（微生物学专业论文）黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学性质研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论黑曲霉双功能术聚糖酶的纯化学位 文题目与酶学性质研究 级别 硕士 学 学生 闰欣 科 微生物学 导师 陈红歌 姓名号姓名 业 学位论文 哲如需保密解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包台其他人己经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名；闰妖导师签名：7 莩王节 日期：z 印# 年拥f ，日日期：) 呻萨月日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 研究生签名：闰钟飞导师签名：7 导# 弘学院领导签名：l 高篓l 致谢 本文是在导师陈红歌副教授的悉心指导下完成的，从论文的选 题、试验设计、论文的构思到语言的修善，都给予了精心的指导。 恩师严谨的治学态度，一丝不苟的工作作风，开拓创新的学者风范 及对科学事业的执着追求，给我留下了深刻的印象，将使我终身受 益。三年来，恩师对我的培养倾注了大量的心血，谨此对恩师的教 诲表示衷心的感谢并献上我诚挚的敬意。 三年来，科研过程中得到了贾新成教授、吴云汉教授、宋安东 副教授和张世敏老师的指导，有幸聆听了吴坤教授、丘立友教授的教 诲，并得到了微生物教研室的全体老师和实验室赵柏叶老师、胡瑜老 师、赵玉萍老师的支持和帮助。同时，院各位领导、校研究生处的各 位老师，在我学业和论文完成之中也倾注了他们的精力和关怀! 谨此 表示忠心的感谢! 南京农业大学胡元森师兄，0 0 级研究生樊剑明，0 1 级研究生许 君，0 2 级研究生赵玮莉、吕洋、候保朝、靳赛、王海胜、刘韶松等， 0 3 级研究生崔锦、张宇婷、刘亚锋、杜国营、康清浦、周利霞等，0 4 级研究生吕帅、鲁晓娟、张品品，o l 级本科生李丹、沈浩等同学在 实验过程中都给予了热情的帮助，使论文得以顺利的完成，在此一并 表示感谢。 感谢我的父母、亲人和朋友三年来给予我的支持和鼓励，是他们 的无私奉献让我没有后顾之忧，全身心地投入到学习和工作中。 最后，再次向所有曾经关心我学习和成长的师长、同学和朋友们 表示真挚的谢意。 闫欣 2 0 0 6 年6 月于郑州 微生物学硕士论文黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学件质的研究 捅姜 通过酶谱分析和切胶检测，发现黑曲霉a - 2 5 发酵液分别产生的三型木聚糖酶( 命名为 x y n l 、x y n i i 和x y n l i i ) 和三型b 一( 1 ，3 - 1 ，4 ) - 葡聚糖酶( 命名为g l u i 、g l u i i 、g l u i ) 。 x y n i i i 与g l u h i 属于同一酶蛋白，即x y n h l 同时具有p 一( 1 ，3 - 1 4 ) 一葡聚糖酶活性。 通过超滤及两次d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 b 离子交换层析将x y n i 纯化至电泳级均一纯， 经s d s - p a g e 测得x y n n | 分子量为2 7 9k d a 。底物特异性鉴定，x y n h l 能够水解桦木木聚糖、 燕麦木聚糖、地农多糖和大麦b 一葡聚糖，对羧甲基纤维素、微晶纤维素以及可溶性淀粉则 没有活性，是一种双功能酶。x y n m 为糖蛋白，糖含量为2 5 6 3 。x y n i l l 的木聚糖酶和b 一( 1 ，3 - i ，4 ) 一葡聚糖酶的最适p h 均为4 6 ，最适反应温度为5 0 ；木聚糖酶在p h 3 6 - 1 0 6 之间稳定，b 一( 1 ，3 1 ，4 ) 一葡聚糖酶在p h 2 6 - 1 0 6 之间稳定；将酶液在2 0 - 8 0 水浴保温 l h ，两种酶活在5 0 c 的范围以内均非常稳定，木聚糖酶活几乎不变，8 一( 1 ，3 - l ，4 ) - 葡聚糖 酶活也在9 0 以上，当大于5 0 c 时，两种酶活性均迅速下降。c r ，c + ，c u 。，m n “，p b 2 + ， k + ，h 矿，z 砰+ ，e d t a 对木聚糖酶和b 一( 1 ，3 - 1 ，4 ) 一葡聚糖酶的活力均有不同程度的抑制，f e ” 和m g z 对两酶活均有激活作用。两种酶活性不仅显示了相似的最适p h ，p h 稳定性，而且显 示了相似的最适温度，温度稳定性。另外，金属离子对这两种酶活性的影响也趋于一致。 动力学分析表明，以桦木木聚糖为底物，木聚糖酶的v m a x 和砌分别为0 2 5 8 州m i n m l 和4 5 4m g m l ；以地农多糖为底物，b 一( 1 ，3 - i ，4 ) 一葡聚糖酶的p h h j 和j 白分别为0 1 4 9 a m i n m 1 和l o 0 2m g m l 。而竞争性动力学分析表明，木聚糖和地农多糖竞争x y n i i i 的同一 活性中心。纤维素绑定结合实验证实，x y n i i i 具有纤维素结合结构域。 