（生物医学工程专业论文）胆红素氧化酶的分离纯化及其性质的研究.pdf

硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化及其性质的研究 a b s t r a c t h a v i n gb e e nc u l t u r e d4d a y si np o t a t oc u l t u r em e d i u m ，b i l i r u b i no x i d a s e ( b o x ) i sp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r ef i l t r a t eo f m y r o t h e c i u mr o r i d u ma f t e r4d a y s t h ep u r i f i e d e n z y m ei s o b t m n e db yt h e s e p h a d e x g 一1 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y i ts h o w sa h o m o g e n o u ss t a i no nt h eg e lo fs d s p a g e a f t e rt r e a t e db yu v - t w om u t a n ts t r a i n s w i t hh i g h y i e l do f b i l i r u b i no x i d a s ea r eo b t a i n e d t h em o l e c u l a r w e i g h to f t h ee n z y m e i sa b o u t6 8 k d a i t so p t i m u m t e m p e r a t u r ei s5 0 a n di t so p t i m u mp hi s7 5 m e t a l i o n sh a v ee f f e c t o ni t sa c t i v i t y , e d t aa n du r e ac a r li m p r o v ei t sa c t i v i t ya n d i m p r o v e t h es t a b i l i t yo fs u b s t r a t e t h i se n z y m ec a no x i d a z eb i l i r u b i nt ob i l i v e r d i na n df u r t h e r t oa nu n k l l o w ns u b s t a n c e ，s oi tc a l lb eu s e dt od e t e r m i n et h eb i l i r u b i ni ns e r u m i nt h e c l i n i c a lf i e l d a sa n a n a l y t i c a lt 0 0 1 i th a saw i d el i n er a n g ea n di sa c c u r a t ea n de x a c t k e yw o r d s ：m y r o t h e c i u mr o r i d u m ，b i l r u b i no x i d a s e ，p u r i f i c a t i o n ，b i l i r u b i n i i 6 2 s7 2 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：鏖拯弛 p r 年7 月臼日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以匈有关却门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：垄i 垒趣 妒年7 月抄日 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 1 引言 1 1 生物技术和医学诊断 在2 0 世纪9 0 年代初，“2 l 世纪是生命科学的世纪”还是科学家的预言。近十 年来，人类基因组研究的突飞猛进，转基因技术、克隆技术的日新月异发展，随着 时光进入2 1 世纪，这个预占正在变为现实。 在过去的1 0 余年里，生物技术研究丌发的6 0 8 0 集中在医药领域“，占重 要地位的是基因工程药物的研究和商品化，被称为生物技术及产业发展的“第一个 浪潮”“1 。而生物技术在疾病诊断与治疗中的应用，开辟了医学科学的新纪元，极 大地推动诊疗水平的提高，开创了生物诊断试剂的广泛的天地，它提高了诊断的灵 敏度，扩大了诊断范围，使治疗疾病更具有针对性。这些诊断方法包括无创伤诊断、 免疫诊断、核酸诊断、酶诊断等，其中酶诊断已成为常规诊断，多克隆抗体检测技 术已逐步为单克隆抗体所取代，核酸诊断技术已研究如何使检测费用降至更低，便 于广泛应用。1 。 1 2 酶诊断试剂 酶诊断试剂是最早的生物诊断试剂，它以灵敏度高，检测方便的特点广泛用于 医院对心血管病、肝病、糖尿病、肾病、胰脏病及代谢病的常规检测上。酶在诊断 试剂上除酶本身作为检测试剂外，更多的是用作检测上的标记，由于酶的灵敏度高， 因此可用比色反应定量检测样品，如碱性磷酸酶在免疫测定上，已普遍用作标记。 