生物传感器等，其中载基因磁性纳米粒的应用 最为突出。 超微磁性载体粒子表面可结合各种功能分子，如多肽，酶、抗体、细胞、药 物，d n a 或r n a 等，因而在细胞生物学，分子生物学、免疫测定、生物医学工 程等领域得到广泛应用团】。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展和纳米技术 研究的深入，磁性材料在基因治疗中的应用得到了前所未有的发挥，尤其以纳米 磁性材料为代表，其特殊的超顺磁性能，准确的靶向性和在外磁场推动下对细胞 膜及血脑屏障强大的穿透力使得纳米磁性材料为核心的基因承载系统不断在动 物试验和临床癌症研究被采用，并获得了成功。 1 3 超微磁性载体 磁性靶向载体粒子( m a g n e t i ct a r g e tc a r r i e r s ) ，m t c s ) 是一种广泛应用于癌症治 疗及诊断的磁性材料，医用磁性靶向载体主要是由铁微粒( 或铁氧微粒) 和其它活 第一章绪论 性成分构成的纳米微粒。粒子本身具有生物相性，并可在体内完全代谢。这些纳 米微粒具有较强的药物承载能力，抗癌药物以及抗体、活性蛋白和小分子多肽等 物质通过一定的物理吸附作用或化学键与其相连，并配合载液形成磁性靶向载体 系统。该系统经由静( 动) 脉注射进入体内，在外加磁场的引导下富集到病灶处释 药治疗，运用磁性靶向载体进行局部定位治疗不但减少了药物对正常组织细胞的 毒害，同时，在病灶部位形成高浓度药物环境，进一步加强了药效。磁性靶向载 体粒子的磁性能，分散性和自聚性都是决定其功效的重要条件。一般来讲，通过 在制备载体微粒过程中加入表面活性剂可确保载体微粒稳定传输而不自聚，并通 过控制载体微粒粒径来改变磁性能，制得超顺磁的载体微粒。过去有报道称，微 粒直径小于l o o n m ，其磁矩较小而相对面积较大，载体微粒由于( 体液中的) 阻力 太大难以进行传递。但是，随着纳米技术和永磁体制造工艺的不断发展，现在 所普遍采用的医用纳米磁粒直径一般为2 0 h m 左右，亦或l o n m 以下。并且，与之 相反，如果磁粒粒径太大，超过2 1 r i m 时，磁性靶向载体几乎不能形成稳定的分 散相，已不适合用导管注射到人体内。同时，作为磁性靶向载体传输动力的外加 磁场，其提供的磁场力必须足以使载体微粒穿透毛细血管网深入到病灶组织中， 从而可克服肿瘤压力和抗药性对疗效的影响，通常使用的外加磁场强度为1 特斯 拉【2 4 】。 1 3 1 超微磁性载体的组成 q 一材料 第一章绪论 以上三种结构中，第一种是以磁核为芯部，这种结构可以直接在高分子外层 连接所需携带的药物、抗体、基因等；第二种和第三种结构则是以高分子层为芯 部，一般它携带的是对机体内的生理环境反映较敏感的药物。将药物等包埋在内 部，以避免药物在到达靶部位前发生反应，从而降低疗效或对其他器官、组织、 细胞产生毒副作用【2 5 1 。 超微磁性载体粒子壳层则是由高分子物质组成，天然高分子材料因其生物学 特性和成膜性( 或成球性) 较好，从而倍受研究人员关注。作为载基因超微磁性粒 子的壳层则主要是阳离子多聚物如壳聚糖及其衍生物、聚乙烯亚胺p e i 、树状高 分子物质。 1 3 2 超微磁性载体粒子的特性 1 小尺寸效应 由于磁性载体的粒径足够小，所以比表面能激增，官能团密度及选择性吸附 能力变大，可以在细胞水平上产生有效的治疗。磁性纳米微球的磁核尺寸一般为 2 0 r i m 左右。比如1 0 - - 3 0n m 的磁性明胶微球已经被证实对狗的肾动脉栓塞具有 良好效果。此外，庙于磁性载体具有高的选择性吸附能力，所以它们的载药能力 也较大，一般随着微球粒径的减小，其载药量和药物的包埋率也都提高。 2 磁响应性 磁响应性即磁性纳米微球对外加磁场的反应。利用磁性纳米微球的磁响应 性，在外加磁场作用下，磁性纳米微球可以方便地进行分离和磁性导向。