这些结果显示x y n m 是一种新的双功能酶，其木聚糖酶和b 一( 1 ，3 - 1 ，4 ) 一葡聚糖酶活性 是由x y n o i 的同一活性位点来完成的。 关键词：双功能酶，木聚糖酶，b 一( 1 ，3 - i ，4 ) 一葡聚糖酶，黑曲霉，纯化 微生物学硕十论文黑曲霉双功能术聚糖酶的纯化与酶学件质的研究 1 文献综述 1 1 多功能酶简介 多功能酶( m u l t i f u n c t i o n a le n z y m e ) 是指一条多肽链具有2 种或2 种以上的酶催化活 性能力，能水解不同底物，是一种非特异性酶类。 植物细胞壁作为自然界以固定形式存在的碳元素的主要储存库，有三种主要组成成分： 纤维素，半纤维素以及木质素，它们紧密的结合在一起，形成一道抵御异类入侵的天然屏障 “1 。为了能够在这种环境中生存，微生物必须自身合成不同种类的酶来水解和利用这些纤维 素、半纤维素。这些酶多是以多酶复合体形式存在，其中包括纤维素酶、木聚糖酶和纤维素 绑定因子，它们因此也被称为纤维素酶体”或者木聚糖酶体”1 ；另一种策略是产生一种多功 能酶，能够作用于多种不同的底物。许多微生物都能产生这种多功能酶，比如t r i c h o d e r a m i r i d e 产生的外切羧甲基纤维素酶能够水解纤维寡糖、羧甲基纤维素和木聚糖；由 b a c i l l u se i r c u l a n sf - 2 ”1 产生的b - i ，4 - 内切葡聚糖酶不但能够水解羧乙基纤维素，羧甲 基纤维素，而且有很强的木聚糖降解能力；c a l d o c e l l u ms a c c h a r o l y t i c u m ”和r u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s ”能产生一种具有两个独立的催化区域多功能酶蛋白，前者的两个催化区域分 别能够水解蚕豆胶，魔芋葡甘露聚糖和羧甲基纤维素，燕麦木聚糖和地农多糖，而后者的则 能够水解木聚糖和地农多糖。 一些木聚糖酶因其在种旗类别和分子进化上原因，使它和一些b 一葡聚糖酶以及纤维素 酶具有一定的同源性，在某种程度上也能水解葡聚糖、纤维素和其它半纤维素。例如 a s p e r g i l l u sn i g e d ”产生的木聚糖酶能够水解木聚糖和结晶纤维素。p e n c i l l i u m c o r y l o p l t i l u m ”产生的木聚糖酶p a r tc 具有水解羧甲基纤维素，木聚糖和对硝基酚木耱苷 三种底物的能力。由于这些木聚糖酶本身并不多见，又具有这种多元化的能力，因此，在造 纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中将会有非常广阔的前景，这也使得它们在科研 和生产中受到越来越多的关注和青睐。 1 2 木聚糖 1 2 1 木聚糖的化学结构 木聚糖是植物细胞壁的主要成分。作为最常见的半纤维素成分，它在不同的组织中含量 是不同的：裸子植物中木聚糖的含晕相对较少，仅占到了7 1 2 ；而被子植物则达到了1 5 3 0 “，特别是在白桦木中木聚镑含量占到了细胞干重的3 5 “。木聚糖主链是由b - d 吡喃 型木塘单元通过b i ，4 - 糖苷键连接而成的多聚物。如图i 所示，大部分木聚糖是异型多糖， 在侧链上有多种替代糖基，常见的有乙酰基、阿拉伯耱残基、葡萄糖残基“”。只有木糖残基 组成的木聚糖称为同翟j 木聚糖，这种类犁的木聚糖在自然界不多，人们只从几种植物中分离 出来过即羽状草1 、烟草茎杆“，瓜尔豆种子壳1 。 2 微生物学硕 论文黑【| f 霉双功能术聚糖酶的纯化j 酶学寸牛质的研究 图1 木聚糖结构 f i g 1s t r u c t u r eo fx y i a n 木质纤维中的木聚糖可分为硬木和软木木聚塘。硬木木聚糖是高度乙酰化的，即o - 乙 酰基- - 4 一o 甲基葡萄糖醛酸木聚糖，聚合度( d p ) 高达1 5 0 2 0 0d p ：每1 0 个木糖残基连接一 个4 - 0 - 甲基葡萄糖醛酸。硬木木聚糖是高度乙酰化的，如桦木木聚糖( b i r c h w o o dx y l a n ) 每2 个d - 木糖残基至少含有1 个的乙酰基团。乙酰化更多发生在c _ 3 位点，其次是c 一2 位 点。这些乙酰基团使得木聚糖具有部分可溶性。碱处理之后乙酰基团即被除去。软木木聚糖 即阿拉伯一4 o - 甲基葡萄糖醉酸木聚糖，聚合度较低( 7 0 1 3 0d p ) 。分技较少。它比硬木 木聚糖组成中的4 o _ 甲基葡萄糖醛酸含量更高，连接到c - 2 位点，是非乙酰化的，但代替 乙酰基的是。一l - 呋喃型阿拉伯糖基，通过a 一1 ，3 - 糖苷键连接到木糖的p 3 位点。阿拉伯糖 苷大约为木糖最的1 2 ”。 1 ，2 2 木聚糖的立体结构 a t k i n s ”描述了木聚糖分子的三维结构( 图2 ) 。在结晶条件下，木聚糖主链呈三重左手 构象，配糖键几何学特征不受侧链影响。对该多糖研究结果表明，主链的约束程度最小化， 侧链之间的相互作用决定了分子最终构象。电子衍射模式也证实了其三重构象，而侧链排成 为带六边形的三角系点阵。木糖环上第5 位单个氢对链间和链内氢键的相互作用具有显著影 响。