表1 为近1 0 年来国内外研制成的诊断试剂工具酶研究的国内外文献资料和这些酶 的菌种来源、分布特点、主要用途、工艺技术完善程度及主要技术创新。”3 当前，诊断试剂工具酶研究发展趋势主要有通过诱变技术和底物诱导作用等方 法，选育出稳定、高产的优良菌株；寻找产生胞外酶的菌种，因为胞内酶分离中遇 到大量菌体蛋白的干扰，使分离纯化程序复杂化，加大了目的酶的损失，而胞外酶 无需破碎细菌细胞，培养液中杂蛋白量少，可用较为简捷的分离纯化方法加以提纯： 对传统的酶分离纯化工艺进行改进，采用温和、高效的生化新技术，如超滤技术、 疏水层析技术等，能够显著提高目的酶的纯度和产率；深化酶理化特性的研究，为 诊断试剂配制中正确使用工具酶提供科学依据；开辟工具酶的新用途，建立新的临 床化学酶分析方法，以代替准确性和精密度均较差的化学方法；构建诊断试剂工具 酶基因工程菌从而大大提高目的酶的产量，但这项工作在国内起步较晚。 评价临床化学酶法试剂的质量，离不开对工具酶的质量评价。从实用角度考虑， 一个好的工具酶应当具备的基本条件是：( 1 ) 对底物专一性高：( 2 ) 热稳定性好：( 3 ) 酸碱耐受范围较宽：( 4 ) 比活性高：( 5 ) 有害杂酶含量在一定限度以内。前三项指标已 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 表1 近1 0 年来国内外研制成的诊断试剂i i 具酶 t a b l e 1e n z y m eu s i n ga sd i a g n o s t i ct o o l si nr e c e n ty e a r s 脲酶普：i 匝变形杆菌胞内 血清尿鬻定、试剂经3 0 ll 葚嚣黔培养，优 脲酶芽胞杆菌胞内 血清尿翟定试剂经摇瓶发鬟誓鬻尿素诱导 腊酶 皱落假丝酵母胞外等篙粱嘉荛雾经摇瓶篙豸雾水层析 葡萄化。怒，胞外血葡萄翟定试剂经3 8 。嚣黧鬻养使用 已糖、激酶 面包酵母胞内 肌酸激絮定试剂使用细胞篙亲溶超声粉 胆红嘉靴 疣疱漆斑菌胞外 血清胆嘉挈定试优化发酵条繁0 0 啪瓶培 胆红嘉氧化 疣疱漆斑菌胞外 血清胆翥霎测定试摇瓶培霎：蓑霎霎萋外线诱 谷氨霎脱氢天鬻紧菌胞内血蒙嚣霎罢翥爹对菌种蝴亍霉爹理及摇瓶 脂肪酶猪胰胞内血清t g 测定试剂盒 酶理化性质羹笑用研究较为 乳酸氧化酶 粪链球菌胞内乳酸测定试剂盒 加入t 。i ”x 辑- 1 0 0 破壁效果 胆i 蚓醪朗酶 假单孢菌 胆固冀氧化 节杆菌8 2 菌株 酶 l 雩慧譬氧 放线菌p 一2 6 化酶 一 谷氨璧脱氢 猪肝 酶 ” 甘油激酶嗜热脂肪芽孢 杆菌 。鐾譬兰油 兔肌 脱氢酶 甘油氧化酶日本曲霉a t 0 0 8 甘油磷酸氧气球菌属变异 化酶株 胆固冀氧化 红球菌属 酶 一 胞外 血清胆景鐾测定试 胞外 血清胆景鐾测定试 胞外血清碍? 定试剂 胞内血清尿絮惋黼。 胞内定量检掣油试剂 胞内 衄清萎婆翥霎酶偶 胞内血清t g 测定试剂盒 血清t g 测定试剂盒 胞外 血清胆景鬈测定试 使用超滤分离技术等 产酶条件及后提纯工艺优化 优化产酶条件 纯化t 艺及酶稳定性研究 应用s i p i i i 蓝色染料配基层 析等分离技术 建立了液一液双水相提取新 技术等 发酵罐放人培养 优化培养条件 优化培养和分离条件 肌酸酶鬻誓蓼鹏、怒测糊楗胜鬯鬈航腿 2 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 包含在酶的理化特性之中，酶的比活性越高，表明酶的纯度越高，酶的比活性高低 决定于酶纯化工艺的有效性，诊断试剂盒用工具酶要求有适当的比活性即可，不必 要求越高越好。对工具酶中容易引起有害反应的一些酶( 即所谓杂酶) 的含量的确定 必须兼顾降低工具酶的生产成本和保证酶试剂的质量，但目前尚未见到国家卫生部 的推荐标准。 1 3 胆红素的性质和测定方法 1 3 1 胆红素的性质 胆红素是铁卟啉化合物在人体内的代谢产物之一，主要来源于衰老红细胞崩解 后的血红蛋白，随胆汁排泄。工业上主要是从胆汁中提取得到胆红素。它是由四个 吡咯环通过碳桥相连化合物( 见图1 ) ，为淡橙色或深红棕色的单斜晶体，在4 5 0 n m 波长附近有最大峰。在生理条件下难溶于水，可溶于苯、氯仿及二硫化碳等有机溶 剂中，微溶于乙醇和乙醚，也可溶解在热的乙醇与氯仿的混合液中。因分子中有两 个丙酸基侧链，故胆红素是弱酸，易溶于碱。其钠盐易溶于水，但钙盐、镁盐、钡 盐，则不溶于水。其干燥固体较稳定，氯仿溶液置暗处也较稳定，在碱液中或遇三 价铁离子则不稳定易发生氧化和异构化。胆红素可与甘氨酸、丙氨酸或组氨酸结合， 加血清蛋白、维生素或e d t a 可使胆红素稳定。 自从s c h m o r 氏1 9 0 4 年提出胆红素脑病以来，人们对胆红素的毒性和危害已有 较多了解。凡是胆红素的生成过多或使肝细胞对胆红素的摄取、结合、排泄过程发 生障碍，造成胆红素代谢紊乱“1 ，都可使血中胆红素浓度增高，出现高胆红素血症， 最终导致黄疸“1 。所有新生儿胆红素聚集水平均高于成年人，其中2 0 的婴儿出现 黄疸。由于胆红素结合在细胞膜及线粒体膜上，会造成不同组织中的细胞死亡。在 临床上，胆红素毒性可引起智力降低、脑瘫痪、耳聋或死亡。在人和动物的研究中， 核黄疸的产生，部分也与胆红素的浓度及暴露于胆红素中的时间长短有关”1 。因而， 血清胆红素测定成为临床医学的一项重要的常规检验项目，是黄疸性疾病诊断和鉴 别诊断的一项重要指标，对了解黄疸的深度及疾病的发展均有一定意义。