（微生物学专业论文）酵母青霉互作产红色素研究.pdf

摘要 作为食品添加剂的天然色素品种多样、原料丰富、有益健康、绝大多数无副作用， 安全性高。目前，我国色素生产与国外色素生产相比，普遍存在成本较高，提取效率较 低的现象；许多色素研究工作只停留于书本理论知识，投入实践生产的比例较小；在植 物色素资源开发利用当中，许多单位只注重开发，不注重保护，致使资源枯竭。因此开 发新型的天然色素，是色素行业发展的首要问题。 本研究从产红色素的混合菌群中分离出2 株茵( h s 0 7 a 和h s 0 7 b ) ，经过培养试验 得知两菌混合培养发酵才能产生红色素，而单独培养任何一株菌，均不能产生红色素。 依据其形态、生理生化特性及r d n a 片段测序同源性分析，结果表明h s 0 7 a 属于半知 菌亚门( d e u t e r o m y c o t i n a ) ，芽孢菌纲( b l a s t o m y c e t e s ) 、隐球酵母目( c r y p t o c o c c a l e s ) 、 隐球酵母科( c r y p t o c o c c a c e a e ) 、假丝酵母属( c a n d i d ab e r k h ) 、热带假丝酵母( c t r o p i c a l i s ) ；菌株h s 0 7 b 青霉属( p e n i c i l l i u m ) 。 将两个菌种单独接种和交叉划线接种培养，结果在划线平板上两菌交叉生长部位沿 青霉菌( h s 0 7 b ) 菌丝生长的方向上产生红色素。此外，以查氏培养基为基础，做营养 限制实验，当c 源为1g l 时，单独培养青霉菌也可产生红色素，且该红色素和混合产 生的红色素为同种色素，判定红色素是由青霉菌产生的。进一步将h s 0 7 a 和h s 0 7 b 与 其他已知酵母和霉菌两两按酵母一霉菌混合接种培养，结果只有h s 0 7 a 和h s 0 7 b 的混 合产生红色素，其它组合不产生红色素。进行滤膜隔离培养实验，上清滤液互加实验， 可以看出，色素的产生并不是因为菌体接触和代谢产物相互作用产生的；追加还原糖实 验，得出红色素的产生和培养基中还原糖的含量有关。 紫外一可见分光光度计全波段扫描提取得到的色素，确定色素最大吸收峰为5 1 0 n m 。将提取的红色素进行梯度稀释，于5 1 0 n m 波长测量吸光度，建立吸光度( a ) 与色 素浓度( c ) 关系曲线c ( m g m l ) = 1 4 4 9 4 a + 0 0 1 2 1 ( r 2 = 0 9 9 9 8 ) 。该红色素性质分析 得知可为水醇等多种溶剂溶解，其抗氧化，抗紫外照射能力，热稳定性，抗酸碱性均较 强。是一种具有开发利用的潜能的色素。 对该两株菌混合发酵条件进行优化后，得出5 0 0 m l 三角瓶装量6 0 m l 培养基、2 9 、 1 6 0 r p m 、初始p h = 5 、接种比例1 ：1 和先接种h s 0 7 b 培养7 h 后再接种h s 0 7 a 混合培 养，能够产生更多的色素，比优化前提高了1 5 。并进行1 5 l 发酵罐的放大试验，结果 在总发酵6 2 h 分离提取色素，色素产量达到最大为6 1 9 m g m l ，比摇瓶水平提高将近一 倍，时间缩短1 0 6h 。表明采用h s 0 7 a - - h s 0 7 b 二元培养生产红色素是一种有效的方法， 该二元发酵系统的建立为该色素的开发利用奠定了基础。 此利用微生物发酵的方法生产红色素，弥补了利用植物提取色素方面资源限制的问 题，并且该方法简洁、高效，不受季节、地点的限制，成本低。为色素的开发和其他发 酵生产提供一些参考。其具体色素产生原理和色素成分分析还在进一步研究之中。 关键词：热带假丝酵母，青霉，红色素，共培养 a b s t r a c t n a t u r a lp i g m e n t sa sf o o da d d i t i v e sw e r er a wm a t e r i a l s ，r i c hi nh e a l t h ，m o s to fs a f e t ya n d n o n s i d e - e f f e c t s a tp r e s e n t ，p i g m e n tp r o d u c t i o nw a s h i 【g hc o s to fe x t r a c t i o na n dl e s se f f i c i e n t c o m p a r e dt of o r e i g nc o u n t r i e s ；m a n yp i g m e n tr e s e a r c hw e r eo n l yt h e o r e t i c a lk n o w l e d g e ，a s m a l l e rp r o p o r t i o nu s e di np r o d u c t i o n ；m o s to fp l a n tp i g m e n t sr e s e a r c hw h i c ho n l yf o c u so n t h ed e v