能量计算暗示d - 木糖环存在有共同的4 c i 椅式构象，这表明在卜4 和卜3 糖苷键连接 的木聚糖中，其键为双平伏键，链内氢键0 ( 2 ) h 0 ( 6 ) 加强0 ( 3 ) 0 ( 5 ) 问氢键 有利于结构的双重伸展，即象带状的螺旋结构、以及o ( 6 ) h 基团与邻近0 ( 3 ) 原子之间氢键 形成折叠片。这些研究结果同时也得出了糖苷键几何学特征维持了木聚糖分子的基本构象。 然而从水相环境中得出木聚糖三维结构数据可能对于了解木聚糖和木聚糖酶相互关系更为 重要。 3 微生物学硕士论文黑曲霉双功能术聚糖酶的纯化i 一酶学件质的研究 卜。基 小。如 弘 i 乙 住 图2 木聚糖的立体结构 f i g 2t h r e e - d i m e n s i o n a is t r u c t u r eo fx y l a n 1 3 木聚糖酶 木聚糖酶( x y l a n a s e ) 是一类木聚糖降解酶系( 如表1 ) ，对降解自然界大量存在的半 纤维素起着重要作用。b - 1 ，4 - 内切木聚糖酶( e c 3 2 1 8 ) 能够以内切方式作用于木聚糖 主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖。因此是木聚糖降解酶中晟关键的酶。b 一木糖苷 酶( e c 3 2 1 3 7 ) 作用于木寡糖的末端，释放出木糖残基。虽然许多木聚糖酶能够水解木 聚糖或木寡糖释放出木糖糖苷，但只有b 一木糖苷酶能水解木二糖。a - l 一阿拉伯糖苷酶、a - l - 葡萄糖醛酸酶和酯酶则在降解侧链时起作用“ 1 3 1 木聚糖酶的多样性 木聚糖酶在自然界分布很广，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和反自 动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在木聚糖酶。研究较多 的是微生物产生的木聚糖酶，微生物常常产生不止一种类型的木聚糖酶即具有多样性，而且 这些木聚糖酶的特性也存在差异。造成微生物木聚糖酶多样性的原冈很多，或者是不同基冈 的产物，或者由于微生物分泌蛋向酶的水解作用，或者由于不同稃度的修饰作用如糖基化和 4 微生物学硕士论文翼曲霉双功能木聚塘酶的纯化酶学性质的研究 表1 木聚糖降解酶系 t a b l e1x y i a n o l n i ce n z y m es y s t e m s 术聚糖降解酶 b - 1 4 - 内切术聚糖酶 口一木糖苷酶 n l 一呋喃型阿拉伯糖苷酶 。一葡萄搪醛酸酶 乙酰酯酶 酚酸脂酶 x y l a n o l y t i ce n z y m e e c 3 2 1 8 ：1 ，4 - p - d - e n d o x v l a n a s e e c 3 2 1 3 7 ：p - x y l o s i d a s e o l a r a b i n o f u r a n o s i d a s e a g l u c u r o n i d a s e a c e t y le s t e r a s e p h e n o la c i de s t e r a s e 酰胺化2 “。根据许多糖苷键水解酶催化区域的氨基酸序列组成和琉水簇分析，可将其分成 许多族( f a m il y ) 。1 。所有的木聚糖酶都属于f 1 0 或6 1 1 族，不同木聚糖酶分子在其氨基酸 组成的数目上相差很大，但它们的催化区在大小上比较一致，同一族中的木聚糖酶催化区域 具有较高的同源性，根据已知酶可以推测未知酶的催化特性高分子量木聚糖酶( 一般分子 量大于3 0 k d a ) 多属于f l o 族，对木聚糖的水解速度快，水解产物为低分子量的寡糖( 聚合 度卜5 d p 左右) ，该族还包括对纤维素和木聚糖都有水解作用的非特异的葡聚糖酶。低分子 量木聚糖酶属于6 1 1 族，对木聚糖的水解速度慢，水解产物为聚合度5 1 0 d p 左右的木寡糖。 1 3 2 木聚糖酶的理化性质 目前对木聚糖酶性质的研究主要集中在细菌和真菌上。大多数微生物来源的木聚糖酶具 有以下基本性质：单旺基蛋白，分子量范围8 1 4 5 k d a ，等电点p i 为3 1 0 ；酶的最适作用 p h 值为4 o 7 0 p h 稳定范围3 o 1 0 0 ；木聚糖酶的热稳定性较好，一般都在4 0 以上， 完全失活温度在6 5 以上。 1 3 2 。1 曲霉木聚糖酶 对于来源于曲霉的木聚糖酶的研究较为广泛和深入( 见表2 ) 。曲霉属所产的木聚糖酶 的最适温度在5 0 c 左右，作用的最适p h 接近酸性( p h 2 0 6 5 ) ，等电点在3 5 9 0 。陈 红歌1 从1 5 0 株真菌中筛选到一株产木聚糖酶活力最高的菌黑曲霉1 4 9 ，其发酵液中存在两 型木聚糖酶x - i 和x - i i ；x _ i 的分子量为7 6 k i ) a ，含有两个相同的砭基，x 一分子量为 2 3 5 - 2 4 k d a ，只有一个亚基。二者的糖含量分别为2 7 6 和7 3 ，最适反应温度分别为5 0 和5 5 ，最适p h 分别为5 2 、4 6 。