此外，胆 红素能抑制脂质过氧化反应，在功能上是一种过渡性的重要抗氧化剂，是活体所不 可缺少的，胆红素浓度过低也会增加动脉粥样硬化形成的危险性、心脏病的发病率 以及糖尿病肾病的发生o 。 1 3 2 胆红素的测定方法 胆红素测定的研究是临床医学中古老而又重要的课题，1 8 8 3 年e h r l i c h 发明重 氮试剂并应用于尿中胆红素的测定，1 9 1 6 年v a n d e nb e r g h 把重氮试剂用于血清中 胆红素的测定。胆红素依其与重氮试剂反应的模式被命名为直接反应、间接反应胆 红素，二者之和称总胆红素。1 0 0 多年来一直是以这样的概念研究临床胆红素疾病 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 的，并形成了传统观念。1 9 6 6 年k u e n z l e 等用柱层折方法测定未经除蛋白的人血清 样品中的胆红素，发现了一种新的胆红素成份。1 9 8 1 年l a u f f 用反相高效液相色谱 ( h p l c ) 法分离出这种成份，并命名为6 胆红素。从此人们对胆红素的认识发生 了如下变化“： 传统：t b = b u 十d b 现代：t b = b u 十m b c 十d b c 十b6 ，d b = m b c 十d b c 十b 6 t b = 总胆，d b = 直胆 b u = 未结合胆红素，即间胆 b c = 结胆，用b p l c 可分m b c ( 单葡萄糖醛酸结合) 和d b c ( 双葡萄糖醛酸结合) 二：种 b6 = 6 胆红素。 峪c r h 删嗽 直接胆红索 图1 胆红素及胆红素b 一葡萄糖醛酸苷的结构 f i g 1s t r u c t u r eo f b i l i r u b i n 血清中胆红素的测定方法很多，除上述重氮试剂法外，还有胆红素氧化酶法 ( b o d ) 、化学氧化法、高效液相色谱法( h p l c ) 、k o d a k 干片法、分光光度法等。目 前国内胆红素在临床检验中主要存在以下三个方面的问题： 1 临床检验结果之间的可比性较差：同样一个检测样品，各厂家生产的试剂 盒其检验结果往往相差很大，但并不能因此判断出试剂盒的好坏。 2 正常水平的胆红素含量比较低，使得检测方法的灵敏度和检测仪器的精密 度成为影响检测结果的重要因素之一。 3 氧化法测定胆红素过程中对p h 值的要求很严格，外来影响导致p h 值的变 化对检测结果产生很大的影响。 下面具体介绍一下比较常用的传统重氮试剂法、化学氧化法和胆红素氧化酶法 ( b o d ) 。 ( 1 ) 重氮试剂法 重氮试剂法最古老，但到目前为止仍应用最广。有过无数个版本，但最流行的 4 蒋 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 有j g 法和m e 法。前者也是我国医学检验学会推荐测定胆红素的常规方法“，原 理是在胆红素与重氮试剂反应后产生的重氮胆红素使之在碱性条件下变成绿色( 本 来为红色) 。光谱的转移增加了反应的灵敏度和特异性，在绿色环境中血红蛋白( h b ) 基本不干扰，但是这一改变增加了自动化的难度。因此采用该法往往只好手一r 操作。 h l e 法在重氮胆红素生成后直接比色( 红色) ，手续简单，易于自动化是优点，但特 异性差，溶血样品的结果严重受扰。 由于重氮法历史悠久，医学上有关胆红素的各种论述均以本法为基础，因此它 在医学人员头脑中已形成了传统观念，构成了本法改革的严重障碍。本法存在许多 缺陷：首先是重氮试剂不稳定，它必须由亚硝酸钠和氨基苯磺酸临时生成，生成后 最多只能用2 天( 一般6 小时) ；其次是重氮试剂与间胆和直胆的反应特异性不佳， 在一定条件下测直胆，一部分间胆参与反应，如果反应时间延长，参与的更多，导 致测值的不准确；另外，由于溶血干扰导致测定结果准确性受到影响。 针对上述几点，1 0 0 多年来人们对此法进行了不少改良。在标准、“加速剂” 种类和其他方法学方面有不断创新和改进。f o s s a t i “2 ”1 等用稳定的联合试剂测定总 胆和直胆，该法中总胆的测定是在加速剂( 如咖啡因、尿素、枸橼酸、特殊的表面 活性剂) 的存在下进行；直胆的测定是在无加速剂存在下进行；两者均在5 7 0n m 读 数。测定6 胆红素时，先通过有机溶剂抽提与蛋白质可逆性结合的6 胆红素，然 后用重氮试剂法测定变性蛋白小粒中的6 胆红素，此时h b 对试验也无干扰。此法 适用于常规应用，也可引入自动分析仪。1 9 9 8 年国内学者张建新“4 1 在研究间胆在 j _ g 法直胆测定中的反应动力学的基础上，提出改良j - g 法直胆测定的数学校正。 该方法对胆红素标准血清和按制样品的分析结果与目标值十分一致，对样品的分析 与自动生化分析仪的分析结果高度相关，为血清直接胆红素的准确测定提供一个可 靠的方法，但计算方法过于烦琐，不适合推广。随着自动化要求的提高，国内医学 界这两年对改良3 - g 法应用于自动生化分析仪上研究较多“5 。“3 ，希望能够代替手动 操作。 目前多数实验室使用推荐的改良j _ g 法测定血清总胆红素，而用于直接测定直 接胆红素尚无推荐方法。如果本法操作繁复、试剂不稳定、反应不专一等问题得不 到解决，最终将会被其它方法所代替。 ( 2 ) 化学氧化法 化学氧化法测胆红素的渊源很早，7 0 年代就采用铁氰化钾除滴定法测钙时的胆 红素干扰。