e l o p m e n t ，a n dd on o tp a ya t t e n t i o nt ot h ep r o t e c t i o n ，r e s u l t i n gi nt h ed e p l e t i o no f r e s o u r c e s t h e r e f o r et h ed e v e l o p m e n to fn e wn a t u r a lp i g m e n t si st h ep r i m a r yp r o b l e m i nt h i ss t u d y , t w os t r a i n sh s 0 7 aa n dh s 0 7 bw e r ei s o l a t e df r o mr e dp i g m e n tp r o d u c t e d m i x t u r e ，as p e c i a lp h e n o m e n o nw a sr e v e a l e dt h a tr e dp i g m e n t sw e r ep r o d u c e di nt h ec o c u l t u r e p r o c e s so fh s 0 7 aa n dh s 0 7 b a c c o r d i n gt ot h e i rm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dr d n as e q u e n c eh o m o l o g yf r a g m e n ta n a l y s i s ，r e s u l t ss h o w t h a th s 0 7 aw a si d e n t i f i e da sas p e c i e so f c t r o p i c a l i 金, h s 0 7 bs t r a i nw a sas p e c i e so f p e n i c i l l i u m s e p a r a t et h et w os p e c i e sa n dc r o s s l i n ei n o c u l a t i o nt r a i n i n g ，t h er e s u l t ss h o w e dt h er e d p i g m e n tp r o d u c e da l o n gt h eg r o w t ho fh s 0 7 bm y c e l i a lg r o w t h i na d d i t i o n ，b a s e do n r i c h a r d sm e d i u ma n dn u t r i e n tl i m i t a t i o ne x p e r i m e n t s ，w h e nc u l t u r e dh s 0 7 b b yc s o u r c ef o r l g lc o u l dp r o d u c er e dp i g m e n tw h i c hw a sm i x e dc u l t u r er e dp i g m e n t ，s h o w e dt h er e d p i g m e n t sw e r ee x c r e t e db yp e n i c i l l i u m ( h s 0 7 b ) f u r t h e rs t u d i e sh a v es h o w nt h a to t h e r b a c t e r i aa n dt h ef i l t r a t eh s 0 7 ac a nn o tc a u s e dh s 0 7 bt op r o d u c er e dp i g m e n t ，r e dp i g m e n t w a sn o tp r o d u c e db yc e l lc o n t a c to fh s 0 7 aa n dh s 0 7 b a d dr e d u c i n gs u g a rt e s t ，r e d p i g m e n t sp r o d u c t i o nw a sd u et ot h er e d u c i n gs u g a rc o n t e n to f m e d i u m t h ep i g m e n tm a x i m u m a b s o r p t i o np e a k w a sd e f i n e d51 0 n m b y u v - v i s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e rs c a n n i n g a n dt h er e l a t i o n s h i pc u r v eb e t w e e nr e dp i g m e n tc o n c e n t r a t i o n a n d5 1 0 n mw a v e l e n g t