（细胞生物学专业论文）毛蚶scapharca+kagoshimensis血红蛋白的类酚氧化酶活性及其cdna克隆的研究.pdf

毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ) 血红蛋白的类酚氧化酶活性及其e d n a 克隆的研究 毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n si s ) 血红蛋白的类酚氧化酶 活性及其c d n a 克隆的研究 摘要 毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ) 是隶属于软体动物门瓣鳃纲的一种具有重 要经济价值的海洋无脊椎动物，其缺乏真正意义上的抗体、没有免疫记忆能力， 只能依靠非特异性免疫反应来抵御寄生虫和疾病，其中血细胞和免疫因子在其对 多种病原微生物的免疫防御反应中起着决定性作用。血红蛋白( h e m o g l o b i n ，h b ) 是所有脊椎动物和部分无脊椎动物血液中所含有的一大类含铁的呼吸蛋白，除具 有运输氧气的主要功能外，还具有稳定血压、抗菌、运输硫化物、调节酸碱平衡、 氧化酶、过氧化酶活性等多种生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。 在其发现无脊椎动物血蓝蛋白具有类酚氧化酶活性之后，本实验室首次发现毛蚶 h b 也具有类酚氧化酶活性，从此揭开了毛蚶h b 非特异性免疫功能研究的序幕。 本研究拟利用生物化学和分子生物学手段从其血淋巴中分离纯化出毛蚶h b ，鉴 定其类酚氧化酶活性( p o 1 i k ea c t i v i t y ) 及其激活因子，确定其生物化学性质和 酶性质，查清几种常用免疫促进剂刺激以及细菌感染对毛蚶h b 与血细胞的影响 作用，克隆出毛蚶h b 的全长e d n a 序列，并利用推测一级结构氨基酸序列进行 初步的同源性分析，旨在证实毛蚶h b 的非特异性免疫功能，为揭示毛蚶血红蛋 白在动物非特异性免疫中的作用及分子机理，鉴定其在呼吸蛋白家族中的分子进 化地位等奠定基础。 本文利用s e p h a c r y ls 10 0 凝胶过滤柱层析和qs e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换 柱层析技术成功从毛蚶血淋巴中分离纯化出了血红蛋白，并以三二羟苯丙氨酸 ( 上d o p a ) 为特异性底物对其类酚氧化酶活性进行了鉴定，实验结果表明，所 得毛蚶h b 纯化样品在s d s p a g e 电泳中为分子量约1 4 2 7k d a 的单一条带，胶 内酶切肽指纹图谱分析结果证实所得纯化样品确为h b ；同时，所得毛蚶h b 纯 化样品对l d o p a 具有很强的氧化活性，且n a t i v e p a g e 电泳条带的l d o p a 染色结果也证实其具有很强的氧化活性，表明毛蚶h b 确实具有类酚氧化酶活性。 中国海洋大学博士研究生学位论文 生化性质和酶性质研究结果表明，毛蚶血红蛋白纯化样品对l d o p a 发挥类 酚氧化酶活性的最适p h 值为7 0 、最适反应温度为3 0 ，其k m 值约为4 9 0 m m o l l ，且其类酚氧化酶活性可为异丙醇所进一步激活；不同氧化酶抑制剂的 研究结果发现，毛蚶h b 纯化样品的类酚氧化酶活性对苯甲酸非常敏感，对抗坏 血酸、亚硫酸钠、柠檬酸和硫脲较为敏感，而对苯硫脲和半胱氨酸不敏感，表明 毛蚶h b 发挥类酚氧化酶活性是具有酪氨酸酶类型的酚氧化酶性质；此外，金属 离子螯合剂乙二胺四乙酸( e d t a ) ，z n 2 + 和c u 2 + 均能强烈抑制毛蚶h b 纯化样 品的类酚氧化酶活性，二乙基二硫氨基甲酸酯( d e t c ) 、c a 2 + 和m g + 的抑制作 用较小，而f e 2 + 却具有激活作用，说明毛蚶h b 的类酚氧化酶活性还具有金属酶 性质；毛蚶h b 纯化样品类酚氧化酶活性的回复实验结果显示，被e d t a 抑制的 类酚氧化酶活性可特异性地为f e 2 + 所回复，进一步证明其是一种含铁金属酶性 质。综上所述，毛蚶h b 发挥类酚氧化酶活性具有酪氨酸酶类型的含铁酚氧化酶 的性质。 免疫促进剂处理毛蚶的实验结果显示，脂多糖、p 葡聚糖、灭活哈维氏弧菌 和灭活鳗弧菌处理4 8h 后，与对照组相比，毛蚶h b 的产量分别增加了7 4 7 、 6 1 7 、1 0 3 9 和2 7 9 2 ，其类酚氧化酶总活性分别增加了2 0 7 2 、4 0 3 、 11 4 0 和4 5 8 4 ，而单位酶活性没有显著差异，表明上述四种免疫促进剂的刺 激可不同程度地提高毛蚶h b 的合成量及其类酚氧化酶总活性，其中以灭活鳗弧 菌的刺激效果最为显著；此外，脂多糖、b 一葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧 菌处理4 8h 后，毛蚶的血细胞的总数分别增加了8 3 、6 3 、2 0 和2 0 8 表明上述四种免疫促进剂的刺激可不同程度地增加毛蚶血细胞的数量，其中以灭 活鳗弧菌的刺激效果最为显著。综上所述，免疫促进剂脂多糖、p 一葡聚糖、灭活 哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌可可不同程度地增加毛蚶血细胞的数量、提高毛蚶f i b 的合成量及其类酚氧化酶总活性，暗示血细胞和血红蛋白的确参与了免疫促进剂 刺激下毛蚶自身免疫力的提高。 