从理论上讲胆红素的四吡咯结构具有还原性，各种低分子的无机氧化剂 和在一定条件下具有氧化性的各种过渡金属元素都可以氧化胆红素，从而可用于测 定胆红素。但必须保证反应的专一性，还要周到地防止氧化反应的早、中、晚期可 能出现的干扰和副反应。总胆红素测定需要选择适合的氧化剂、反应促进剂、非特 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 异反应抑制剂、抗干扰剂：而结合胆红素的测定来在反应体系中还必需具有非结合 胆红素反应抑制剂和吸收剂。 近年国内外学者在这方面做了不少研究。1 9 9 3 年日本和光株式会社t o k u d a 率 先丌发钒酸氧化法测血清中胆红素“，1 9 9 8 年该试剂盒进入我国。国内许多学者均 对此法进行了评价“”2 ，认为此法试剂稳定，操作简单，容易自动化，而且特异性 好，结果较准确，较重氮法抗干扰能力强。2 0 0 1 年日本东洋纺绩株式会社又推出亚 硝酸盐氧化法，其与改良j g 法、钒酸盐氧化法相关较好，同时又弥补了钒酸盐氧 化法的某些不足，如个别干扰样品会出现直接胆红素比总胆红素高的现象，但溶血 样品对直胆测定有较明显干扰。与此同时，国内不少人也先后研究出过硫酸盐氧化 法、综合氧化剂法等。但从目前来看，国产试剂尚不理想，存在一定问题，尤其是 直接胆红素测定更为突出。 ( 3 ) 胆红素氧化酶法 胆红素氧化酶可催化胆红素氧化，生成胆绿素最终形成结构及性质尚不清楚的 紫色或无色化合物，根据吸光度变化可作胆红素定量测定。利用胆红素氧化酶专一 氧化胆红素的这一性质，可测定血清中胆红素含量，特异地区分血清中四种胆红素 含量( 即总胆、间胆、结胆、6 胆红素) ，其催化机理如图2 ： 臧卑roo蕈oor赋嘞丛瓣ch2ch3 h 3 c c h 3 2 控制在8 左右，同时使用阴离子表面活性剂s d s 和胆酸钠加速反应，这一方法实践 中反映尚可。测直胆的方法主要是将酶反应的p h 降到4 5 时，b o x 只与直胆起反 用酶法可测血清中胆红素的各种组分，依据b o x 在各种不同p h 中的活性反应可分 别测出总直胆，而且用酶和重氮法结合还可测b 。的浓度。1 9 8 8 年0 t s u j i 报告一种 新的测总、直胆酶法，其总胆测定效果也可以，直胆测定是把p h 降到3 7 ，并使用 c u s o t 作酶的促进剂，但该法也没有被推广。这以后对酶法测胆红素发表了一些不同 的意见。1 9 9 0 年i h a r a 等报告在新生儿光疗后的直胆测定中，酶法结果比重氮法明 显升高，经分析原因是光照后产生的光胆红素酶法可分解，因而测值偏高，而重氮 6 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 法则不同，这种假性升高可能导致临床e 鉴别新生儿的生理或病理性黄疸时发生混 乱。1 9 9 5 年n a k a y a m a l 提出在直胆测定中有些病人的酶法结果比重氮法明显偏低， 而总胆结果则是一致的。他用h p l c 方法找出其原因是产生了一种不完全氧化的产 物。这些问题的提出使酶法从9 0 年代初直到1 9 9 8 年间发展迟缓。1 9 9 8 年k u r o s a k a 等报导一种选择性测定结胆新的酶法，测结胆而不是直胆( 即不测bs ) 更适合临床应 用，并提出使用抑制剂在测结胆时避免问胆的参与o 。只测结胆、不测直胆的意见 一经提出，得到广泛响应。1 9 9 9 年8 月，美国d o u m a s 采用酶速率法测结胆的方法， 提出在p h l o 条件下b o x 只与结胆反应，间胆与胆红素不起反应，这样可排除6 胆 红素在临床上产生的干扰“。2 0 0 0 年日本m o r t m o t o 采用多种抑制剂和促进剂设计 了一种测定结胆的方法，并通过临床观察：这个新酶法测出的结胆与疾病的发展或 痊愈完全相平行。在此前后日本出现了众多的专利文献针对酶法测直胆方法学上 所存在的问题提出了大量的有效措施。 在国内，1 9 9 1 年刘宏。、王菊君。“、周永列。”等用胆红素氧化酶对胆红素进行 了测定，并与其它方法进行了对照。结果表明此法测定胆红素不但特异性高，且测 定线性范围宽，重现性好，操作简单，抗干扰性强，与其它方法有较好的相关性。 1 9 9 3 年房玉珠等报道在3 7 c ，p h i o 0 缓冲液中，将血清中结合胆红素受b o x 作用 氧化成无色化合物，然后按重氮化法直接测定6 胆红素，有效的将酶法和重氮法 结合起来。同年，卫生部临检中心与北京发酵工业研究所合作研制出了应用胆红素 氧化酶测定血清总胆红素和直接胆红素的试剂盒，一些医院的实验室已采用。1 9 9 4 年郭健等用此试剂盒测定血清结合胆红素，并以二牛磺酸胆红素作标准物，表明， 选用柠檬酸盐缓冲液效果最好，反应的最适p h 在5 。0 左右，此时反应有较好的特 异性，结果较重氮法准确。白峰等又将胆红素氧化酶法测定血清总胆红素试剂盒应 用于m o n a r c h 自动生化分析仪上，证明该法适于上机使用，方法简便，特异性佳。 虽然国内对此法的研究比较重视，但都停留在对该试剂盒的评价上“，在测定方 法也没有新的突破，技术水平仍然停留在日本8 0 年代末，还应继续研究，选用高 效热稳定的酶及其促进剂、抑制剂。 与其它方法相比较，胆红素氧化酶法有明显优势，它特异性强、灵敏度高、重 复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，操作简单，适用于自动化测定。