ha b s o r b a n c ew a se s t a b l i s h e do f c ( m g m l ) = 1 4 4 9 4 a + 0 0 1 2 1 ( r z = o 9 9 9 8 ) t h er e dp i g m e n tc h a r a c t e r i s t i c sa n a l y s i ss h o wt h a ti tw a saa l c o h o l - s o l u b l e ， w a t e r - s o l u b l ee t a l ，a n di t sa n t i o x i d a t i o n ，u ve x p o s u r ec a p a c i t y , t h e r m a ls t a b i l i t y , a c i da n d n l a l k a l i n er e s i s t a n c ea r es t r o n g t h ep i g m e n t sf o rt h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o nh a v eal a r g e p o t e n t i a l o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft w os t r a i n s ，t h er e s u l t ss h o ww h e nq u a n t i t y 6 0 m lm e d i u mi n5 0 0 m lt r i a n g l e ，2 9 。c ，1 6 0 r p m ，i n i t i a lp h = 5 ，a g a i n s tt h er a t i oo f1 ：1a n d c u l t u r e dt o7 ha f t e ri n o c u l a t i o nh s 0 7 bt h e ni n o c u l a t i o nh s 0 7 am i x e dc u l t u r e ，i n c r e a s e d m o r e1 5 p i g m e n tp r o d u c t i o nt h a nf o r m e r 1 5 lf e r m e n t o rt e s t s ，i tw a sf o u n dt h a t f e r m e n t a t i o nt i m ew a ss h o r t e n e dt o6 2 hf r o m1 6 8 ha n dt h ey i e l do fr e dp i g m e n t sr e a c h e d 6 1 9 m g m l s h o wt h a tt h ec o - c u l t u r ea b o u th s 0 7 a - h s 0 7 bp r o d u c t i o no fr e dp i g m e n ti sa n e f f e c t i v em e t h o do ff e r m e n t a t i o no ft h eb i n a r ys y s t e m t h i sm e t h o do fu s i n gm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o np r o d u c t i o no fr e dp i g m e n ti ss i m p l e ， e f f i c i e n t ，f r o mt h es e a s o n ，s i t ec o n s t r a i n t s ，l o wc o s t ，a n df o rt h ed e v e l o p m e n to fp i g m e n t p r o d u c t i o n ，o t h e rf e r m e n t a t i o nt op r o v i d er e f e r e n c e h a v eas p e c i f i cp r i n c i p l eo fp i g m e n ta n d p i g m e n tc o m p o s i t i o na n a l y s i ss t i l lf u r t h e rs t u d y k e y w o r d s ：c t r o p i c a l i s h s o t a ；p e n i c i l l i u m s p h s 0 7 b ：r e dp i g m e n t ：c o c u l t u r e i v 主要符号表 i x 独创性声明和论文使用授权说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 穆究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 7 至发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：师签名：亟l ! 