磁性微 球中磁核的含量是反映微球磁响应性的一个重要参数，磁核含量为微球总重量2 0 5 0 为最佳。实验证明在血流速率为0 5 5 0 1 e m s 的血管处， 0 。8 t ( 8 0 0 0 g s ) 的外磁场下，就足以使含有2 0 ( g g ) 的磁性载体全部滞留在靶 器官中。当作为磁核的金属氧化物粒子的直径小于3 0 n m 时，具有超顺磁性，即 在磁场中有较强磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使磁性纳米微球能够在磁 场中不被永久磁化，因此在机体内既安全又易控制。 3 生物相容性和生物降解性 在生物工程中，尤其是生物医学领域中，生物相容性和生物降解性是磁性载 体在生物及医学中应用的重要方面。磁性纳米微球的结构中的壳层，大都使用具 有良好的生物相容性的生物高分子如多聚糖、蛋白质等，它们在人体内安全无毒， 并且可生物降解。载体与药物或基因片段等定向进入靶细胞之后，表层的载体被 生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了药物在其它组织中释放，从而 提高药物疗效。这在靶向药物中尤其重要。磁性纳米微球的磁核，可以很方便地 9 第一章绪论 通过人体自然排出，而不会影响人的健康。 4 功能基团特性 由于磁性微粒表面包覆有高分子材料，而生物高分子带有多种具有反应活性 的功能基团，如一c h o ，一o h ，一c o o h ，一n h 2 ，就可连接具有生物活性的 物质，如药物、d n a 、r n a 、免疫蛋白、生物酶等。同时也可在颗粒表面偶联 特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特 异性受体结合，在细胞摄粒作用下进入细胞内，实现安全有效地用作靶向性药物、 基因治疗、细胞表面标记、同位素标记等。 1 3 3 微磁性载体粒子的制备方法 磁性微粒的制备方法主要有共沉淀法、溶胶凝胶法、水热法、包埋法、单 体聚合法、化学转化法、生物合成法、以及等离子气相沉积法( p c v d ) 等。下 面对这几种方法一一作以介绍【2 6 】。 1 3 3 1 共沉淀法 共沉淀法是制备铁氧粒子的经典方法，是含多种阳离子的溶液中加入沉淀剂 后，所有离子完全沉淀的方法。该方法反应过程为： 2 f e ”- - i - f e 2 十+ 8 0 h f e 3 0 4 + 4 h 2 0 i v 但传统方法沉淀出来的铁氧粒子性能单_ ，承载性能不佳。近年兴起的聚合物基 共沉淀法，利用高分子物质具有缠节性，利于包覆的特点，制备了铁氧粒子聚 合物核壳结构的磁性载体，且高分子物质的黏附性在制备中还可起到控制粒径的 作用。这种方法制备的载体粒子具有生物体内相容性好，承载能力强而灵活的特 点。 1 3 3 2 溶胶凝胶法 此方法是通过醇盐水解、聚合，形成溶胶，再转变成凝胶。凝胶在真空状态 下低温干燥，得到疏松的干凝胶，干凝胶作高温煅烧处理后，即得到纳米粉体。 该方法可采用蒸馏或重结晶技术来保证原料的纯度，整个工艺过程不引入杂质离 子，有利于高纯材料的制备，所得粉体粒径较小，且粒度分布窄。但它也有不足 之处，如原料价格高、有机溶剂的毒性以及在高温下作热处理时会使颗粒快速团 聚等。目前用溶胶凝胶法已可制备很多氧化物的纳米级粉体。 l o 第一章绪论 1 3 3 3 水热法 水热法是一种在密封的压力容器中，以水作为溶剂、粉体经溶解和再结晶的 制各材料的方法。相对于其他粉体制备方法，水热法制各的粉体具有晶粒发育完 整、粒度小、且分布均匀、颗粒团聚较轻、可使用较为便宜的原料、易得到合适 的化学计量物和晶形等优点。尤其是水热法制备陶瓷粉体毋需高温煅烧处理，避 免了煅烧过程中晶粒的长大、缺陷形成和杂质引入，因此所制备的粉体具有较高 的烧结活性。 