f e m a n d e z 在研究时发现，构巢曲霉在以木聚糖为 碳源时，至少可分泌3 种内切一b 一木聚萜酶：x 2 2 、x 2 4 和x 3 4 ，分子量分别为2 2k o a 、 2 4 和3 4 k d a ；x 2 2 的等电点为中性，其余两种偏酸性；x 3 4 酶的p i3 4 ，最适温度和p h 分 别为5 6 和6 0 。 微生物学硕 论文黑曲霉双功能术聚糖酶的纯化捕s 学忤质的研究 裹2 曲霉木聚糖酶特性 t a b i e2c h a r a c t e r i z a t i o f to fx y l8 r i s s ef r o ma s p e r g i i u ss p p s p e c i e s e n z y m e胛( 1 0 )p io p t i m u = p h0 p t i m mt e 叩( ) r e f e r p n c e s 1 3 2 2 木霉木聚糖酶性质 在工业生产上木霉常用作纤维素酶的生产菌，而某些木霉同时也能产各种木聚糖酶，见 表3 。从表中可知，木霉所产的木聚糖酶的等电点偏碱性，并且同一种木霉可同时产一种以 上的木聚糖酶，这和其它产木聚糖酶的菌是很类似的。木霉所产的木聚糖酶分子量和曲霉相 似，一般较小。如里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) p c - 3 7 能同时产三种木聚糖酶x y ni 、x y n i i 和x y n ，x u 1 等人对x y n m 的分离纯化和性质进行了研究：x y n 的分子量为3 2 k d a ，等 电点为9 1 ；最适反应p h 为6 0 ，与x y n i i 接近。 t 3 2 3 细菌木聚糖酶 细菌所产生的木聚糖酶一般可按分子餐的大小来划分为：低分子量的含有1 8 2 2 3 4 个 氩基酸残基的酶和高分子鼍的含有2 6 9 8 0 9 个氨基酸的酶。细菌所产生的木聚糖酶一般耐 热性较强，最适作用温度一般在4 0 c 到6 0 c 之间，见表4 。 6 微生物学硕士论文黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学r 质的研究 表3 木霉木聚糖酶特性 t a b l e3c h a r a c t e r i z a t ；o fx y l a n a s ef r o , t r i c h o d e r m as p p s p e c i e s e n z y m e 帅( 1 矿) p l o p t i m u mp h o v t i mt e m p ( ) r e f e r e n c e s t r l c h o d e r m ar e e s e ix y n1 1 95 23 5 - 4 0 【3 2 x y n i i2 19 0 4 5 - 5 5 3 2 x y n m 3 29 1 6 0 3 2 tk o n i n g i i 21 7 77 35 0 - 5 55 0 3 3 l2 97 2 44 5 - 6 o6 0 3 3 fh a r z l a n u m fv i r i d e a2 0 b2 2 c2 9 2 2 1 6 d 一15 3 9 4 8 5 9 5 9 3 5 0 45 - 5 0 5 0 5 0 5 5 - 6 0 1 7 89 24 8 5 0 4 5 5 0 6 0 6 5 5 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 3 8 3 9 4 0 3 5s o 【4 1 表4 细菌木聚糖酶特性 t s b l e4c h a r a c t e r i z a t j o fx y i & n a s ef r o , b a c t e r i a s p e c i e s e n z w em w ( 1 矿) p lo p t i m u mp ho p t i = u mt ( ) r e f e r e n c e s b a c i l l u s s pw 1 且c i r c u l a r s w l 1 2 且c o a g u l a n s & s u b t i l u s i i i 酽 k 2 l5 4 9 5 1 5 8 5 2 2 3 2 9 5 8 5 3 6 9 1 4 5 1 0 0 6 o 7 0 5 5 7 0 5 5 7 o 6 0 5 0 5 5 ap u m i l u s 2 46 5 6 5 4 2 7 0 4 2 4 3 4 3 3 t 4 4 5 0 4 5 5 0 4 6 4 5 5 0 4 7 m i c r o c o c c u s s p a r - 1 3 5 5 67 5 9 05 5 4 8 t h e r m o t o 口r i t i m am s b 8 1 2 05 65 49 2 4 9 7 微生物学顾士论文黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化酶学件质的研究 1 3 2 4 其它真菌木聚糖酶 除以上种类的微生物能产木聚耱酶外，一些酵母菌和链霉菌也能产生木聚糖酶，不同种 属所产生的木聚糖酶的理化性质有所不同，分子量相差很大，等电点的跨度也较大，而反应 温度和p h 略有差别，如表5 所示。 