但是胆红素 氧化酶成本昂贵，如果酶的来源、纯度、稳定性等问题得至0 解决，将有希望替代其 它方法，成为今后胆红素测定的常规方法。 总之，建立简便、快速、准确、灵敏、可靠的胆红素测定方法一直是临床实验 室和临床上所关注的问题。近十年来的进展已说明了这一点。随着生化技术的发展， 新的方法将不断出现，逐渐代替传统方法。 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和性质研究 1 4 胆红素氧化酶的研究概况 1 4 1 胆红素氧化酶的来源 自1 9 6 9 年b r o d e r s e nr 首次报道在猪脑中发现胆红素氧化酶活性”“，陆续 报道鼠肝、鼠肾和鼠小肠亦有胆红素氧化酶活性，然而其含量不高。1 9 8 1 年= _ 1 本学 者s m u r a o 和n t a n a k a ”。从微生物代谢产物中发现并制出电泳纯胆红素氧化酶， 1 9 8 2 年他们又报告了了疣孢漆斑菌m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 胆红素氧化酶的纯化 工艺和特性，为此酶的应用尤其在测定胆红素方面的应用铺平了道路。随后，国外 又有人先后从粗皮灵芝菌y r a c h y d e r m at s u n o d a e 、a g r i e u sb i s p o r u s ”“、淡紫青霉 菌p e n i c i i l i u mj a n t h i n e l l u m 8 哇i 发现- 了n t 酶。 b u r a o 等在研究胆红素方面做了大量工作。他们通过深层培养，比较了 m y r o t h e c j u m 属不同菌株的产酶能力，并分离得到了m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 菌株， 其产酶能力达2 0 u m l ，而同属不同种的菌株还不到1 u m l 。他们对产酶条件进 行了优化。研究结果表明，4 0 的马铃薯及1 葡萄糖为产酶最适培养基；菌丝在3 0 时生长最快，但2 5 。c 时产酶最多；在3 0 。c 以上只能产生少量酶，超过3 7 时几 乎不能产生；发酵培养9 6 h 产酶量最高，以后开始逐渐下降。 表2 不同菌种产酶能力比较 t a b l e 2y i e l do f d i f f e r e n tf u n g u s 国内，1 9 8 8 年我国卫生部临床检验中心与中国科学院微生物所协作成功地从疣 孢漆斑菌中分离和纯化出可供临床应用的胆红素氧化酶m 1 。1 9 8 9 年中科院沈阳应用 硕十论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 生态研究所的张淑贤、苏风岩等”筛选出一株产胆红素氧化酶活性较高的菌种露湿 漆斑菌一m y r o t h e c i u mr o r i d u m ，并对漆斑菌属、链霉菌属、弗兰克氏菌几个不同种 类微生物产胆红素氧化酶的能力进行了研究，结果如表2 。潘彬。、王菊君”参考 m u r a o 等前人的文献胆红素氧化酶进行了纯化，并对其性质做了研究。 虽然许多微生物都有产胆红素氧化酶的能力，但产酶能力相差很大，大部分天 然菌株的产酶活力很低，很难用于工业化生产，为此必须寻求选育高产菌株的途径， 其中一个最为简便易行、工作进度快和收效显著的方法就是进行诱变。胡军、杨军 艳“”对m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 结合紫外和化学方法做了诱变，使其产酶能力提 高了3 4 倍。 1 4 2 胆红素氧化酶组成和性质 胆红素氧化酶全酶由蛋白质、二价铜离子和部分碳水化合物组成。蛋白质由1 7 种氨基酸组成，其中不含半胱氨酸；赖氨酸和蛋氨酸含量较低，每个分子中不到1 0 个残基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量较高，每个分子中的残基数超过4 0 个。 光谱分析证明二价铜离子能与c y s 、m e t 、h i s 残基结合。y a s u m a s a 等“1 1 用抗坏血酸 和氰化钾除去胆红素氧化酶中的二价铜离子后，胆红素氧化酶失去活性。如分别加 入二价的钴、镉和铁离子后，脱辅基的胆红素氧化酶又不同程度地恢复了活性。可 知其氧化性能与金属离子密不可分。t a n a k a “”研究表明它对胆红素的催化反应是利 用分子氧作为电子受体，有水生成的氧化反应。y a s u m a s a 等进一步证明它的催化作 用是对于被束缚在蛋白质上的铜离子的二级反应，供体结构为c u s s n 。( s - c y s ，s + = m e t ，n ：h i s ) 类型，与铜蓝蛋白情况一样。 胆红素氧化酶的等电点为4 1 左右，纯品3 7 6 c 下稳定( p h 5 0 9 7 ) ，在存放 中，5 下p h 9 2 9 7 为最稳定，在催化胆红素氧化反应中，4 0 。c 反应速度最快， 当p h = 8 左右时为最适宜的酸碱度，米氏常数各文献报道相差很大，在4 6 5 1 9 0 u m o 几之间。