1 3 3 4 包埋法 包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶液 中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性微粒。磁性粒子表面与亲水性 高分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些高分子的溶液中， 再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。为了增加微球 的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层等进行稳定化处理。天然高分子磁性微球 均采用这种方法制备。该法简单易行，但制得的磁性微球粒径难于控制，形状不 规则，在细胞分离等领域的应用受到限制。 1 3 3 5 单体聚合法 单体聚合法是先将磁性粒子、单体、引发剂、稳定剂等的混合液通过均化器 分散均匀，再在适当的条件下进行聚合以制备核一壳式磁性微粒的方法。聚合方 法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合( 包括无皂乳液聚合，种子聚合) 等。 因为很多有机单体疏水性很强，难以与磁核的亲水表面紧密结合，所以往往要对 磁微球表面进行预处理，使其表面具有一定的疏水性，或者适当改变聚合体系的 有机组成，以利于聚合的进行。所制备的磁微球粒径分布范围宽，难以形成均匀 包裹的微粒。 1 3 3 。6 化学转化法 化学转化法是指先合成均一的多孔有机聚合物微球，微球中含有c l 、 c o o h 、n 0 2 、o h 等官能团，均匀地分布于微球的表面和孔洞中，然后将 一定浓度的f e 2 + 和f e ”渗透到微球的内部与上述基团作用而被固定，再升高p h 值 使f e 2 + 和f e 3 + 在孔中形成f e 3 0 4 。此法操作简便，所制备的磁性微球粒径和磁性 都具有高度的均一性，但对聚合物微球的要求比较严格。 第一章绪论 1 3 3 7 生物合成法 自然界中存在一些向磁微生物。如小螺菌细胞中铁含量极高，为干燥茵体的 3 8 ，比一般的微生物铁含量高1 0 0 倍。它们都是单畴晶体，有超常磁性。向 磁微生物在沿着地球磁力线移动时可以在体内合成生物膜包被的超微磁粒体，如 - 将其由向磁微生物中分离，就可以大量地生产粒径均匀的天然磁微球。细菌磁性 粒子具有形状小、均匀、机体适应性好的特点。如果药物释放装置采用向磁性细 菌合成的磁性微粒，就可得到更好的治疗效果。另外细菌内的磁性微粒为蛋白质 和脂膜所包裹，利用这种膜可以使天然磁微球应用于人造磁微球难以达到的药物 释放、分离、计量等目的。目前向磁性细菌尚处于基础研究阶段，有待于进一步 研究。 1 3 3 8 等离子气相沉积法( p c v d ) 它是纳米陶瓷粉体制备的常用方法之一，具有反应温度高、升温和冷却速度 快等特点。p c v d 法又可分为直流电弧等离子体法、高频等离子体法和复合等离 子体法。对于直流电弧等离子体法，由于电极间电弧产生高温，在反应气体等离 子化的同时，易因电极熔化或蒸发而污染反应产物。高频等离子体法的主要缺点 是能量利用率低，产物质量稳定性较差。复合等离子体法则是将前两种方法合为 一体。它在产生直流电弧时不需电极，避免了由于电极物质熔化或蒸发而在反应 产物中引入杂质；同时，直流等离子体电弧束有能有效地防止高频等离子火焰受 原料的进入造成干扰，从而在提高产物纯度制备效率的同时，提高了系统稳定性。 此外，人们还将一些新的方法用于制备磁微球。如用两种新型声化学方法合 成了磁性蛋白微球，一种以水为溶剂，另一种以萘烷为溶剂，并对其性质进行了 讨论。张律辉利用辐射聚合制备了胺基、羟基、羧基、醛基四种类型的磁性微球， 并在免疫分析中得到了初步应用弘7 】 这些制备的磁性微粒具有高分子微粒的特性，可进行表面改性。