袭5 其它真菌木聚糖酶特性 t a b l e5c h a r = c t e r i z a t i o fx y i a n a s ef r o mo t h e rf u n g i n 1 3 3 木聚糖酶的分子结构 在分子水平上，木聚糖酶由功能或非功能结构域和连接区( 1 i n k e rs e q u e n c e ) 组成，功 能结构域又可进一步分为催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 和纤维素结合结构域 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合结构域( x y l a nb i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 等”。 根据结构的相似性，木聚糖酶可以通过结构域的改组和随后的结构域的修饰而进化。 1 3 3 1 纤维素结合结构域 在木聚糖酶分子中常含有一种独立的无催化功能的区域，即纤维素结合结构域，该区域 可以和结晶纤维素结合，其主要特征是：( 1 ) 在靠近n 末端和c 一末端分别有一个c y s ；( 2 ) 除g i y 、a s p 之外还含有4 个很稳定的t r p ；( 3 ) 带电氨基酸的含晕低。将c b d 或c b d 、中间 区域，连接序列一并除去，仅影响酶与纤维素的结合能力，但酶的底物特异性、酶活性和 妇，以及对可溶性的木聚糖的水解能力不变1 。虽然c b d 对催化功能不是必须的，但它们能 调节酶对可溶性和不溶性纤维素底物的特殊活力。例如，类碱纤维单胞菌1 ( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 中木聚糖酶d ，它的全长和截短形式对水解纸浆木聚糖是等效的，但含有的酶衍生物 能更有效的降低k a p p a 值。 8 微生物学硕士论文黑曲霉双功能术聚耱酶的纯化与酶学忭质的研究 1 3 3 2 木聚糖结合结构域( x b d ) 木聚糖结合结构域( x b d ) 和纤维素结合区域一样也是酶分子中独立的无催化功能区域， 能和木聚糖结合。x b d 与c b d 相比在木聚糖酶分子中较少发现。其原因可能是木聚糖多聚物 中带有许多类型的取代基，由于取代基的变化从而使能够结合所有木聚糖蛋白区域的进化成 为不可能的”“。 一般情况下，酶与底物的结合需要静电作用，亲水性作用，电荷传递作用或氢键，影响 结合的主要参数是环境中的盐浓度和种类，温度和p h 值。对于木聚糖酶与木聚糖的结合主 要是通过离子之间的相互静电作用而非特异性结合的，因为木聚糖含有大量的4 o - 甲基葡 萄糖酸残基等可电离侧链基团，带有大量的负电荷，木聚糖酶在p h 低于p i 带正电荷，容易 与木聚塘结合，而p h 等于或高于p i 时，基本不结合，导致大部分木聚糖酶在酸性环境中发 挥作用1 。 1 3 3 3 木聚糖酶催化结构域( c d ) 木聚糖酶的c d 区承担着酶的水解特性，并作为该酶分类的基础。根据对粪碱纤维单胞 菌( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 双功能酶c e x 的酶活力测定和差示扫描热量测定显示，蛋白质的c s d 和c d 是分别折叠的，比较浅白隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 的木聚糖酶的氨基酸序列 与鸡卵清中的溶菌酶的催化区域有一些同源性1 。木聚糖酶的氨基酸组成在数鼋上变化很 大，但其催化结构域在大小上都趋向一致。 根据对糖苷水解酶的催化结构域的氨基酸的同源性和疏水簇分析法，所有己知的糖苷水 解酶可分为5 8 个家族，而木聚糖酶被分为糖苷水解酶第l o 家族和第1 1 家族木聚糖酶 的催化结构域表现着酶的水解特性，并作为酶分类的基础。同一族的木聚糖酶的催化结构域 具有同源性，6 1 1 家族木聚糖酶分子有4 0 9 0 的同源序列。通常f 1 0 、g 1 1 两家族之 间木聚糖酶催化区的氨基酸序列和催化墓团的周围序列无有意义的同源性，表明这两个家族 在进化上来源于不同的祖先基因，并且有不同的折叠方式。f 1 0 、g 1 1 两家族在催化特异 性上也存在差异。 1 3 3 4 连接序列( ii n k e rs e q u e n c e ) 连接序列位于催化结构域和纤维素结合结构域之间，赋予了蛋白质结构的柔韧性。一般 连接区中富含p r o 或带羟基的氦基酸，或两者都有。这些氮墓酸被广泛的o - 糖基化，根据 酶的来源不同，连接区的序列长度和它们所含有的p r o 或带羟基的氨基酸数量都不同。有的 连接序列还有其它作用区域的存在，如在热介纤维素梭菌1 ( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 的木聚糖酶c 中，催化结构域和连接序列末端之间的短连接区发现含有一个锚结构域，它负 责多纤维素体的装配。 重复序列( r s ) 和热稳定序列( t s ) 不是酶发挥作_ i j 所必需的，但是能保持酶的稳定和耐 热，协助酶作用的发挥。除了这些区域外，在多区域木聚糖酶中还存在某些未知功能的1 r 催 化区，它们表现出序列的高度变化。