细菌感染毛蚶的实验结果显示，l x l 0 7 个i n l 鳗弧菌感染毛蚶4 8 h 后，与对 照组相比，毛蚶h b 的产量增加了19 7 8 ，类酚氧化酶总活性增加了5 2 9 ，血 细胞的总数却减少了3 7 7 1 ；1 x 1 0 8 个m l 哈维氏弧菌感染毛蚶4 8 h 后，与对照 组相比，毛蚶h b 的产量增加了8 4 4 ，类酚氧化酶总活性增加了6 3 6 ，血细 i j 毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ) 血红蛋白的类酚氧化酶活性及其c d n a 克隆的研究 胞的总数却减少了1 7 5 ；而浓度为l x l 0 5 个m l 的哈维氏弧菌和鳗弧菌感染4 8 h 后毛蚶f i b 的产量减少了1 9 9 和7 9 4 ，类酚氧化酶总活性减少了1 1 5 和 5 5 9 ，血细胞数量减少了3 5 6 3 和1 6 6 7 ；上述结果表明，细菌感染能不同 程度地引起毛蚶血细胞数量的减少，且高浓度细菌感染可不同程度地引起毛蚶 h b 产量和类酚氧化酶总活性的增加，但低浓度细菌感染反而会不同程度地引起 毛蚶h b 产量和类酚氧化酶总活性的降低，暗示血细胞和h b 的确参与了毛蚶的 非特异性免疫反应。 “ 从毛蚶血细胞中提取总r n a ，利用反转录一聚合酶链式反应( r t - p c r ) 和 快速扩增e d n a 末端( r a c e ) 技术，分别克隆出了毛蚶血红蛋白h b i 、h b l ia 和h b l ib 的全长e d n a 序列，h b i 的e d n a 全长为7 5 6b p ，编码1 4 7 个氨基酸 残基，分子量为1 6 2k d a ，与不等壳毛蚶( s c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i s ) h b i 的同源 性为9 9 3 2 ；h b i ia 的e d n a 全长为7 5 5b p ，编码1 5 0 个氨基酸残基，分子量 为1 6 5k d a ，与不等壳毛蚶( s c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i s ) h b l i a 链同源性为9 8 6 7 ； h b i ib 的e d n a 全长为7 4 5b p ，编码1 5 2 个氨基酸残基，分子量为1 6 7k d a ，与 不等壳毛蚶( s c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i s ) h b i i b 链同源性为9 9 3 4 。 研究毛蚶h b 的类酚氧化酶活性，对于揭示h b 在无脊椎动物非特异性免疫 中的生物学功能具有重要的理论意义，在动物免疫和呼吸蛋白分子进化等方面也 均具有重要的科学价值。 关键词：毛蚶；血红蛋白；类酚氧化酶活性；非特异性免疫；全长e d n a h l 中国海洋大学博士研究生学位论文 s t u die so np h e n olo xid a s e - ik ea c tivitie sa n dcdnade s p h e n o a s eive sliiiiiti cio nin go fh e m o g io binf r o mb io o dcia ms c a p h a r c a a b s t r a c t b l o o dc l a m ，s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ，i so n eo fam a r i n ei n v e r t e b r a t e sw h i c h h a sa ni m p o r t a n te c o n o m i cv a l u ea n d b e l o n g st om o l l u s c a , l a m e l l i b r a n c h i a i tl a c k s a n t i b o d i e sa n di m m u n em e m o r ya n dh a st or e s i s tp a r a s i t e sa n dd i s e a s e s 、航t h n o n - s p e c i f i ci m m r l l es y s t e m h a e m o c y t e sa n dh u m o r a li m _ m u n ef a c t o r sp l a ya n i m p o r t a n tr o l e si ni m m u n er e s p o n s e so fs k a g o s h i m e n s i st om a n yk i n d so fp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m h e m o g l o b i n ( f r o ) ，r e s p o n s i b l ef o ro x y g e nt r a n s p o r t , a r eak i n do f i r o n - c o n t a i n i n gr e s p i r a t o r yp r o t e i n sf o u n di nt h eh e m o l y m p ho fb o t hv e r t e b r a t e sa n d s o m ei n v e r t e b r a t e s t h i ss t u d yi n d i c a t et h a th e m o g l o b i nn o to n l yh a v eo x y g e n - b e a r i n g f u n c t i o n ，b u ta l s oh a v ef u n c t i o n sa sf o l l o w s ：a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ，a d j u s t i n gb l o o d p r e s s u r e ，t r a n s p o r t i n gs u l f i d e ，a d j u s t i n ga c i d b a s eb a l a n c e ，o x i d a s e ，p e r o x i d a s e a c t i v i t ya n ds oo n i ti so n eo ft h em o s tv a l u a b