堕日期：兰竺翌：互! 三 5 9 前言 1 前言 1 1 天然色素的分类、结构和性质特点 色素作为食品添加剂在食品工业中应用，对于食品制造企业和消费者来讲都是决定 加工食品可接受性的一个重要因素f 1 1 。食品色素分为合成色素和天然色素两大类。人工 合成色素主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料合成，因其色泽鲜艳、着色力强、 性质稳定和价格便宜等优点，过去在食品加工行业被普遍使用。研究表明几乎所有的合 成色素不能向人体提供营养物质，反而大多会危害人体健康。因此多种合成色素被禁止 或严格限量使用 2 1 。世界上使用的合成食品色素最多时达1 0 0 多种，现在已大部分被禁 用，例如美国1 9 6 0 年被准许使用的合成色素为3 5 种，现在为7 种；我国目前被允许作 用的合成色素有6 种；挪威禁止在食品中使用任何合成色素。与合成色素相比，天然色 素最大的优点是相对安全性较高，有的还具有营养保健效应【3 1 。随着生产技术和性能的 提高，天然色素市场快速增长。如日本允许使用的天然色素己9 7 种，中国4 8 种，欧洲 4 3 种，美国3 0 种。 1 1 1 天然色素的分类和结构 进入2 1 世纪，天然色素己成为国际市场的主导，正以每年1 0 的速度增长。天然 色素种类越来越多，按其来源主要分为植物色素、动物色素、微生物色素三类。植物色 素存在于植物的根、茎、叶、果实以及种子中的色素【4 】。这类色素包括紫草色素、甜菜 红、姜黄、红花黄、叶绿素铜钠、越橘红、辣椒红、辣椒橙、栀子黄、菊花黄、黑豆红、 高梁红、玉米黄、萝卜红、可可壳色素、玫瑰茄红、肛胡萝b 素【5 】。其中应用于食品的 主要是甜菜红、姜黄【6 j 。动物色素由动物产生的色素。如含在肌肉和血液中的血红素， 含在虾、蟹表皮中的虾红素和虾黄素，以及紫胶虫和胭脂虫等寄生昆虫分泌的紫胶色素、 胭脂色素等，应用较多的是胭脂色素。微生物色素来源于大型真菌如担子菌、子囊菌、 丝状真菌、酵母和细菌。其中已广泛使用的是红曲色素i z 剐。红曲色素是我国传统使用 的天然色素，由接种在米上培养的红曲霉制取；它包括至少六种不同成分，含红、黄、 酵母青霉互作产红色素研究 紫色素各两种，而实际应用的主要成分是两种醇溶性色素，即红斑素和红曲红素。 胡萝b 素类天然色素是一类重要的食用色素，由于它们具有食品着色剂和营养增补 剂的双重功效，因而被广泛用作饮料、食品及饲料添加剂。近年来，国内外胡萝b 素在 食品工业中一直处于供不应求的状态。此类色素结构复杂，种类多样，按结构可分为以 下几类： ( 1 ) 类胡萝b 素类，为多烯类色素，是由异戊二烯残基为单元组成的共轭双键相 连为基础的一类色素。由于这类色素分子中都含有一个较长的共轭体系，有吸光特性， 因此可呈黄、橙、红甚至紫的颜色【9 】。它们广泛分布于生物界中，目前已发现的类胡萝 b 素就有6 0 0 多种。类胡萝b 素按其组成和溶解性质可分为两类：胡萝b 素类，此类 色素结构中含有大量共轭双键，如番茄色素，a 、b 、y 胡萝b 素等( 见图1 - 1 ) ；叶黄 素类，此类色素是共轭多烯的含氧衍生物，辣椒红素、玉米黄素、叶黄素等( 见图1 2 ) 都是此类色素。 图1 - 1 番茄红素( 胡萝i 、素类) 图l - 2 辣椒红素( 叶黄素类) ( 2 ) 花青素类，具有2 苯基苯并吡喃阳离子( 即花色基元) 基本结构的一类天然 色素配糖物( 见图1 3 ) ，广泛存在于植物的花、果实、根、茎、叶中，是各种花色苷的 总称【9 o l 。据初步统计，2 7 个科，7 2 个属植物均含花青素。大多数花青素在花色基元 的3 ，5 ，7 碳位上有取代羟基。由于b 环各碳位上的取代基不同( 羟基或甲氧基) ，形 成了各种各样的花青素。现在己知的有2 0 多种，一般为六种花青素即天竺葵色素、矢 车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素及锦葵色素的衍生物。自然界中很少见有 游离的花青素，它通常与糖通过糖苷键形成花色苷。己知天然存在的花色苷有2 5 0 多种， 有的植物只有一种( 如黑莓) ，而有一种葡萄中含有2 1 种【1 1 1 2 1 。 2 前言 r1 r 4 r 2 图1 - 3 花青素的基本结构 ( 3 ) 黄酮类色素，是以2 苯基苯并吡喃酮为基本结构，以苷的形式广泛分布于植 物组织中的一类天然色烈1 3 _ 4 】。多呈浅黄色乃至无色，少数为鲜亮的橙黄色。一般黄酮 类化合物( 如图1 4 ) 根据c 环的结构分类，主要是以六元的c 环的氧化状况和b 环所 连接的位置不同为依据可分为：黄酮及黄酮醇类，如芹菜素；双黄酮类，如银杏素；二 氢黄酮及二氢黄酮醇类；查耳酮类；黄烷醇类，如儿茶素；异黄酮类，如葛根素；其它 黄酮类，如异芒果素等等。其中黄酮和黄酮醇是植物界分布最广的黄酮类化合物，广泛 存在于疏菜、水果以及中草药中，目前己知的这类色素有4 0 0 余种。 r 5 r 4 r2o 图1 4 黄酮类基本结构 ( 4 ) 吡咯类色素，主要包括叶绿素及其铜钠盐、锌钠盐。