多聚糖酶类的1 f 催化区要比催化区的进化自由度人得多 9 微生物学硕十论文具曲霉双功能术聚糖酶的纯化与酶学件质的研究 m i o 1 3 4 木聚糖酶的催化机制 1 3 4 1 酶的催化特性 ( 1 ) 酶催化的多功能性 根据木聚糖酶对底物的特异性不同，可分为特异性酶和非特异性酶。特异性酶只作用术 聚糖底物，具有高度的专一性。然而，许多木聚糖酶为非特异性的，它们除作用木聚糖外， 还作用于大麦葡聚糖、地衣多糖、纤维素等等。根据对k c a 亡k m 值测定，可确定弗特异性酶 是以木聚糖酶为主，还是以其它酶活为主。这些酶基本上是以木聚糖酶活性为主，而第二或 第三种酶活性并不高。因此，它们也被称之为多功能木聚糖酶。对于这些酶的不同，有些是 因为其酶蛋白具有两个或两个以上的催化性功能结构域；而有些木聚糖酶虽然仅有一个催化 结构域，但却能水职多种不同的底物；还有一些是因为酶蛋白中底物结合基团的不同，导致 了非天然底物的水解能力。 近年来，飞速发展的分子遗传学为木聚糖酶进化研究提供了一种新的途径，一直以来人 们认为，相应位置上的氨基酸残基起源于共同的祖先或者具有相似的生物学功能。通过序列 校准可获得关于功能和进化亲缘关系有价值的信息。在进化过程中，对酶分子结构，催化具 有重要意义的氮基酸残基往往高度保守。通过对木聚糖酶，b 一葡聚糖酶以及纤维素酶氨基 酸序列的对比和疏水簇分析揭示了它们的催化结构域可能有着共同的祖先1 ，只是这些酶在 随后的进化过程中处于完全不同的环境中，向着不同的方向发展。 ( 2 ) 糖苷键类型 通过对混合型木聚糖的水解研究表明，木聚糖酶通常有特异的差向异构性，只水解b 一1 ，4 一糖苷键，并且两侧都是b l ，4 一糖营键，另外b 一1 ，4 - 糖苷键连接的片段长度对酶的活 性也有影响，要求有4 个或4 个以上的糖基。木聚糖酶还具有转糖苷作用，导致产物产生与 底物相同的糖苷连接方式，这可能因为在木聚糖酶的催化位点的两边含有立体特异性结合位 点。但在c r y p t o c o c c u sa l b i d u s 中的b - i 。4 - 木聚糖酶在转移反应中形成b 一1 ，3 - 糖苷键。 海洋环境中的细菌、真菌和藻类中”1 ，除了b - i ，4 - 木聚糖酶外还有b i ，3 - 木聚糖酶，此 时b - i ，4 - 木聚糖酶只水解b - i ，4 - 木聚糖，b - i ，3 - 木聚糖酶只水解口一l ，3 一木聚糖。 ( 3 ) 主链和侧链的作用 木聚糖酶除了切断主链之外，根据它们是否可以催化释放出阿拉伯糖等侧链取代基，可 分为脱链酶和菲脱支链酶。前者可释放阿拉伯糖等侧链取代基，后者无此作用。脱支链酶与 阿拉伯糖苷酶是不同的，因为阿拉伯糖茁酶不能作用人工合成的阿拉伯糖和木聚糖主链。在 同一种生物中可同时拥有脱支链木聚糖酶和非脱支链木聚耱酶，这可能与确保最大限度水解 木聚糖有关。 ( 4 ) 取代基对酶活性影响 大多数内切酶对复杂的多糖不易作_ j 。囡为复杂多糖缺少连续的相似的糖和糖苷键，特 1 0 微生物学硕十论文 里曲霉双功能术聚糖酶的纯化酶学性质的研究 别是丰富的支链如阿拉伯糖，葡萄糖醛酸和乙酰基可能阻碍了内切作用，所以含有大量的阿 拉伯糖等侧链基团的半纤维素由于取代基的复杂很难被降解。但黑曲霉1 ( n i g e r ) 来源的 两个同工异构1 f 脱支链木聚糖酶，对线性寡聚木聚糖活性很低，并对无阿拉伯糖分支的不溶 性木聚镑没有活性，推测酶作用位点在木聚糖骨架靠近分支点附近，因此阿拉伯糖不仅结合 在活性位点，并且对底物在活性位点的正确取向是必需的。 1 3 。4 2 木聚糖酶的分子水平作用机制 木聚糖酶的水解反应是典型的酸碱和亲核水解反应，根据产物异头物构象的不同，木聚 糖酶降解木聚糖的催化反应可分为两大类，即保持异头构型的两步置换反应和形成倒位异头 构型的一步置换反应。 ( 1 ) 保持异头构型的两步置换反应 在木聚糖酶的活性中心可能结合6 个木糖苷残基，催化反应第一步是活性位点的g l u 残基的羧基作为质子供体，将h 提供给c l - o h 键的o h 上，这样c r o h 键断裂。并产生具有环 内正碳离子的中间过渡物。第二步产生的糖基片段从活性部位移去。第三步正碳离子的形成 促使初始还原糖的环发生变形，并通过与离子化的g l u a s p 的羧基的静电作用而稳定。第四 步水分子从糖苷的氧侧进入，被第一步产生的离子化的g l u 羧基解离，这导致o h 一离子与正 碳离子反应，同时g l u 的羧基重新质子化被还原。这种机制中，质子化的g l u 先是作为普通 酸催化荆，在反应中使h + 变为离子，后来作为普通碱催化剂，激活进入的水分子，因此， 反应产物可保持异头构型。这种机制与溶菌酶反应机制相似。 ( 2 ) 倒位异头构型的一步置换反应” 一步置换反应是由一个普通酸g l u ，一个普通碱g l u 一a s p 一和亲核水分子的攻击一次完 成的。在这个过程中酸催化剂g l u 的 - c o o h 提供h 给以0 4 ，碱催化剂g l u 一a s p 一作用于亲 核试剂h ，使 1 2 0 中0 h 一与正碳离子作用，加入羟基，但羟墓的异头构型发生倒置。另外， 产生的h + 通过扩散与离子化的酸催化剂结合，恢复质子状态。这种机制与淀粉酶反应机制 相似。 