l er e s p i r a t o r yp r o t e i n st ow o r t h r e s e a r c h i n g m a n ys t u d i e sh a v ei n d i c a t e dt h eh e m o c y a n i n sc a nb ef u n c t i o n a l l y c o n v e r t e di n t oak i n do f p h e n o l o x i d a s e l i k ee n z y m ea n dd i s p l a yp oa c t i v i t i e su n d e r c e r t a i nc o n d i t i o n s i nt h i ss t u d y ，p h e n o l o x i d a s e l i k ea c t i v i t i e so ft h eh e m o g l o b i nf r o m b l o o dc l a ms k a g o s h i m e n s i sw a sf o u n da n di tl a ys o l i df o u n d a t i o ni nn o n - s p e c i f i c i m m u n eo fi n v e r t e b r a t e s i no r d e rt oc h a r a c t e r i z et h ep r o p e r t i e so fp o - l i k ea c t i v i t i e s o ft h eh e m o g l o b i nf r o mb l o o dc l a ms k a g o s h i m e n s i s ，h bf r o ms k a g o s h i m e n s i sw a s p u r i f i e db yb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d s ，a n d c h a r a c t e r i z e di t s b i o c h e m i s t r ya n de n z y m a t i cp r o p e r t i e s t os t u d yt h es t i m u l a t i n gm e c h a n i s m so f i r n m u n o s t i m u l a t e s ，t h ei m m u n o s t i m u l a t i n ge f f e c t so f1 3 - g l u c a n , l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) ，i n a c t i v a t ev i b r i oh a r v e y ia n dv i b r i oa n g u i l l a r u mo nt h ep o - l i k ea c t i v i t i e so f h bf r o m k a g o s h i m e n s i sw e r ei n v e s t i g a t e da n df u l l l e n g t he d n a s e q u e n c eh a sb e e n o b t a i n e d t h i ss t u d yh a sn o to n l yg r e a ts i g n i f i c a n c ei nu n d e r s t a n d i n gi t sr o l e si n i n v e r t e b r a t en o n - s p e c i f i ci m m u n es y s t e m ，b u ta l s oh e l p su st of u l l yc o g n i z et h e m u l t i p l eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so f l i b i nt h i ss t u d y ，h bf r o mh e m o l y m p ho fs k a g o s h i m e n s i sw a sp u r i f i e db ys e p h a c r y l 毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ) 血红蛋白的类酚氧化酶活性及其e d n a 克隆的研究 s - 10 0g e l f i l t r a t i o na n dq s e p h a r o s ef a s tf l o wi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，a n d c h a r a c t e r i z e di t s b i o c h e m i s t r y a n d e n z y m a t i c p r o p e r t i e s b y u s i n g l d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e 一d o p a ) a st h es p e c i f i cs u b s t r a t et os t u d yi t sp o l i k e a c t i v i t y t h er e s u l ti n d i c a t et h a tt h ep u r i f i e dh bh a dam o l e c u l ew e i g h to fo n l y 1 4 2 7 k d ai ns o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l e