叶绿素是一原子镁和四 个叶啉环构成的化合物( 见图1 5 ) 【1 5 l 。广泛存在于高等植物的叶、果实和藻类中，和 蛋白质形成叶绿体，是绿色植物中绿色的来源，也是植物进行光合作用所必需的催化剂， 常见的有蚕纱、苜蓿、菠菜、玉米穗丝、萝卜叶、三叶草、雏菊、甘蓝、竹叶、松针叶 等。叶绿素的稳定性较差，特别是对光和热敏感，其结构中的一原子镁很容易被其它酸 所代替，使叶绿素绿色消失而变黄，生成脱镁叶绿素，而脱镁叶绿素又很快和其它金属 离子如铜、锌等起反应，反应后金属离子进入镁的位置，叶绿素再次呈现绿色，所以叶 绿素多制成其铜钠盐、锌钠盐，以增强其稳定性，而且更易保持叶绿素的颜色，天然形 式的叶绿素及其化学改性后的铜盐色泽各不相同，反映在不同化合物中其最大吸收波长 3 酵母青霉互作产红色素研究 也不一样，叶绿素a 、b 的最大吸收为6 6 0 n m 、6 4 3 n m ，而叶绿素铜钠色泽更绿一些，最 大吸收波长为5 6 5 m n 。 图1 - 5 叶绿素( a b ) 基本结构 ( 5 ) 其它色素，结构不同于前面四类色素，主要包括红曲色素、姜黄色素和紫草 色素等类色素1 1 2 l 。其中红曲色素来源于微生物，是红曲霉菌丝所分泌的产物，有六种不 同的成分( 见图1 6 ) ，其中有橙红色色素、黄色色素和紫色色素各两种。不同菌种分泌 而得到的红曲色素，组成不同。 4 r = c 潮1 | 缎魔短色囊 r - = c , i i ，瓿馥磊级囊 r o 级陶鬃 赞鳜睹豢 o r o 红麓鲵精殷 红翦焉缀簸 图1 - 6 红曲色素的六种成分 姜黄色素是从多年生草本植物姜黄的根茎中提取并具有二酮结构的一种黄色色素 ( 图1 7 ) ，有辛辣味，呈鲜艳的黄色，是最有开发价值的天然色素之一【1 6 1 。 图1 7 姜黄色素的结构 此外，按天然色素色调大致分为三个序列，即红紫系列，黄橙系列和蓝绿色系列； 帮 前言 按其溶解性可分为水溶性和脂溶性两类。水溶性天然色素广泛用于配置饮料、冷饮、果 汁、糖果、罐头、酱制品等。脂溶性色素可用于高脂食品，如蜜饯、糕点、乳制品、肉 及肉制品、冰淇淋等的着色。 1 1 2 天然色素的性质 天然色素成分复杂，化学结构不一，依据主要成分化学结构的不同，天然色素的性 质也不尽相同。 ( 1 ) 多酚类衍生物。多酚类衍生物主要为花青素、花黄素、儿茶素和蹂质类，是 植物中水溶性色素的主要成分，在自然界中广泛存在。现己知有2 0 余种。但在食品中 重要的仅有6 种，即天竺葵色素( p g ) 、矢车菊色素( c y ) 、飞燕草色素( d p ) 、芍药色 素( p n ) 。牵牛花色素( p t ) 和锦葵色素( m v ) 。如表1 - 1 所示f 1 7 1 。花青素作为一种天然 食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定的营养和药理作用，在食品、化妆品、 医药方面有着巨大的应用潜力【1 7 1 ，是许多果汁、果酒、果酱和果脯理想的红色素。尽管 如此，花青素也和其它天然色素一样，由于化学性质不稳定、难于纯化和染色力弱等原 因，在很大程度上还不能将其大量的用之于商业性食品着色。 表1 1 食品中常见的6 种花青素 t a b l e1 - 1c o m m o na n t h o c y a n i n si nf o o d s ( 2 ) 色烯类。这类着色剂分子中有共轭双键结构，主要存在于植物中，如蔬菜， 黄红色水果及其它绿色植物中。在动物中亦存在，如卵黄、羽毛、甲壳等。其主要包括 辣椒色素、胭脂树橙色素、类胡萝卜素( 番茄红素即属于此类) 等。此类色素多属脂溶 性物质，常用于油质食品的着色。这类色素耐光性及耐热性较差。 ( 3 ) 叶啉类。这类色素分子是由四个吡咯环的a 碳原子通过次甲基( c h = ) 相 连而成的复杂共轭体系( 即叶啉) 。四个吡咯环中间的空隙里结合不同的金属元素形成 不同色素。主要有叶绿素和血红素。游离叶绿素很不稳定，对光和热均敏感，在稀碱液 5 酵母青霉互作产红色素研究 中可皂化水解为颜色仍保持鲜绿色的叶绿酸，叶绿醇及甲醇，在酸性条件分子中的镁原 子可为氢原子取代，生成暗绿色至绿褐色的脱镁叶绿素，在适当条件下。分子中镁原子 可为钡原子、铁原子、锌原子取代，其中以叶绿素铜钠的色泽最佳、对光和热较稳定， 是在食品中常使用的绿着色剂。 ( 4 ) 黄酮类色素。属于水溶性色素，常为浅黄色，比较重要的有圣草素、橙皮素、 红花黄等。黄酮类色素分子是由苯并吡喃酮与苯环构成，其基本结构如下： 4 口 属于此类色素的有黄酮、黄酮酸、黄烷酮、黄烷酮醇，此类色素分布于植物的花、果、 茎、叶中，在自然界中常见的黄酮色素是芹菜素、橙皮苷、皂草苷、芸香苷等。 ( 5 ) 酮类衍生物。属于酮类衍生物的主要是两种：红曲色素和姜黄素。红曲是我 国传统发酵产品。红曲色素来源于微生物，是红曲霉的菌丝所分泌的色素。红曲色素有 多种色素成分组成，其中红色色素、黄色色素和紫色色素各两种【1 8 l 。红曲色素耐光性差， 添加氨基酸反应物可防止光退色作用。红曲色素对热有稳定性，对蛋白质染色性良好， 常应用于多种食品的着色同。 