1 3 5 木聚糖酶的应用 近几十年来，木聚糖和木聚糖酶的应用潜力一直吸引众多的研究者为之奋斗。木聚糖酶 可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸，纺织等行业。目前，降低木聚糖 酶的生产成本和提高其应用适应性是亟待解决的问题。 1 3 5 1 生物转化”。 在木聚糖醑解酶系的共同作用下，木聚糖可被转化为d 木糖单体，而d _ 木糖可用于生 产重要的糖类替代品一木糖醇，又可被细菌、酵母及真菌转化成为有价值的燃料和化工原料。 以富含木聚糖的植物资源为原料，经过内切型木聚糖酶( e c 3 2 1 8 ；l ，4 8 一e n d o x y l a n a s e ) 水解后，分离、精制而制得功能性低聚木糖。低聚木糖即木寡糖( x y l o o l i g o s a c h a r i d e s ) 的 聚合度为2 7 d p ，糖度约为蔗糖的4 0 ，对p h 值及热的稳定性好，极难被消化吸收，肠道内 微生物学硕十论文 黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学件质的研究 残存率高，具有极好的双歧杆菌增殖性，其选择利用性高于其它功能性低聚糖。总之，可将 木聚糖及其水解产物生物转化为液体燃料，单细胞蛋白、溶剂、功能性甜味荆等 1 3 5 2 制浆造纸工业” 1 9 8 6 年芬兰科学家v i k a r i 等发现用木聚糖酶处理纸浆，可降低漂白时氯的用量，减少 环境污染。目前这一研究，进展很快，每年均有大量的论文和专利文献发表，并在许多国家 实现了工业化应用。在造纸工业中，传统的化学漂白方法是采用多步骤的氯、二氧化氯漂白 及碱提取来去掉木质素，在废水中含有大量的氯及有毒的、强烈致癌致畸物质，造成严重的 环境污染。木聚糖酶作为生物漂白荆可用来预漂纸浆，提高木质素溶出率，减少化学漂白剂 用量，从而减少环境污染，并可改善纸张性能。由于在利用木聚糖酶对纸浆进行预漂时，硫 酸盐蒸煮的纸浆为温度较高的碱性浆，这就需要所用木聚糖酶具有耐高温和耐碱的特性。关 于木聚糖酶制浆造纸工业的应用是研究工业化应用木聚糖酶的热点之一，主要包括对纸浆的 漂白、二次纤维的脱墨、增加二次纤维的游离度和降低能耗等方面。 1 3 5 3 食品工业1 面粉中的非淀粉多糖( n s p ) 主要是戊聚搪，尽管只占小麦粉干重的3 1 5 ，但对面团的 流变学特性及制品的品质等有显著的影响。适量添加戊聚糖酶( 主要是木聚糖酶) 能够提高面 团的机械加工性能，消除发酵过度的危害，增大面包体积，改善面包心质地以及延缓老化等。 添加木聚搪酶还能够降解果汁、葡萄酒中的一些多糖类物质，因此有助于它们的澄清。此外， 木聚糖的水解产物可以用作低热量甜味剂、脂肪代用品、食品增稠和抗冻剂等。 1 3 5 4 饲料工业” 可作为饲料添加荆加入到动物饲料中，将其中的木聚糖部分水解，使得与其相连的纤维 素更容易被瘤胃消化，从而可以改善农作物青贮饲料及谷物饲料的营养价值。 i 35 5 其它” 可用于咖啡、植物油和淀粉的提取。木聚糖酶可作为复合酶制荆的一个重要组成部分， 使植物组织软化，使细胞破壁，有利于有效成分的充分提取，同时大大降低提取液的枯度， 而粘度的降低可使生产中的浓缩或干燥的效率成倍提高，也相应降低生产成本。 1 2 微生物学颐t 论文熏曲霉双功能本聚瓣晦i l 纯f t j 酶学性质的研究 2 引言 禾谷类农产品作为发酵和饲料工业中的重疆原拜，具有不可替代的地位。但是，植物细 胞瞳中以木聚搪为主，包括一葡聚糖在内的限制因子的存在，对跟科的利用幂j 转化影响非 常大。在发酵工业中，由于高分予量本聚耨和b 一葡聚糖粘度较丈，对啤酒的质量和稳定性 有很大影响。它们溶于麦汁中，会8 起菱汁牯度增丈，过滤困难，得率降低；同时，引起啤 酒灼雾状浑浊和凝胶沉淀，造成啤酒非生物不稳定性；另外，术聚耱和一葡累糖还会与蛋 白质结合，使酵母搴期沉积，降低发酵麈，延长双乙酰还原期。这些因素的存在严重影响啤 酒滔体的清晰度、泡沫、保质期等备项指标。两在饲料工业中，术聚耱和p 一葡聚糖这些非 淀耪多捂的存在不但能引起动物的抗营莽作用，阻碍营养物质尤其是艏肪和蛋白的消化吸 收，降低饲辩的转化率；而且还改变肠道微生物菌群，延长了食糜在消化道内的滞留时间， 大大减少了菌群的移动，使细菌得以在小肠上段大量定屠下来。加剧宿主和细菌之间对营养 物质的竞争，减少养分的吸收。增加动物腹泻的发生率，抑制动物的生长”。 为了解决上述闽题，研究者通常采用在发酵液域饲料中添加术聚耱酶和b 一葡聚糖酶复 合型酶割桶的方法。但这其中存在很多问题，主要的有两方面。一是在生产过程中须添加两 种酶制莉，增加生产成本，不利于市场竞争；另一方面，复合酶制荆的配比问题：如何选择 适合饲粮类型和饲葬动物的酶的种类，添加比例和数鬣，进行合理的配比，是目前蔷遍存在 的个问题。强前尚缺乏复合酶制 ! l 配比的科学依据，其中很大的原因就在于对复合酶制荆 中单酶组分及单酶之间的互作规律了懈不充分。在复合酶制制中单酶的添加量该是多少，它 与相应底物之间的关系如何等等闻题都是有待于解决的难题。而多功能酶基本上不存在上述 闯题，在相同条件下的添加量也非常简单，因此在应用方蔼，它比复合型酶制荆更有利。