m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) ， a n di t i st e s t i f i e db yp e p t i d em a s sf m g e r p r i n t ( p m f ) t h ep u r i f i e dh bc a ns p e c i f i c o x i d a t el - d o p aa n dd y e db yl - d o p aa f t e rn a t i v e - p a g e t h er e s u l ti n d i c a t et h a t t h eh bf r o m k a g o s h i m e n s i sh a v et h ep o l i k ea c t i v i t i e s t h eb i o c h e m i c a la n de n z y m a t i cp r o p e r t i e so fh bf r o m & k a g o s h i m e n s i s 粥遗 l d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e - d o p a ) a st h es p e c i f i cs u b s t r a t ew a ss t u d i e da n dt h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mp na n dt e m p e r a t u r ew a s7 0o rs oa n d3 0 a n d u s i n g 厶r d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e 一d o p a ) a st h es p e c i f i c s u b s t r a t et os t u d yi t s p o - l i k ea c t i v i t y t h ek mv a l u e sw a s4 9 0m m o l la g a i n s tl - d o p a t h ep o - l i k e a c t i v i t i e so fh bf r o m & k a g o s h i m e n s i sc a l lb ea c t i v a t e db yi s o p r o p a n o l ，a n dw a s e x t r e m e l ys e n s i t i v et os o m ee f f e c t i v ei n h i b i t o r so fb e n z o i ca c i d ；s e n s i t i v et oa s e o r b i e a c i d , u r e aa n ds o d i u ms u l f i t e ，c i t r i ca c i d ； b u tn o ts e n s i t i v e t o c y s t e i n e a n d l - p h e n y l - 2 - t h i o u r e a a l lt h e s ei n d i c a t et h a tt h ep o - l i k ea c t i v i t i e so fh bf r o m & k a g o s h i m e n s i s i nt h i ss t u d yi sak i n do ft y r o s i n a s e t h ep o - l i k ea c t i v i t yo fl i bf r o m & k a g o s h i m c r i s i sw a sv e r ys e n s i t i v et oe d t a , c u 2 + a n dz n 2 + ，b u tn o ts e n s i t i v et o d e t c ，e 鑫2 + a n dm 9 2 + , a n df e 2 + a c t i v a t et h ep oa c t i v i t ye f f e c t i v e l y 。t h e ni tc a n b e c o n c l u d e dt h a tt h eh bo f s k a g o s h i m e n s i s w a sat y p eo fi r o n - c o n t a i n i n gp r o t e i n t o s t u d y t h e s t i m u l a t i n g m e c h a n i s m so f i m m u n o s t i m u l a t e s ，t h e i m m t m o s t i m u l a t i n ge f f e c t so f1 3 - g l u c a n , l i p o p o l y s a c e h a r i d e ( l p s ) ，i n a c t i v a t e dv i b r i o h a r v e y ia n dv i b r i oa n g u i l l a r u m0 nt h ep o - l i k ea c t i v i t i e so f h bf r o m & k a g o s h i m e n s i s w e r ei n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y u n d e rt h es t i m u l a t i o no fp - g l u c a n ，l p s ，i n a c t i v a t e d v i b r i oh a r v e ya n di n a c t i v a t e dv i b r i oa n g u i l l a r u , t h ea m o u n to