（生物医学工程专业论文）纳米粒子与光子晶体复合编码载体的制备及应用.pdf

东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：查亟 日 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生 院办理。 研究生签名：导师签名： 摘要 纳米粒子与光子晶体复合编码载体的制备及 应用 中文摘要 随着生物检测技术、高通量筛选技术和多元分析技术的发展，流动载体编码技术由 于其灵敏度高，编码量大，反应快速等特点受到广泛关注。其中基于光谱技术的光学编 码由于其编码、检测技术成熟，检测方便直观而得以普遍应用。传统的荧光染料所产生 的编码稳定性不高，光子晶体编码又存在着编码量少等问题，都对其应用造成了一定的 限制。因此，本论文制备了量子点等纳米粒子与光子晶体编码相结合的复合编码载体， 能够很好的解决以上问题，并研究了该复合编码载体在生物检测中的应用。具体研究内 容如下： ( 1 ) 通过层层自组装的方法将不同大小的量子点分别组装到不同的光子晶体微球 的表面，使得量子点编码与光子晶体编码这两种光谱编码的结合起来。首先通过优化制 备水相量子点的条件，制备出以巯基丙酸为稳定剂的不同颜色的水相c d t e 量子点；通过 微流控装置制备出由二氧化硅粒子自组装成的大小可控、尺寸均一的光子晶体微球。然 后基于层层自组装技术，将不同颜色的量子点包被在不同编码的二氧化硅光子晶体微球 表面，得到了量子点和光子晶体复合编码载体。研究了不同的吸附过程对光子晶体的结 构及其复合微球的荧光光谱和反射光谱的影响。d 1 姒杂交实验说明该复合编码微球作为 生物分子的固相载体具有制备简单、编码稳定和解码方便等优点。 ( 2 ) 利用二氧化硅光子晶体微球特殊的结构和量子点的特有性质，将光子晶体对 检测信号的增强作用与量子点编码结合起来，制备了新型多功能的编码载体以用于生物 编码检测。根据量子点的特有性质，可以得到同时利用量子点的强度和光谱来编码的微 球，编码量大大增加。同时，由于光子晶体微球具有很大的比表面积，因此在d n a 的检 测中可以使得检测信号得到放大增强。实验对比了同样大小的光子晶体微球和玻璃微 球，通过对不同浓度的d n a 的检测结果的分析，以光子晶体微球作为固相载体的荧光免 疫检测的灵敏度达到6 7p m o l l ，远远高于玻璃微球荧光免疫检测的灵敏度( 8 9 0 p m o l 几) 。因此，该多功能编码微球作为生物分子的固相载体具有编码量大和较高的灵 i 东南人学博：i 二学位论文 敏度等优势，有望在实际的高通量多组分检测中得到应用。 ( 3 ) 基于量子点和金纳米粒子之间荧光能量转移( f 玎) 现象，构建了以二氧化 硅光子晶体微球为载体的d n a 多元检测技术。在这个体系的研究中，将量子点固定在光 子晶体编码微球表面作为荧光能量给体，d n a 杂交反应后，a u - d n a 靠近量子点使得量 子点的荧光淬灭，而目标d n a 的加入可以使得部分的荧光淬灭得到恢复，实现了d n a 的多元定量检测。同有机染料( c y 5 ) 与量子点的荧光能量转移体系相比，金纳米粒子 与量子点之间的荧光能量转移效率更高，达到8 4 3 。因此采用了该体系来进行d n a 的 定量分析。在多组分d n a 的检测中，能够用这种方法高效、灵敏的检测出待测组分。 ( 4 ) 利用复合编码微球作为抗体固定的载体，用于多组分免疫分析。用癌胚抗原 ( c 队) 和甲胎蛋白( a f p ) 作为模型分析物，a f p 和c e a 都可以在1 o 1 0 0n 霉f m l 范围 内被快速检测，检测限分别为0 7 2 和o 8 9n 卧n l ( 信噪比为3 ) 用提出的方法分析了临 床血清样品，结果与临床上参考方法相比，具有良好的一致性。该体系显示出高的准确 性和重现性，具有操作简单、高通量检测等优点，在临床检测上具有潜在应用价值。 关键词：纳米粒子；量子点；光子晶体；编码载体；荧光能量转移；自组装；免疫分析； 肿瘤标志物 l l 摘要 f a b r i c a t i o na n d a p p l i c a t i o no fm u l t i p l e x e n c o d e dca r r i e r sb a s e do nn a n o p a r t i c l e sa n d p h o t o n i cc r y s t a l s a b s t r a c t w i lm ed e v c l o p m to fm em u l t i p l e xa n dh i g l l - m r o u g h p u t 嬲s a y s ，s i l s p e n s i o n 锄y sa r e a t 慨姚gi n 蝴i i l ga ：t t e l l ：t i o nb c c a l 塔eo ft h e i rl l i g hs 既l s i t i v 毋，1 a r g ee n i 。