到 目前为止，关于多功能木聚糖酶的研究和应用并不多见，酶学性质和作用机理也不清楚因 此，非常有必要在理论和实践方面对这种酶做深入和细致的了解。 本实验旨在寻找既一种具有术聚糖酶活性，又具有b 一( 1 ，3 - l ，4 ) 一葡聚糖酶活性多功能 酶。方面通过定的方法将其纯化出来；另一方蕊，蘅鼹于基本的酶学性质，进行该酶约 作用机理和功能结构域籀互关系研究。 微生物学硕十论文 黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学件质的研究 3 材料与方法 3 1 菌种 黑曲霉a - 2 5 ，河南农业大学微生物实验室保存菌种。 3 2 主要仪器 u v - 2 0 0 0 型紫外分光光度计，上海尤尼克公司生产；雷磁p i s j 一3 f 型p i i 计，上海精密 科学仪器有限公司产品；3 r 1 8 型高速冷冻离心机为s i g m a 公司产品；v l v a f l o w2 0 0 超滤器 由s a r t o r i u s 公司生产；多功能凝胶成像分析系统；t h - 5 0 0 梯度混合器和s b s 1 0 0 数控计 滴自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂生产；d y y i l i a 稳压稳流电泳仪、d y y - 2 8 a 型电泳 槽由北京六一玻璃仪器厂生产。 3 3 主要试剂 桦木木聚糖产自f l u k a 公司，燕麦木聚糖、地农多糖、大麦葡聚糖、羧甲基纤维素、微 晶纤维素、可溶性淀粉、丙烯酰胺均产自s i g m a 公司；t e m e d 和过硫酸铵购自华美生物工程 公司。进口分装；d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 b 为p h a r m a c i a 产品；其他试剂均为国产分析纯。 d n s 试剂的配制：3 1 5 9d n s 溶于1 3 1 m l2 mn a o h 热溶液中( 1 0 4 8 9n a o h 溶于1 3 1 m l 蒸馏水中) ，加入2 5 0 m i 酒石酸钾钠热溶液( 9 1 9 酒石酸钾钠溶于2 5 0 m i 蒸馏水中) ，再加2 5 m l 苯酚( 固体加热) 和2 5 9n a 2 s 如溶解后定容到5 0 0 m l ，贮于棕色瓶中7 天后使用。 福林试剂的配制：见参考文献”。 反应中的缓冲液：p h 4 6 的0 2 m 的醋酸缓冲液，p i l l 6 - 2 6 的0 1 m 甘氨酸盐酸缓冲液， p h 3 矗7 6 的o i m 柠檬酸磷酸氢二钠，p h 8 6 ，1 0 6 的0 i m 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液。 3 4 培养基 斜面培养基：p d a 培养基。 产酶培养基：大麦粉，4 ；玉米浆，2 ：n a n 0 3 ，0 4 ：n a 2 h p 0 4 ，0 1 ：m g s 0 4 7 h 2 0 。0 0 3 ： f e s o , 7 h 2 0 ，0 0 1 ：c a c 0 3 ，0 5 ：t w e e n8 0 ，0 2 。 培养条件：3 0 0 m l 三角瓶装液量5 0 m l ，接入一环孢子，置于旋转式摇床上，2 2 0 r p m ，3 0 培养8 4 个小时。 3 5 粗酶液的制备 将培养后的发酵液四层纱布过滤，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，上清即为粗酶液。 3 ，6 酶活力测定方法 木聚糖酶活力：取0 1 m l 适当稀释酶液，0 1 m l2 桦木木聚糖，加入到0 8 m l 的醋酸钠 缓冲液中( 0 2 m 、p h 4 6 ) ，5 0 c 水浴反应1 5 m i n ，加入0 6m ld n s 试剂终止反应，沸水浴煮 沸1 5 分钟，定容到5 m l ，5 5 0 n m 波长下测定吸光度( 以木糖计) 。以每分钟产生1um o l 木糖 作为1 个酶活力单位( u ) 。 b ( 1 3 - 1 4 ) 一葡聚糖酶活力：取0 5 m l 适当稀释酶液，0 5 m l0 7 地农多糖，5 0 c 水浴 反应1 0 r a i n ，加入i m ld n s 试剂终止反应，沸水浴煮沸1 5 分钟，定容剑5 m l ，5 5 0 n m 波长下 1 4 微生物学硕士论文黑曲霉双功能术聚糖酶的纯化与酶学性质的研究 测定吸光度( 以葡萄糖计) 。以每分钟产生1p m o l 葡萄糖作为1 个酶活力单位( u ) 。 纤维素酶活力测定：方法同木聚塘酶活力测定，将底物换成羧甲基纤维素，以每分钟产 生1 t a n o l 葡萄糖作为1 个酶活力单位) 。 淀粉酶活力测定：方法同木聚糖酶活力测定，将底物换成可溶性淀粉，以每分钟产生 i u m o l 葡萄糖作为1 个酶活力单位( i n 。 3 7 电泳方法 聚丙烯酰胺( p a g e ) 参照d a v i s 方法进行，浓缩胶为5 ，分离胶为8 ；s d a - p a g e 参照 l a e m l i 方法进行，浓缩胶为5 ，分离胶为1 0 n , 6 。 3 8 酶谱检测 木聚糖酶酶谱检测：称取0 1 9 桦木木聚耱和0 3