文献报道的分子量有5 2 k d a 和6 8 k d a ，y u j is e k i “3 1 从y e n i c i l l i u m 台n t h i n e l l u m 分离出来的胆红素氧化酶分子量达2 0 0 0 k d a ，是由于金属离子使酶蛋 白产生了交联。 胆红素氧化酶对含有四吡咯的化合物有特异性反应，氰化钾、叠氮化钠和硫脲 物质抑制其反应。y u j is e k i “”认为金属离子中h g “对此反应有很强的促进作用，原 因是h g ”与底物结合，生成了一种更适合酶催化的中间物，c u ”、c o ”、n i2 + 对其有一 定抑制作用，其它离子无明显作用。 1 4 3 胆红素氧化酶的其它应用 胆红素氧化酶除了上述在临床检验上用于测定胆红素的含量，为黄疸生成的病 理分析提供详细的信息外，还可用来治疗黄疸疾病“1 。因为胆红素被氧化后，毒性 大大降低，在致畸形、致突变及细胞毒性实验中发现，当胆绿素及其氧化产物浓度 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 为人体正常情况下最大浓度6 0 倍时，仍未发现上述毒性作用。酶通过修饰可以提 高稳定性，降低在药物应用中的抗原性反应和延长半衰期，国外很多学者用聚乙二 醇“”“1 、琼脂糖”1 等修饰胆红素氧化酶，并用来清除动物血中过高的胆红素，取得 了一定的效果，但对于人体应用尚在进一步研究中。该技术一旦应用可望取代换血 法对黄疸的治疗，在临床上使危急状态的黄疸疾病得以缓解。另外，胆红素氧化酶 还可用于粪便的处理而不引起环境污染及制成合成洗涤剂用于婴儿尿布的清洗。 1 4 4 胆红素氧化酶的分子生物学研究进展 胆红素氧化酶目前作为诊断试剂上的应用，在热稳定性、酸碱耐受性和比活性 上应具备诊断试剂盒用工具酶的要求。国内虽然也有胆红素酶法测定试剂盒研究出 来并投入市场，但由于技术水平的限制，用户反应欠佳，尤其是直胆问题较多。而 国外试剂盒虽然效果相对较好，但价格昂贵。近年来，随着发酵工程和分子生物学 的发展，采用基因工程手段来提高酶的活性、改善酶的性质、降低酶的成本已经成 为可能，这应用到胆红素氧化酶上将使其大规模应用成为可能。 这方面研究较多的是日本。1 9 9 3 年s a t o s h ik o i k e d a 1 等测定了从m y r o t h e c i u r n y e r r u c a r i a 中纯化出来的胆红素氧化酶的部分氨基酸序列，并按照它设计了寡核苷 酸引物，从而通过p c r 扩增了e d n a 片断，然后分离出来。最后用这个e d n a 片断作 为探针，将胆红素氧化酶的基因从基因组文库中克隆出来，与其它铜蓝蛋白比较， 它的不同在于含有四个铜离子配体的结构域。将此基因在酵母菌中表达，最终获得 了具有活性的重组胆红素氧化酶，其分子量为6 0 k d a 表现出了与此基因的功能同 性。s t s u s h is h i m i z u “”则将胆红素氧化酶基因在米曲霉中表达，获得的重组酶蛋 白与原来的酶一样，都包含三类铜离子配体，但有所突变。通过吸光度分析突变三 类铜离子配体，进一步证明了铜离子配体对酶活的重要性。圆振二向色谱分析，其 二级结构与原酶相似。该酶的分子量为6 3 k d a ，酶活是原酶的8 0 ，可能由于它只 有两条n 端连接的糖链，而原酶还有一条0 端连接的糖链。2 0 0 3 年日本金泽大学的 t a k e s h i s a k u r a i “”又建立了胆红素氧化酶基因的巴斯德毕赤酵母p i a c h i a p a s t o r i s6 s 1 1 5 为宿主的新的表达系统，从而避开了在米曲霉中表达的不足。重组 的新酶具有与原酶一样的较高酶活，但原子吸收光谱反映出两者铜离子配体有所差 异。 胆红素氧化酶基因的克隆为我们进一步了解酶的结构和功能位点提供了有力 的工具。一系列表达系统的建立，给获得高质量的有商业价值的重组胆红素氧化酶 提供了广阔前景，从而为胆红素氧化酶的进一步应用成为可能。 1 。5 本课题的研究思路和意义 本课题旨在确立一套比较简便可行的分离纯化工艺，从露湿漆斑菌中分离出胆 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 红素氧化酶，并通过性质研究讨论其作为诊断试剂盒工具酶应用上的可行性和优缺 点。 基于前人在最佳产酶发酵条件上已做了大量工作，各文献中所探讨的条件也比 较统一，结合本课题的研究目的，本课题参照前人的发酵条件，只对发酵条件中时 间参数进行研究。 目前为止，分离纯化胆红素氧化酶一直沿用m u r a o 等的步骤，包括( 1 ) 硫酸 铵沉淀；( 2 ) 两次活性碳吸附处理；( 3 ) q a e s e p h a d e x 5 0 柱层析；( 4 ) s e p h a d e x g 一1 0 0 凝胶层析。此步骤比较繁琐，为简化操作步骤，在不影响产率的前提下，对此分离 的技术路线进行了改进。 对于胆红素氧化酶的性质研究，虽然很多文献都有报道，但是差别很大，而且 并不全面，这在很大程度上限制了胆红素氧化酶的应用。本课题在分离出胆红素氧 化酶后，将对其性质作详细研究，讨论其在诊断上的可行性。 此外鉴于所购菌株产酶能力较弱，在参考前人的基础上，尝试使用紫外诱变菌 株，选育出产酶能力高的菌株，为胆红素氧化酶的进一步研究和应用打下基础。