（环境科学专业论文）高效聚磷菌的分离及其特性研究.pdf

目 录 i 目 录 中文摘要中文摘要 . vi abstract . viii 第一章第一章 绪绪 论论 . 1 1.1 课题研究背景课题研究背景 . 1 1.1.1 我国水体污染及水体富营养化的严峻形势 . 1 1.1.2 水体富营养化的危害及其治理的紧迫性 . 2 1.2 废水除磷的概述废水除磷的概述 . 2 1.2.1 化学除磷法 . 3 1.2.2 生物除磷法 . 3 1.2.3 生物化学联合除磷法 . 4 1.3 聚磷微生物（聚磷菌）的种类聚磷微生物（聚磷菌）的种类 . 4 1.4 微生物聚磷机理微生物聚磷机理 . 6 1.4.1 paos 机理（厌氧/好氧聚磷机理） . 7 1.4.1.1 厌氧条件下的生化机理 . 7 1.4.1.2 好氧条件下的生化机理 . 10 1.4.2 dpb 机理（反硝化聚磷机理） . 12 1.4.3 除磷机理研究中存在的问题 . 13 1.5 微生物聚磷的影响因素微生物聚磷的影响因素 . 14 1.5.1 cod 对生物除磷的影响 . 14 1.5.2 溶解氧(dissolved oxygen, do)和硝酸盐对生物除磷的影响 . 15 1.5.2.1 do 对生物除磷的影响 . 15 1.5.2.2 硝酸盐对生物除磷的影响 . 16 1.5.3 温度对生物除磷的影响 . 16 1.5.4 ph 值对生物除磷的影响 . 17 1.5.5 其它因素对生物除磷的影响 . 17 1.6 本本课题研究的目的意义及主要内容课题研究的目的意义及主要内容 . 18 1.6.1 课题研究的目的意义 . 18 高效聚磷菌的分离及其特性研究 ii 1.6.2 课题研究的内容 . 18 1.6.2.1 聚磷菌的分离筛选及鉴定 . 18 1.6.2.2 单因素影响实验 . 19 1.6.2.3 响应曲面优化设计实验 . 19 1.6.2.4 对聚磷菌聚磷机理的初步研究 . 19 1.6.2.5 聚磷菌在实际水体中的应用 . 19 1.7 实验方案流程图实验方案流程图 . 20 第二章第二章 实验材料、仪器及方法实验材料、仪器及方法 . 21 2.1 实验材料实验材料 . 21 2.1.1 主要试剂 . 21 2.1.2 菌种来源 . 22 2.1.3 培养基 . 23 2.2 实验仪器实验仪器 . 23 2.3 实验方法实验方法 . 24 2.3.1 标准曲线的绘制 . 24 2.3.2 r%(除磷率)计算方法 . 25 2.3.3 厌氧条件的控制方法 . 25 2.3.4 生物量测定方法 . 26 2.3.5 菌体内磷含量的测定方法 . 26 2.3.6 分析及数据处理软件 . 26 第三章第三章 高效聚磷菌的分离筛选及其鉴定高效聚磷菌的分离筛选及其鉴定 . 27 3.1 引言引言 . 27 3.2 材料与方法材料与方法 . 27 3.2.1 实验材料 . 27 3.2.2 方法 . 28 3.2.2.1 菌种的分离纯化 . 28 3.2.2.2 聚磷菌的初筛 . 28 3.2.2.3 聚磷菌的驯化和复筛 . 29 3.2.4 菌种鉴定 . 29 目 录 iii 3.2.4.1 dna 提取与检测 . 29 3.2.4.2 pcr 扩增 16s rdna . 30 3.3 结果与讨论结果与讨论 . 31 3.3.1 筛选结果 . 31 3.3.2 dna 提取与 pcr 检测结果 . 32 3.3.3.1 p6 菌株的 16s rdna 序列分析结果及同源性比较 . 33 3.3.3.2 p8 菌株的 16s rdna 序列分析结果及同源性比较 . 35 3.4 本章小结本章小结 . 36 第四章第四章 微生物除磷影响因素的研究微生物除磷影响因素的研究 . 38 4.1 引言引言 . 38 4.2 材料与方法材料与方法 . 38 4.2.1 材料 . 38 4.2.2 方法 . 38 4.2.2.1 分析方法 . 38 4.2.2.2 计算方法 . 39 4.2.2.3 实验方法 . 39 4.3 结果与讨论结果与讨论 . 41 4.3.1 厌氧与好氧时间对菌株除磷的影响 . 41 4.3.2 温度对菌株除磷的影响 . 43 4.3.3 ph 值对菌株除磷的影响 . 43 4.3.4 碳源种类及其浓度对菌株除磷的影响 . 44 4.3.4.1 碳源种类对菌株除磷的影响 . 44 4.3.4.2 碳源浓度对菌株除磷的影响 . 46 4.3.5 氮源对菌株除磷的影响 . 46 4.3.6 磷浓度对菌株除磷的影响 . 47 4.4 本章小结本章小结 . 48 第五章第五章 响应曲面优化实验响应曲面优化实验 . 50 5.1 引言引言 . 50 5.2 材料与方法材料与方法 . 50 高效聚磷菌的分离及其特性研究 iv 5.2.1 实验材料 . 50 5.2.2 方法 . 51 5.2.2.1 测定方法 . 51 5.2.2.2 实验方法 . 51 5.3 结果与结果与讨论讨论 . 53 5.3.1 显著因子筛选结果 . 53 5.3.1.1 pbd 实验设计结果 . 53 5.3.1.2 显著性分析结果 . 55 5.3.2 爬坡实验结果 . 56 5.3.3 box-behnken design(bbd)实验设计及实验结果 . 57 5.3.4 响应曲面分析（rsa）和二次多项式数学模型建立 . 58 5.3.5 模型验证实验结果 . 60 5.4 本章小结本章小结 . 61 第六章第六章 聚磷聚磷菌聚磷机理的初步研究菌聚磷机理的初步研究 . 62 6.1 引言引言 . 62 6.2 材料与方法材料与方法 . 62 6.2.1 材料 . 62 6.2.2 方法 . 62 6.2.2.1 测定方法 . 62 6.2.2.2 实验方法 . 63 6.3 结果与讨论结果与讨论 . 63 6.3.1 菌株 p6 和 p8 的释磷与聚磷分析 . 63 6.3.2 生物量与除磷率的关系 . 