在制得的磁 性微粒上，载体基体带有o h ，n h 2 ，c o o h ，c o n h 2 等功能基团，易 与酶或抗原、抗体等物质结合，标记和分离许多生物材料。磁性微球与其它物质 的结合方法主要有：碳二亚胺缩合法、重氮盐偶联法、混合酸酐法、n 羟基琥珀 酰亚胺活化法、复乳化法、超声乳化法、等电临界法、过碘酸盐氧化还原法、戊 二醛双功能交联法、环内酸酯法、硫氰酸酯衍生物法及o 一( 羧甲基) 羟胺法等。根 据标记物质结构的不同，实验中选择不同的标记方法【2 引。下面主要对复乳化法、 超声乳化法、等电临界法、过碘酸盐氧化还原法这四种方法【2 7 】作一下简单介绍。 1 2 第一章绪论 1 3 3 9 复乳化法 迄今为止，用聚交酯( p o l y l a c t i d e ，p l a ) 、聚乙交酯( p o l y g l y c o l i d e ，p l g ) 、乳 酸一乙醇酸共聚物( p o l y l a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 等聚酯制备纳米微球几乎都 采用此法。即将含抗原的水溶性内相乳化分散于含p l g a 等载体材料的有机相中， 形成一级乳w o ：再将一级乳分散于p v a ( 聚乙烯醇) 水溶液，形成w o w 复乳； 室温搅拌挥去有机溶媒，水洗，收集微球，冻干【2 羽。复乳化是由微囊化和囊壁固 化两步组成的。在微囊化时，第一水相以水珠形式分散于油相，通过机械搅拌器 分散成油珠，其中包着第一水相，在p l u n o n i cf 6 8 作为表面活性剂的作用下能较 稳定地存在于第二水相中。随着第二水相中的苯的挥发，囊壁随之固化；在第二 水相中的碳酸钠碱性条件下明胶和福尔马林固化而使磁性载药微粒定形。 1 3 - 3 1 0 超声乳化法【2 9 】 用生物降解性乳酸一乙醇酸共聚物( p o l y l a c f i c - c o - g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 为载 体，与所载药物按适当比例称取，加入二氯甲烷和丙酮的混合溶剂使其溶解，配 制一定浓度的聚乙烯醇( p v a ) 水溶液，用超声乳化器p l g a 溶液分散在p v a 水溶 液中，形成水包油型乳化液。在不断搅拌下抽真空除去有机溶剂令微粒固化，超 速离心分离后，将微粒冷冻干燥。 1 3 3 11 过碘酸盐氧化还原法 本方法是将葡聚糖( d e x ) t - - 4 0 与氯化亚铁或氯化铁反应制成磁性纳米粒子， 称取一定量的该粒子，按反应需要的摩尔比加入高碘酸钠进行醛化。可将研究药 物与此磁性纳米微粒在合适条件下交联，制成载药磁性纳米粒子，用做靶向给药。 1 3 4 超微磁性载体粒子的优点及应用前景 1 3 4 1 超微磁性载体粒子的优点 超微载体微粒有诸多优点，制备超微载体微粒的技术也将越来越完善，将 来可在以下几方面对临床治疗带来益处，也为药学和基因治疗工作者今后的努力 确定了方向【3 0 】。 1 ) 解决口服易水解药物的给药途径 抗菌素、多肽类药【3 、蛋白类药f 3 2 1 、酶类药等许多药物因口服后易被胃酸 破坏而只能注射给药，应用上受到了限制。载药纳米微粒的出现，为解决这一问 题提供了一个有效的途径。未来也许青霉素可以口服而又重新发挥它的能力；核 苷酸也因能被口服而在异军突起的基因治疗中简化使用程序；白蛋白【3 3 】可由需要 第一章绪论 补充蛋白的患者自行携带使用而无须注射。 2 ) 延长药物的体内半衰期 一些半衰期短的药物因需要每天重复给药次数较多，可能会因患者的顺应 性较差或无意识的漏服而影响治疗效果。有人设想用分子生物学与纳米技术结 合，预期可制成微小的直接包含药物工厂的分子机器，在体内循环过程中，制造 出治疗所需的药物，这种技术比缓释的载药纳米微粒对人类健康又有了进一步的 贡献，某些需长期甚至终身用药物治疗的疾病如高血压、糖尿病等的用药问题因 此会得到解决。 