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 生化试剂 考马司亮兰r 一2 5 0 三羟甲基氨基甲烷( t r i s l 丙烯酰胺、双叉丙烯酰胺 牛血清白蛋白( b s a ) 蛋白质标准分子量 胆红素 葡聚糖s e p h a d e x g 一1 0 0 2 1 2 其他化学试剂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 南京生兴公司 南京生兴公司 f l u c k 公司 a m e r s h a m 公司 其他化学试剂均为国产分析纯。 2 1 3 常用溶液及配法 ( 1 ) p h 为8 1 的0 0 5 m o l l 的三羟甲基氨基甲烷盐酸( t r i s h c i ) 缓冲液，称取 0 6 0 5 7 9 z 羟甲基氨基甲烷稀释至5 0 m l 的重蒸水配成l m o l l 的三羟甲基氨基 甲烷溶液，加入o 2 6 2 m l 的浓盐酸，加重蒸水至1 0 0 m l 。 ( 2 ) 取胆红素2 m g ，加入0 5 m l 甲醇混匀，逐渐加入0 5 m l 0 2 m o l l n a 2 c 0 3 溶解， 一1 8 。c 避光保存( 3 天有效) 。 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 ( 3 ) s d s p a g e 加样缓冲液，称取1 5 9 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ，加入到8 4 m l 水 中，用浓盐酸小心将p h 调至6 8 ，再加入4 0 9 甘油和o 0 2 9 溴酚兰以及6 m l 的2 一巯基乙醇。 ( 4 ) 分离胶缓冲液，称取1 8 2 9 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ，0 4 9s d s ，溶解在9 0 m l 重蒸水中，用浓盐酸调p h 至8 8 ，加重蒸水至1 0 0 m l 。 ( 5 ) 浓缩胶缓冲液，称取6 ，0 9 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ，o 4 9s d s ，溶解在8 0 m l 重蒸水中，用浓盐酸调p h 至6 8 ，加重蒸水至1 0 0 m l 。 ( 6 ) 电极缓冲液，称取3 0 3 9 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ，1 4 4 9 甘氨酸和1 0 9 s d s ， 溶解在1 l 的重蒸水中，室温存放，用前用重蒸水作1 ：1 0 稀释。 ( 7 ) 0 1 考马司亮兰染色液，称取0 5 9 考马司亮兰r 一2 5 0 ，溶解在2 5 0 m i 的甲醇 中，后加入去离子水2 0 0 m l 、冰醋酸5 0 m l 。 ( 8 ) s d s p a g e 电泳脱色液，甲醇1 0 0 m l 与醋酸7 5 m l 以及8 2 5 m l 的去离子水。 ( 9 ) 3 0 丙烯酰胺贮液：称取丙烯酰胺3 0 9 ，双叉丙烯酰胺0 8 2 9 ，溶解在重蒸水 中，于4 。c 保存。 ( 1 0 ) b r a d f o r d 储存液 1 0 0 m 1 9 5 乙醇 2 0 0 m 1 8 8 磷酸 3 5 0 m g 考马司亮兰g - 2 5 0 ( 1 1 ) b r a d f o r d 工作液 4 2 5 m l 双蒸水：1 5 m 1 9 5 乙醇；3 0 m 1 8 8 磷酸；3 0 m l b r a d f o r d 储存液。滤纸过滤， 保存于室温棕色瓶中。用时过滤。 2 1 4 仪器设备 ( 1 ) 手提式蒸汽灭菌锅( y x q s g 4 1 2 8 0 ) ：上海医用核子仪器厂 ( 2 ) 水平单向流工作台( s w - c j i b ，s w - c j - i c ) ：苏净集团苏州安泰空气技术公 司 ( 3 ) 电热恒温水浴箱( h w w 2 1 ) ：北京市长风仪器仪表公司 ( 4 ) 气浴恒温震荡器( 7 0 0 x 4 7 0 x5 0 0 ) ：常州国华电器有限公司 ( 5 ) 水平凝胶电泳装置( 包括凝胶灌制平台、样品梳) ：北京市六一仪器厂 ( 6 ) 台式高速离心机：上海安亭科技仪器厂 ( 7 ) 酶联检测仪( 5 5 0 型) ：美国b i g r a d 公司 ( 8 ) 便携式p h 计( m p 一9 0 0 0 ) ：上海艾旺工贸有限公司 ( 9 ) 混合纤维树脂微孔滤膜( 0 2 2 r u n ) ：上海新亚净化器件厂 ( 1 1 ) 精密电子天平( b s 2 1 0 s ，b s 4 0 0 0 s ) ：北京赛多利斯天平有限公司 ( 1 2 ) t s l 0 0 脱色摇床：北京新技术应用研究所 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 2 15 菌种来源 所用菌种为本实验室所保存的露湿漆斑菌。 2 2 方法 2 2 1 培养基的制作 ( 1 ) 平皿培养基的制作： ( a ) 称取一定量土豆，去皮切成薄片。 ( b ) 煮沸3 0 r a i n ，用纱布过滤得土豆汁，加水稀释至2 0 的土豆含量，加入2 的葡萄糖和2 的琼脂。 ( c ) 加热，使琼脂完全溶解。 ( d ) 高压灭菌。 ( e ) 在无菌条件下倒入灭过菌的平皿，冷却保存。 ( 2 ) 发酵培养基的制作： 用上述方法制成2 0 的土豆汁，加入0 2 5 葡萄糖，0 2 5 蛋白胨，自然p h 值 ( 约6 ) ，高压灭菌，待用。 2 2 2 培养方法 ( 1 ) 固体培养： 菌种转接于固体培养基( 斜面或平皿) 上，于2 8 培养箱培养。 ( 2 ) 发酵培养： 从斜面培养基上挑取菌体转接于发酵培养基内，1 5 0 r m i n ，2 8 摇床培养。 2 2 3 胆红素氧化酶的酶活测定 参照文献“，取胆红素2 0 m g ，先加入0 5 m l 甲醇混匀，逐渐加入 0 5 m l 0 2 m o l l n a 。c 0 。溶解，一1 8 。c 避光保存( a 液，3 天有效) 。在3 m l0 0 5 m o lp h 为8 1 的t r i s h c l 缓冲液加入a 液3 0 ul ，混匀，做两份，一份加入3 0 ul 酶液， 另一份加入于3 0ul 灭活酶液作空白对照，同时于3 7 。c 恒温箱保温1 0 m i n ，在光度 计上4 5 0 n m ( 胆红素的最大吸收波长) 处测定1 0 m i n 前后吸光度的变化值，算出每 分钟的下降率a a m i n ，按下式计算酶活力单位： 活力单位( o m l ) = a a m i n 反应总体积( m l ) 1 8 加酶量( m l ) 定义1 个酶活力单位定义为1 分钟内胆红素氧化酶氧化1pm o 胆红素所需的 酶量。 2 2 4 胆红素氧化酶的分离纯化 菌种发酵培养后的培养液用尼龙网过滤，或3 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 去菌体，都 得到棕黄色透明清液用于分离纯化。分离纯化步骤为盐析、层析、透析脱盐浓缩和 s d s p a g e 等。具体如下： 硕士论文胆红索氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 ( 1 ) 盐析饱和度的确定 a 将得到的去菌体发酵液分装至3 支离心管中，每管4 m l 。 b 分别加入硫酸铵至3 支离心管中的硫酸铵饱和度分别为5 0 、6 0 、8 0 。在加 硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的摇晃离心管使硫酸铵完全溶解。 c4 静置于过夜 d 离心，分别取三支离心管中的沉淀后用0 i m o l l 的p h 为9 2 的n a 。c o 。n a h c o 。 缓冲液溶解，离心弃不溶物，测量沉淀溶液的酶活性。 通过测量酶活性得出：5 0 盐析得到胆红素氧化酶沉淀没有酶活性，6 0 只有 很少活性，8 0 饱和度的有较高的酶活，三支管中都有很多不溶于n a ：c o 。一n a h c 0 ， 缓冲液的杂蛋白，故盐析时先将硫酸铵加到饱和度为5 0 ，去大部分杂蛋白，然 后再将饱和度调到8 0 。 ( 2 ) 盐析 去菌体发酵液用( n h 。) 。s o 。盐析沉淀，在磁力搅拌器上边搅拌边缓慢加入， 以防局部盐度过大变性。先加( n h 。) ：s o 。至饱和度5 0 ，充分搅拌使( n h 。) 。s o 。 全部溶解，放入4 冰箱静置过夜。3 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，上清液再加入( n h 。) ：s o t 至饱和度为8 0 ，离心后的沉淀用0 i m o l l 的p h 为9 2 的n a 。c o 。一n a h c o 。缓 冲液溶解，1 0 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，收集上清液，弃未溶解的沉淀物。 ( 3 ) 透析脱盐浓缩 a 透析袋的处理 a 将透析袋剪成合适的长度。 b 在一只2 5 0 m l 玻璃烧杯中加入2 0 0 m l 的2 碳酸氢钠和o 0 0 0 2 9 的e d t a 。 c 将透析袋装入其中，煮沸l om i n 。 d 用蒸馏水彻底洗涤。 e 放入蒸馏水中煮1 0m i n 。 f 冷却后4 c 存放，存放过程中透析袋应完全放入水中。 g 使用前用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。 b 透析 将盐析得到的酶液装入透析袋中，扎紧置于装去离子水的烧杯，水越多越好， 放入冰箱，每隔2 3 小时换水，透析后的水用钡盐检测s 0 4 2 。，直至检测不到为 止，然后在聚乙二醇- 1 0 0 0 0 中脱水浓缩获得粗酶液。 ( 4 ) 层析 a 根据s e p h a d e xg 一1 0 0 ( 葡聚糖凝胶) 溶胀系数为1 5 2 0 m l g 干凝胶，柱体积为 0 8 c m x 3 0 c m ，称取1 5 9 s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶干粉。 b 在室温下，5 0 0 m l 的0 1 m o l l 的p h 为9 2 的n a 。c 仉- n a h c o 。缓冲液中，溶涨4 8 h ； 硕士论文胆红素氧化酶的分离纯化和酶的性质研究 然后缓缓将缓冲液用吸管吸出后重新加入相同缓冲液。 c 将浓胶状的凝胶缓慢倾入柱中，直到凝胶沉集稳定，凝胶柱不能有气泡产生， 否则必须重装柱。 d 用2 - 3 倍床体积的缓冲液过柱平衡。 e 用0 1 的溴酚蓝溶液过柱以检验柱子的均一性，如色带没有呈均匀下降，则需 要重新装柱