65 6.4 本章小结本章小结 . 66 第七章第七章 聚磷菌在自然水体中的应用聚磷菌在自然水体中的应用 . 67 7.1 引言引言 . 67 7.2 材料与方法材料与方法 . 67 7.2.1 材料 . 67 7.2.2 方法 . 67 目 录 v 7.2.2.1 水样采集及处理 . 67 7.2.2.2 巢湖水样的除磷实验 . 68 7.3 结果与讨论结果与讨论 . 68 7.4 本章小结本章小结 . 69 第八章第八章 结论与展望结论与展望 . 70 8.1 主要结论主要结论 . 70 8.2 微生物除磷的发展趋势微生物除磷的发展趋势 . 71 参考文献参考文献 . 73 攻读硕士学位期间发表学位论文攻读硕士学位期间发表学位论文 . 81 致致 谢谢 . 82 高效聚磷菌的分离及其特性研究 vi 摘摘 要要 水体中磷的去除对防止水体的富营养化具有重要意义。 目前对于废水中磷的 去除主要是利用活性污泥中的聚磷菌在厌氧/好氧(a/o)或厌氧/缺氧(a/a)交替运 行下对废水中磷的过量摄取，再通过污泥排放这种方式来除磷的。但由于对聚磷 菌本身的聚磷特性和聚磷机理的研究还不够深入， 导致生物除磷技术尚未得到广 泛应用，也使得增强生物除磷(enhanced biological phosphorus removal, ebpr) 运行效果不够稳定。本文从高效聚磷菌的分离筛选入手，在聚磷菌的聚磷特性及 其机理等方面展开了较深入的研究。 从巢湖底泥中分离得到两株高效聚磷菌株 p6 和 p8，经过 16s rdna 序列分 析，初步鉴定 p6 菌株属于短小杆菌属(exiguobacterium sp.)，p8 菌株属于假单胞 菌属(pseudomonas sp.)。 为考察影响两菌株聚磷性能的因素，对温度、ph 值、碳氮源等因素进行了 分析，并确定了各因素的最适作用范围。p6 菌株的最适温度为 35，最适 ph 值在 45 之间。最适碳源是麦芽糖，且浓度在 0.75 g/l 时，聚磷效果最好，除磷 率达到 84.6%。最适复合氮源是蛋白胨氯化铵。p8 菌株的最适温度是 35， 最适 ph 值在 67 之间。最适碳源是乙醇，且浓度在 3.75g/l 时，除磷效果最佳， 除磷率达到 92.9%。最适复合氮源为蛋白胨硫酸铵。比较两菌株发现，环境因 素的改变对p8菌株的除磷能力影响不大， 温度在1040范围内， ph值在411 之间，p8 菌株都表现出较高的除磷能力，同时实验结果还显示，p8 菌株可以利 用多种碳源和氮源。 改变环境中磷浓度，考察外源磷对聚磷菌除磷的影响发现，随着外源磷浓度 的增加，聚磷菌的除磷率也在不断上升。磷作为外源诱导物有刺激聚磷菌聚磷的 作用，能提高除磷效率。 为更好地研究各因素对聚磷菌聚磷能力的交互影响，优化除磷条件，本实验 采用响应曲面法(response surface methodology，rsm)来分析各种因素对聚磷菌 聚磷能力的影响。显著性实验及显著因子水平值的优化实验表明，菌株 p6 的三 个显著因素的最优值分别是：蛋白胨 1.06 g/l、nh4cl 0.82 g/l、feso4 7h2o 0.53 g/l；菌株 p8 的三个显著因素的最优值分别是：蛋白胨 0.9 g/l、(nh4)2so4 摘 要 vii 0.7 g/l、mgso4 7h2o 0.8 g/l。在上述优化条件下，p6 和 p8 菌株的除磷率分别 达到了 98.25%和 95.84%。利用响应曲面分析(response surface analysis，rsa) 技术，建立了两菌株除磷的二次多项式数学模型，对聚磷菌进行预测。经实验验 证，实验值与模型预测值之间的相对误差低于 1%。 ， 为揭示生物聚磷的机理， 本实验分析了菌株p6和p8在厌氧和好氧阶段胞内、 胞外磷含量的变化及生物量的变化。结果表明，两菌株均能在厌氧环境中向胞外 释放磷，环境中的磷含量有明显增加。同时菌体在厌氧条件下生长受到抑制，生 物量保持在较低的水平，甚至下降。而在好氧阶段，菌体内的磷含量迅速上升， 伴随着的是环境中磷含量在大幅减少，表明磷被过量地摄入到菌体内，同时在此 阶段生物量也快速增加。 上述结果表明， 所筛选的菌株 p6 和 p8 具有聚磷菌的特 征，即厌氧释磷、好氧聚磷。 磷是导致水体富营养化的关键因素， 其在水体中引起藻类爆发性生长的浓度 是极低的，远低于国家规定的磷排放标准。因此，控制水体富营养化，防止藻类 爆发应从两方面入手，一是从源头控制污水中的磷含量，减少排入自然水体中的 磷；二是对可控的水体(如人工湖，景观水池等)进行有效的除磷，控制藻类的生 长。但过低的磷含量对聚磷菌的生长也会造成影响，不利于除磷。为此，本文考 察了自行筛选的两株聚磷菌在极低磷浓度下的聚磷能力， 发现当环境中磷的浓度 低至 0.05 mg/l，两株聚磷菌依然保持有 70%以上的聚磷率，从而为这两株聚磷 菌在生物除磷工艺中的实际应用提供了前提。 关键词：关键词：生物除磷；聚磷菌(paos)；除磷率；响应曲面法；厌氧/好氧 高效聚磷菌的分离及其特性研究 viii abstract eutrophication phenomenon has become one of the most serious global water quality problems. as we all know, large quantities of nutrient substances, such as phosphorus and nitrogen present in wastewater are the main cause of eutrophication phenomenon. among all the nutrient elements, phosphorus is considered as the key element leading to water eutrophication. so