3 ) 更精确的靶向定位给药，减少药物不良反应 药物的作用部位直接影响到药物的治疗意义。许多药物的体内分布容积受 其理化性质的影响无法令人满意，因而达不到治疗所期望的部位，或者治疗部位 的药物浓度远远低于血药浓度，由此使这类药物虽然有较好的药理作用但因严重 的不良反应造成使用受限。磁性载药纳米微粒的出现为更好地发挥这类药的作用 带来了新的希望。解决了靶向定位的问题，肿瘤药可直接作用于肿瘤细胞而不影 响正常细胞的功能；心血管药可直接作用于需治疗的部位而不是通过血液循环引 起全身反应【3 4 3 5 】。 4 ) 消除生物屏障对药物作用的影响 在我们的机体中存在许多天然的屏障，如血脑屏障、细胞生物膜屏障等， 这些屏障保护着我们的机体不受侵害，但也给一些疾病的治疗带来了困难。载药 微粒的发展必将会向这个方向进行。随着定位问题的解决及与细胞膜有较大亲和 力的基质的发现，因载药纳米微粒具有以前剂型所不具备的优点，可透过生物膜 并穿透血脑屏障【36 1 ，届时一些有特效的药物可被输送到颅内治疗现在不得不手术 的疾病；可因在单核巨噬细胞中有较高药物浓度而大大增强抗菌药物的作用。 磁导向下磁性载体粒子的作用机理是在药物微球中加入具有磁响应性的物 质( 女l ：i f e 3 0 4 ) ，再将磁性药物注入组织内，同时在肿瘤外部施加有效强度和梯度的 外磁场，使磁性药物固定于肿瘤组织内，以达到治疗的目的。 该方法优点突出，主要表现在：( 1 ) 可以更有效的减少网状内皮系统( r e s ) 的吸收。( 2 ) 磁性药物微球有缓慢释放作用，可以相应地耐受较高的药物剂量， 研究表明：应用磁性微球可使有效药物的化疗指数增加l o 一1 0 0 倍f 3 7 】。( 3 ) 加 速产生药效，提高疗效。( 4 ) 对于体外磁场有相应的磁响应性。( 5 ) 在合适磁 场存在的情况下，磁性微球的大量聚集使血流减慢，从而提高了颗粒的滞留，有 可能使更多的载体血管外渗出发生。这样，微球起到了血管外药物贮存站的作用。 ( 6 ) 更多的磁性微球制剂从肿瘤组织的血管内皮中渗出，使药物在细胞或亚细 胞水平发挥药理作用成为可能。( 7 ) 磁性药物微球在正常组织中的浓度大大减 1 4 第一章绪论 少，从而减少了对正常组织细胞的损伤【3 8 】。 1 3 4 2 超微磁性载体粒子的应用前景 磁性载体粒子作为一种新颖的功能高分子材料，在医学、生物学、工业应 用等众多领域具有广阔的应用前景，因此目前国内外有关这方面的研究十分活 跃，近几年来的研究主要集中在以下几个方面： ( 1 ) 进一步深入研究磁性载体粒子的研究工作，在磁性高分子微球的不同粒 径、密度、磁响应性、功能基团、表面电荷强度等方面与生物医学等领域接轨， 满足不同使用要求。 ( 2 ) 研究具有强磁响应性和高比表面积的磁性载体粒子。磁性载体粒子用于 医学、分子生物学、工业应用等领域，最主要是运用其磁响应性和表面吸附、键 合特性。但是强磁响应性和高比表面积却相互影响。强磁响应性的微球，往往粒 径较大，而粒径的提高，不仅降低了其在溶液中的悬浮稳定性，而且使其比表面 大幅降低。例如，对于表面光滑，密度为1 5 克毫升的无孔微球而言，若粒径为 1 0 0 纳米，则其比表面可达4 0 平方米克，而粒径增大至1 微米时，其比表面降 低至仅为4 平方米克，大大影响了其吸附容量。因此，研究强磁响应性和高比 表面的磁性高分子微球是今后研究的一个重要方向，这可望通过采用高性能的磁 性无机粒子得以突破。 ( 3 ) 完善聚合机理。磁性载体粒子存在下的单体聚合反应和常规的聚合反应 差别较大，因此探讨聚合机理，弄清磁性高分子粒子对聚合反应的影响及磁性粒 子和有机物之间的相互作用关系是我们一项重要的课题。 近年来，诸如磁性纳米颗粒、磁性纳米脂质体等逐渐成为国内外导向药物 领域的热门课题。在今后肿瘤治疗中，也