fh bs y n t h e s i z e df r o m s k a g o s h i m e n s i si n c r e a s e da b o u t7 4 7 、6 1 7 、1 0 3 9 a n d2 7 9 2 ，r e s p e c t i v e l ya n d p o l i k ea c t i v i t i e si n c r e a s e da b o u t 2 0 7 2 、4 0 3 、l1 4 0 a n d4 5 8 4 ，b u tt h eu n i t a c t i v i t yo fp o l i k er e m a i n sa l m o s tu n c h a n g e d t h ei m m u n o s t i m u l a t i o no fv i b r i o a n g u i l l a r ui st h em o s te f f i c i e n to nt h ea m o u n to fl i bs y n t h e s i z e da n dp o - l i k ea c t i v i t y f u r t h e rm o r e ，t h en u m b e ro fa l lh e m o c y t e si n c r e a s e da b o u t8 3 、6 。3 、2 磊a n d 2 0 8 i ti sc o n c l u d e dt h a tu n d e rt h es t i m u l a t i o no fb - 酉u c a 巩l p s ，i n a c t i v a t e dv i b r i o v 中国海洋大学博士研究生学位论文 h a r v e ya n di n a c t i v a t e dv i b r i oa n g u i l l a r u ，t h ea m o u n to fli bs y n t h e s i z e df r o m s k a g o s h i m e n s i s , p o l i k ea c t i v i t i e sa n dt h en u m b e ro f a l lh e m o c y t e sa l e a l li n c r e a s e d , t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eh e m o c y t e sa n dh bp l a ya l li m p o r t a n tr o l e si ns c a p h a r c a k a g o s h i m e n s i s si m m u n er e s p o n s e s u n d e rt h ei n f e c t i o no flxl07 i n d m lv i b r i oa n g u i l l a r u , t h ea m o u n to fh b s y n t h e s i z e df r o ms k a g o s h i m e n s i si n c r e a s e da b o u t19 7 8 ，r e s p e c t i v e l ya n dp o - l i k e a c t i v i t i e si n c r e a s e da b o u t 5 2 9 ，t h en u m b e ro fm lh e m o c y t e sr e d u c e d3 7 71 u n d e r t h ei n f e c t i o no flxl0 8 i n d m lv i b r i oh a r v e y , t h ea m o u n to fh bs y n t h e s i z e df r o m s k a g o s h i m e n s i si n c r e a s e da b o u t8 4 4 ，r e s p e c t i v e l ya n dp o l i k ea c t i v i t i e si n c r e a s e d a b o u t 6 3 6 ，t h en u m b e ro fa l lh e m o c y t e sr e d u c e d1 7 5 u n d e rt h ei n f e c t i o no f lxlo i n d m lo fv i b r i oh a r v e ya n dv i b r i oa n g u i l l a r u ，t h ea m o u n to fh bs y n t h e s i z e d f r o ms k a g o s h i m e n s i sr e d u c e da b o u t1 9 9 a n d7 9 4 ，r e s p e c t i v e l ya n dp o l i k e a c t i v i t i e sr e d u c e da b o u t l 15 a n d5 5 9 ，t h en u m b e ro fa l lh e m o c y t e sr e d u c e d 3 5 6 3 a n d16 6 7 们1 er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ei n f e c t i o nr e s u l t si nr e d u c t i o no ft h e n u m b e ro fa l lh e m o c y t e s i n f e c t i o n 而t hl l i g hc o n c e n t r a t i o np a t h o g e n yr e s u l t si n i n c r e a s eo ft h ea m o u n to fh bs y n t h e s i z e