phosphorus removal is the important strategy in controlling eutrophication. in recent years, biological phosphorus removal was investigated extensively, and more and more studies had been carried out using the polyphosphate accumulating organism (paos) to remove phosphorus from water. however, little has been known about mechanism. it led to the ebpr(enhanced biological phosphorus removal) to be unstable. in this study, both of paos p6 and p8 were isolated and screened from the sludge of chaohu lake. they were identified by 16s rdna sequence analysis. the result of sequence analysis and homology comparison suggested that the strain p6 was similar to exiguobacterium sp. in genbank and the strain p8 was similar to pseudomonas sp. in genbank. many factors which could affect the efficiency of phosphorus removal of strain p6 and p8 were studied respectively in this paper, including carbon source, nitrogen source, temperature, ph value, time of anaerobic phase and aerobic phase and so on. the result showed that the optimum conditions of accumulating phosphorus by the strain p6 was as follows: temperature 35, ph45, maltose as carbon source, peptone and nh4cl as complex nitrogen source. the optimum conditions of accumulating phosphorus by the strain p8 was as follows: temperature 35, ph67, ethanol as carbon source, peptone and (nh4)2so4 as complex nitrogen source. however the strain p8 could keep high efficiency of phosphorus removal in the wide range of temperature and ph value, and the strain p8 could take more carbohydrates as carbon sources and take more organic matters or inorganic ammonium as nitrogen sources than the strain p6. abstract ix however, little is known about which factors had significant influences on the efficiency of phosphorus removal among all these factors. plackett-burman design was a good and rapid method to screen the significant factors which have enormous influences on the studied response value. in this study, the plackett-burman design was carried out with the using of software minitab15. the three significant factors of strain p6 were screened as follows: peptone, nh4cl and feso47h2o. the three significant factors of strain p8 were screened as follows: peptone, (nh4)2so4 and mgso4 7h2o. according to the response surface analysis(rsa), the next step was to determine the optimum levels of these significant factors. for this purpose, the box-behnken design was adopted to optimize the value of above three significant factors. based on the box-behnken de