1 1 3 天然食用色素具有以下特点 天然食用色素与合成食用色素相比具有以下特点： ( 1 ) 天然食用色素来源于植物组织，有较高的安全性。 ( 2 ) 很多天然食用色素中含有大量的人休必需的营养元素，有的本身就是一种维 生素( 如核黄素) 或具有维生素活性的物质，如b 一胡萝卜素【1 9 ，矧、花色苷【2 1 1 ，兼有营 养、保健的功效。 ( 3 ) 很多天然食用色素具有一定的药理功效，如铜叶绿素钠能治疗肝炎、胃炎、 肾炎、贫血等病症。 ( 4 ) 天然食用色素为食品着色，色调比较自然，接近大自然色泽，给人舒适，爽 心悦目。 6 前言 ( 5 ) 大部分天然植物色素耐热、耐光、耐盐、耐金属、耐微生物性能较差，随着 p h 的变化，稳定性也不相同，色调会发生变化。 ( 6 ) 天然植物色素的染着性较差，不易染着均匀。 从对人体安全方面考虑，使用天然食用色素对人类和对环境最安全、理想，有利于 人类生存和环境的良性循环，更有利于可持续发展。对使用天然食用色素的缺陷，人类 可以通过研究逐步加以改善。 1 2 丝状真菌色素国内外研究现状 1 9 世纪中叶前，人类的化学水平还很不发达，不存在合成色素，人们都是用天然色 素着色，如我国古代人们就利用红曲色素来制作红酒等。利用微生物生产天然色素有很 大潜力，其中红曲霉菌己成为主攻方向，因为它在价格和色素稳定性上优于动、植物来 源的天然色素【2 2 1 。利用红曲霉固态发酵生产红曲色素，在我国己有七百多年历史，但其 发酵工艺生产率低、耗粮多，不适应大规模工业化生产。近年发展起来的液体发酵培养 法是生产红曲色素较为理想的方法，具有工艺简单、生产周期短、节约粮食等优点，但 该方法存在色素产率低、提取成本高等不足。 液体深层发酵工业化生产水溶性红曲色素粉状产品是国内外研究开发的热门课题 【珏刎。陈家文等从1 9 9 1 年开始进行此项研究，1 9 9 2 年进行8 0 0l 罐中试，达到国内领 先技术水平，继而放大到4 0 0 0 l 发酵罐规模，该工业性试验已取得了很好的研究结果， 于1 9 9 4 年8 月通过省级技术鉴赳2 5 1 。 近年来又开发液体深层发酵生产红曲色素工艺。宁夏轻工研究所采用玉米为原料， 液体深层发酵，发酵液总色价达1 6 0u g ，被认为是国内液体深层发酵最高水平。此工艺 自动化程度高，污染小，色素粉色价高，但设备投资大，生产成本高，且规模较小，另 外，该工艺只能生产红曲红色素，不能生产功能性红曲。 国内生产功能性红曲，大多采用三角瓶、塑料瓶、浅盘等作坊式生产，生产效率低， 而浅盘培养极易污染杂菌，且不少小企业生产条件差，培菌水平低，常常导致污染，严 重影响红曲米质量，因此急需研究解决切实可行的规模化培养红曲方法。 日本率先采用种子液体发酵、红曲固体发酵工艺生产红曲( 米) 色素、但以糯米为 原料生产。华中农业大学陈运中【硐借鉴国内外红曲生产先进经验和发酵新技水。建立一 套以早籼米为原料，种子液体发酵，红曲固体发酵，流化床干燥，气流微粉碎生产功能 7 酵母青霉互作产红色素研究 性红曲色素粉新工艺。 红曲含有多种生物活性物质，对于人体健康具有非常重要意义。但是。由于红曲中 活性物质含量很低，成为红曲生产应用瓶颈，因此，在今后一段时间内，人们目光将聚 焦在提高它们含量上。目前，主要是通过两个方面来达到目的：一是获得高产菌株，例 如通过物理化学诱变或基因重组，或能够进一步利用限制性内切酶酶切片段长度多态性 ( p e u 之) 及随机扩增多态性分析技术( p a p d ) 等，找出产生各种生物活性物质的特定 d n a 片段，通过转基因技术或反义技术，使活性成分含量提高。另一方面是通过改进 红曲霉发酵工艺、提取工艺等。 目前大多数天然色素是从天然动植物材料( 果皮、种子、根、昆虫等) 中提取出来 的，存在着具有商业价值材料缺乏、色素稳定性差等问题f 3 1 。如花青素对氧化作用敏感、 易被漂白以及随p h 值不同而改变颜色；甜菜苷、类胡萝卜素、叶绿素由于含有不稳定 氢而易于被氧化脱色，对光、热、氧敏感，因此在食品加工、贮藏和上架期间会影响其 颜色的充分展现；姜黄色素因其辛辣和咖哩味而使之使用受限【2 7 1 。这为开辟天然色素生 产新途径提供了巨大动力。一个可供选择的途径就是将生物工程技术与微生物结合来开 发生产天然食品色素。微藻类和真菌可以产生多种多样的水溶性色素，微藻低生产能力 是限制其商业化的瓶颈幽】，担子菌在实验室及工业生产中进行规模化培养仍存在困难， 所以丝状真菌如子囊菌成为新型天然色素研究开发的重要领域。自然界存在着丰富的真 菌资源，估计自然界存在的真菌可达1 5 0 0 0 0 0 种之多，已发现的真菌达9 0 0 0 0 多种，其 中子囊菌约有3 5 0 0 0 种，半知菌约3 0 0 0 0 种，真菌生物多样性是天然水溶性非类固醇类 色素的重要资源库【2 9 】。当然，丝状真菌用于食品色素开发并不是新的实践，如红曲色素 的应用在中国已有上千年的历史，由此人们认为丝状真菌是更有价值的食用色素开发的 微生物资源库。如何发掘丝状真菌色素资源以及运用代谢工程和发酵技术进行大规模发 酵生产真菌色素成为该领域研究的关键。 资料显示许多种属的丝状真菌具有产生色素的能力，如m o n a s c u s 属、e p i c o c c u m 属、p a e c i l o m y c e s 、p e n i c i l l i u m 属等【3 0 。