d ，p o l i k ea c t i v i t i e sa n dt h en u m b e ro fa l l h e m o c y t e s o t h e r w i s e ，i n f e c t i o nw i t hl o wc o n c e n t r a t i o np a t h o g e n yr e s u l t s i n r e d u c t i o no ft h ea m o u n to fh bs y n t h e s i z e d ，p o l i k ea c t i v i t i e sa n dt h en u m b e ro fa l l h e m o c y t e s t o t a lr n ai si s o l a t e df r o mt h eh e m o c y t e so fs k a g o s h i m e n s i sa n df u l l l e n g t h c d nas e q u e n c eo fh b i ，h b l iaa n d 舶i ibh a sb e e no b t a i n e du s i n gr e v e r s e t m n s c r i p t a s e ( r t ) 一p c ra n dr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d ( r a c e ) t h ef u l l l e n g t h e d n ao fh b if r o ms c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i si s7 5 6b p ，e n c o d i n ga14 7 一a m i n oa c i d p r o t e i n , t h em o l e c u l a rw e i g h ti s a b o u t16 2k d a , t h ei d e n t i t y 埘t l lh b if r o m s c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i si s9 9 3 2 ；h b i iaf r o ms c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i si s7 5 5b p ， e n c o d i n ga15 0 一a m i n oa c i dp r o t e i n , t h em o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t16 5 k d a , t h e i d e n t i t y 、i t l lh b if r o ms c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i si s9 8 6 7 ；h b i ibf r o ms c a p h a r c a k a g o s h i m e n s i si s7 4 5b p ，e n c o d i n ga15 2 一a m i n oa c i dp r o t e i n ，t h e m o l e c u l a rw e i g h ti s a b o u t16 7 k d a , t h ei d e n t i t y 、析t hh b if r o ms c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i si s9 9 3 4 i nc o n c l u s i o n ，t h es t u d yo ft h ep o l i k ea c t i v i t i e so fh bf r o m k a g o s h i m e n s i s h a sg r e a ts i g n i f i c a n c ei nn o to n l yu n d e r s t a n d i n gt h er o l e sa n dm e c h a n i s m so fh bi n i n v e r t e b r a t en o n - s p e c i f i ci m m u n es y s t e m ，b u ta l s oi d e n t i f i c a t i o nt h em o l e c u l a r e v o l u t i o ns t a t u so fh bi nt h ef a m i l yo fr e s p i r a t o r yp r o t e i n 毛蚶( s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ) 血红蛋白的类酚氧化酶活性及其c d n a 衷堕塑堡壅 k e yw o r d s ：s c a p h a r c ak a g o s h i m e n s i s ；h e m o g o b i n ；p h e n o l o x i d a s e - l i k ea c t i v i t y ； n o n - s p e c i f i ci m m u n e ；f u l l - l e n g t hc d n as e q u e n c e v i i 中国海洋大学博士研究生学位论文 本文所用缩写词 h b ：h e m o g l o b i n ，血红蛋白 h e ：h e m o e y a n i n ，血蓝蛋白 h d p o ：h e m o e y a n i n - d e r i v e dp h e n o l o x i d a s e ，酚氧化酶样酶 p o ：p h e n o l o x i d a s e ，酚氧化酶 p r o p o ：p r o p h e n o l