3 1 。其中青霉属产生色素已发现的有多个种产生 不同颜色的色素，尸o x a l i c u m 可产生一种黄色色素( 毒性) ，p p u r p u r o g e n u m 可产生 橙色一黄色、黄色和橙色一黄色的色素，尸p e r s i c i n u m 可产生浅粉红色的色素，尸f a g i 可产生蓝绿色的色素，p - o x a l i c u mv a r a r m e n i a c a 可产生深红色色素阻3 5 】。其中p o x a l i c u mv a r a r m e n i a c a 可产生深红色色素( a r p i n kr e d t m ) 已由捷克的a s c o l o rb i o t e c h 8 削晶 公司进行了商业化开发生产【3 6 1 ；日本j u no g i h a r a 等人从青霉( ps p a z ) 中分离出的 紫色素为红曲红胺【3 7 1 。国内对丝状真菌色素的研究与开发主要集中于红曲色素和类胡萝 卜素。对红曲色素的分离、育种及发酵生产开展了广泛研究，并已工业化生产，目前发 展的方向是功能性红曲色素的研究【3 8 删。关于真菌类胡萝卜素的研究也较深入，如韩建 荣关于青霉p t 9 5 菌株茵核产类胡萝卜素的研究、石勇等关于酵母产类胡萝卜素的研究 等1 4 1 ，4 2 l 。但是对丝状真菌水溶性非类固醇类色素的发现与报道很少。刘章武等报道脉孢 霉属一菌株可产生吸收峰在5 2 6 n m 的红色素1 4 3 】；胡爱红等研究一种丝状菌m i u g - 2 7 产 红色素的发酵条件，但没有报道其种属【4 4 1 ；由青霉菌属丝状菌分泌红色素的报道大多是 马尔尼菲青霉( pm a r n e f f e r ) ，在含糖培养基上产生红色素，以此做为临床检验的性状 指标，没有关于此红色素性质及合成等进一步的研究报道【4 5 】；黄思梅等报道p s 0 3 1 2 产 生的色素颜色随p h 不同而变化，在中性溶液中呈红色，色素非分泌型，合成后存在于 菌丝内，可能是类胡萝卜素i 删；中科学院微生物所w a n gl 分离一株产桃红色素的青霉 菌( 尸p e r s i c i n u m ) 【4 | 7 1 。 丝状真菌色素种类如此繁多，但研究开发利用的还不多，国内这方面的研究更是落 后于世界水平。本研究就是利用丝状真菌霉菌和酵母菌共培养生产红色素，此研究还未 曾有报道，该红色素的产生是一种新型的产红色素现象，该红色素为丝状真菌色素资源 开与利用增添了素材。 1 3 丝状真菌色素合成机制 色素合成大多为次生代谢产物，其合成机制与其生长条件、生理特性关系密切，如 不良条件引起酶的变化，代谢途径转变，惰性基因激活等等。还有共培养中一种微生物 生长代谢引起某些物质的变化而导致另种菌的酶活变化和代谢转变，而引起或加快某 些物质的产生。 以研究较多的红曲色素为例介绍及其合成机理【勰1 。红曲霉系红曲科腐生丝状真菌 属，用于食品生产的主要种类有红曲霉( m a n k a ) 和红色红曲霉( m r u b e r ) 等1 4 9 1 。红 曲色素属于聚酮类色素，是红曲霉代谢过程中产生的一系列聚酮化合物的混合物。红曲 色素中已经探明结构的有1 0 种，其中6 种为醇溶性色素，4 种为水溶性色素。醇溶性色 素有红斑素、红曲红素、红曲素、红曲黄素、红斑胺和红曲红胺等【5 0 l 水溶性色素有n 戊二酰基红斑胺、n 戊二酰基红曲红胺、n 葡糖基红斑胺和n 葡糖基红曲红胺等【5 1 j 。 9 酵母青霉互作产红色素研究 这些色素中，具有应用价值的主要是醇溶性的红曲素、红斑素和红曲红素。红曲色素中 的黄色成分约占5 ，其性质比较稳定，但因其含量低，所以红曲色素呈现红色。红曲 色素中呈现红、紫两种颜色的色素因分离困难，一般混合使用【5 2 1 。 红曲色素生物合成为1 分子乙酰c o a 和3 分子丙二酰c o a 在聚酮体合酶( p o l y k e t i d e s y n t h a s e s ，p k s s ) 的作用下生成四酮化合物，四酮化合物再与1 分子丙二酰c o a 生成 五酮化合物( 图1 8 ) 【5 3 1 ，如此循环使酮基化合物碳链加长，最后生成胞内色素，胞内 己戴c o a + 3 两歉c o a 丙：酰c o a e 骧翻体务群 四酮化奢物 弧藤纯台锈五翻 胞点鬃 上 丙：溉c o a 图卜8 红曲色素的合成途径 f i g 1 - 8s y n t h e t i ca p p r o a c ho fm o n a s c u sp i g m e n t s 色素与1 分子葡糖基或戊二酰基结合转化为胞外色素( 图1 9 ) f 5 1 】。红曲霉在色素合成 过程中主要产生两条支路，h a s s a n 等【5 3 1 用核磁共振和1 3 c 同位素分析得到红色红曲霉的 桔霉素( c i t r i n i n ) 生物合成途径，发现桔霉素的生成与红曲色素的生成有一定的关联性， 关联程度与红曲霉的种类有关。r a s h e v a t 等【5 4 】通过对紫红曲霉的研究发现，色素合成 和脂质合成也是共存的，两者存在竞争作用。当c n 高时，有利于脂质合成。 1 0 莉舀 囊鬻 辩一j 鼍二壤萋筑璃粒，g t i t a 弛i 脊张蒸靓剪艘，o c 3 t c j t , t 图1 - 9 胞外色素的合成途径 r i g a - 9s y n t h e t i ca p p r o a c ho fe x t r a c e l l u l a rp i g m e n t s 红曲色素合成过程中的关键酶是聚酮体合酶( p k s s ) ，它在结构和功能上与脂肪酸 合酶( e a s s ) 有关，两者都是催化a c p 酰化硫酯间相继脱羧性的聚合。然而与多数f a s s 不同的是，p k s s 可以省去部分或全部还原反应( 如6 一酮基还原，脱水分子和烯酰基还 原) ，这些还原反应发生在每次聚合反应之后，由此沿聚合链专门位点产生带有酮、乙 醇或烯烃，而不是亚甲基的功能团。在不同的生物体内，p k s s 系统至少存在模式i 型 ( m o d u l a rt y p ei ) 、循环i i 型( i t e r a t i v et y p ei i ) 和循环i 型( i t e r a t i v et y p ei ) 三种类 型【5 鄂。 p k s s 系统中的模式i 型是一种主要存在于放线菌中的多功能酶，用于组装大分子 多功能蛋白质和催化大环内酯如红霉素、纳巴霉素等的合成。放线菌中还存在循环i i 型 p k s s 系统，它是由数个蛋白质组成的酶复合体，其酶活性中心位点包括酰基转移酶 ( a t ) 、酮基合成酶( k s ) 、a c p 、酮基还原酶( k a ) 、烯酰还原酶( e r ) 和脱水酶( d h ) 。 循环i i 型p k s s 用于合成由一些活性位点构成的芳香族聚酮化合物，且每个位点编码不 酵母青霉互作产红色素研究 同的聚酮化合物。p k s s 系统中的循环i 型是上述两种类型的杂化物，主要存在于真菌 中，用于形成不同结构的前体物质如展青霉素、柄曲霉素和洛伐他汀等【5 6 】。p k s s 在生 物体内通过加载不同的启动单元，进入相应的酶系统产生作用。至于红曲霉中存在上述 一种或几种p k s s 系统目前尚不清楚。 曾有学者推测红曲色素是一种抑菌剂，以助红曲霉竞争性获得营养源。但随即有学 者推翻了这一结论，依据是抑菌剂与色素没有完全分离( h c w o n ge ta l ，1 9 7 7 ) 1 5 7 1 。 有研究发现红曲色素在溶氧良好的发酵条件下，发酵后期红曲色素色价有显著降低，提 出了红曲色素有可能是红曲霉菌的一种能量贮存物质的假设【5 8 】，其研究表明：红曲色素 作为红曲霉菌的次级代谢产物，在其代谢过程中有其特殊的生理功能，在营养良好的培 养基中培养时，红曲霉合成的红曲色素可以作为一种能量贮存物质，当培养基营养缺乏 时，红曲霉可同化色素，延缓细胞衰老、自溶过程；同时还发现了红曲色素组分比黄色 色素组分更容易被菌体同化。曾有学者指出( c u b r o d e re ta l ，1 9 8 0 ) 5 9 】，黄色色素组 分在富含氮源的培养基中可与含氮物质( 如氨基酸) 进行化学转化( 而非生理性转化) 成红色的胺类化合物( r u b r o p u n c t a m i n e 及m o n a s c o r u b r o m i n e ) 。研究还表明生成的黄色 色素o d 4 l o 可以被同化，黄色色素( m o n a s c i n 及a n k a f l a v i ) 在释放至培养基后可与含氮 物质自动经化学反应转化成红色色素( o d 5 1 0 ) ，这样黄色色素起到了一个氮源捕获剂的 作用，可为以后红曲霉的代谢不但提供碳源，而且提供氮源。 色素结构不同合成机制也多种多样，色素机制研究目前还很不充分，其具体合成机 理，还有很多未知。一但机理研究清楚了，人们就可以利用其合成过程加进人为因素， 来提高色素产量，这对色素产业来说具有重要的意义。 1 4 酵母霉菌相互作用与次生代谢产物合成 自然界微生物间相互作用现象是普遍存在的，如竞争、互生和拮抗等作用。 从明代宋应星天工开物中对丹曲的描述来看，当时的丹曲就是一种长有黑陆霉、 红曲霉和酵母菌的混合曲，这与古时的开放式制曲有关l 删。目前从我国各地生产的红曲 米中也常常能分离到酵母菌等其它微生物。 自1 9 9 8 年始韩国的研究人员对红曲霉与酵母菌、米曲霉的混合培养进行了初步的 研究。s h i ncs 等人的研究发现红曲霉j 1 0 1 菌株在液体培养2 4 h 后再与酿酒酵母混合培 养9 6 h ，结果红、黄色素的产量都有了提高【6 1 1 。j u n g h a es u h 等人的研究发现与酿酒酵 1 2 前言 母共同培养的红曲霉细胞干重比单独培养时要增加2 倍，色素产量则提高了3 0 4 0 倍之 多。研究者认为酿酒酵母产生的几丁质酶、淀粉酶是一种提高红曲色素产量的刺激因子 【6 2 ，6 3 1 。周帼萍等【删通过试验确证了酵母滤液的确可以促红曲红色素增产，其水溶性红 色素产量最高可提高9 1 2 5 。 s h i n c s 掣6 5 1 。将红曲霉