o x i d a s e ，酚氧化酶原 s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基磺酸钠 s d s p a g e ：s o d i u md o d e e y ls u l f a t ep o l y a c r y l e m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，一十二烷基磺 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 n a t i v e - p a g e ：n a t i v ep o l y a c r y l e m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，天然状态生物大分子聚丙 烯酰胺凝胶电泳 h e p e s ：2 f 4 ( 2 h y d r o x y e t h y l ) 1 - p i p e r a z i n y l e t h a n e s u l f o n i ea c i d ，羟乙基哌嗪乙硫磺 酸 d e t c ：d i e t h y l d i t h i o e a r b a m a t e ，三乙基二硫氨基甲酸酯 e d t a - t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca e i d ，乙二胺四乙酸 五- d o p a - l - d i h y d r o x y o p h e n y l a l a n i n e ，l 一五羟苯丙氨酸 b g b p ：p l ，3 - g l u e a a - b i n d i n gp r o t e i n ，1 3 - 葡聚糖结合蛋白 k d a ：k i l o d a l t o n ，千道尔顿 l b p ：l i p o l y s a c e h a r i d eb i n d i n gp r o t e i n ，脂多糖结合蛋白 l g b p ：l i p o p o l y s a c c h a r i d ea n dp 1 ，3 g l u c a nb i n d i n gp r o t e i n ，脂多糖葡聚糖结合蛋白 l p s ：l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，脂多糖 a 2 8 0 ：2 8 0n l ua b s o r b a n e e ，2 8 0h i s 光吸收 a 4 1 5 ：4 1 5n 1a b s o r b a n e e ，4 1 5 鼬光吸收 a 4 9 0 ：4 9 0n n la b s o r b a n c e ，4 9 0n n l 光吸收 p g r p ：p e p t i d o g l y e a nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，肽聚糖识别蛋白 p o ：p h e n o l o x i d a s e ，酚氧化酶 p p a e ：p r o p h e n o l o x i d a s e - a c t i v a t i n ge n z y m e ，酚氧化酶原激活酶 p r o p o ：p r o p h e n o l o x i d a s e ，酚氧化酶原 p r p s ：p a 技e mr e c o g n i t i o npr o t e i n s ，模式识别蛋白 1 2 6 毛蚶( s c a p h a m ak a g o s h i m e n s i s ) 血红蛋白的类酚氧化酶活性及其e d n a 克隆的研究 r o i s ：r e a c t i v e o x y g e ni n t e r m e d i a t e s ，活性氧中间体 e d n a ：c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d ，互补d n a d s c d n a ：d o u b l e s t r a n de d n a ，双链e d n a b p ：b a s ep a i r ，碱基对 b s a - b o v i n es e r u ma l b u m e n ，牛血清蛋白 d e p c ：d i e t h y lp y r o e a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 d n t p - d e o x yn u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ( am i xo f a ，t ，c ，g ) ，脱氧核苷三磷酸 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e p ：e p p e n d o r ft u b e ，微量离心管 i p t g ：i s o p r o p y l 一1 - t h i o - 1 3d - g a l a c t o s i d e ，异丙基- p - d 一半乳糖苷 l b ：l u r i a - b e r t a n i ，l b 培养基 t r i s ：t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 r r a i n ：r e v o l u t i o n m i n ，转| 分 t a q ：l l sa q u a t i u s ( d n ap o l y m e r a s e ) ，d n a 聚合酶 t a e ：t r i s a c e t a t ee l e e t r o p h o r e s i sb u f f e ，t d s 醋酸缓冲液 m r n a ：m e s s e n g