o d i n gc a p a c i 晚a i l d f 弧tr e a c t i o ns p e e df 0 r 诎c c 垃o n a m o n gan u n l b e ro fd i 任e r e ms l l s p e n s i o n 跚r a ) ，s ，m e s p e c 饥珊c o d e ds l l s p e 璐i o n 觚阻y sa r ew e l ll l s e dd u et 0 旺l e i rs i m p l i c i 够i nb o t l le i l c 0 d i l l g 锄dd 西e c t i o n b u t 也em o s tc o m l n o l l l y 璐c d 即朕 d i n gd e m e n ti i l o p t i c a ie n c 0 拙gi s n r e s c e l l c e w 雠c ：hc o m e s 董两mt h ec ：h e l i l i c a ls t m c t l 】托o ff l u o r e s c 朗td y 骼锄di sn o ts t a b l e a d d i t i o l l a l l y ，t l l e 髓c 0 d i n gc 印a c i t yo fc o l l o i d a l 眵i ，s t a lb e a d s l i l i l i t st 量l e i r a p p l i c a t i o n s h e r e i nan e wm u l t i p l e xe i l c o d e dc 删e r sf o rb i o a s s a y sb a s e do nn a n o p a i t i d e ( i e q u a n t 嘲 d o t s ，q d s ) a n dp h o t o i l i cc 驴：t a l si s 舯) p o s e d ，o f 毗l i c hm ef a b r i c a t i o na n da p p l i c a t i o na r e s t u d i e da sb e l o w ( 1 ) d i tc o l o u rc d t eq d sw e r es y i l m e s i z e di i la q u e o u sb yu s i n gm e r c a p t o p r o p i o i l i c a d d 舔q l es 切b i n z 睨t h em o n o d i s p e r s ea n ds i z e _ c o i i 昀l l e ds i l i c ac o l l o i d a l c 叮s t a l s b e a d s ( s c c b s ) w e r ef a b r i c a t e db yam i 啪n u i d i cd 嘶c e h i g l l l yn u o r e s c 饥tq d - c 0 a t e d 锄c o d e ds c c b s 向rm u l t i p l e xc o d i n gh a _ v eb 嘲p 唧a r e dw i t h l el a y e r - b y _ l a y e r ( l b l ) a s s e l 】曲l ya p p r o a c h t h ee 毹c to fd i 侬t e n tq d sd e p o s i t i o np r o c e s st on l c 谢g i i l a l 咖c t l 毗e a n dr e s u l t i n gs p e c 眈o fs c c b sw e f ea l s od i s c u s s e d 1 kd n ah y b r i d i z a t i o ne x p 鲥m e n t s i n d i c a 土e 缸l a t 仳sm u l t i p l e xc o d i i 唱b e a d sa s 髓c o d e dc a r r i e r sh l v et l l em a i l ya d v 觚t a g s u c h 2 ss i l n p l ep r 印a r a t i o np r 0 c e s s ，g o o ds 讪i l i t y 锄de a s yd e c o d i n g ( 2 ) m o n o d i s p e r s es c c b sw e r eu s e d 嬲t h es u p p o r t t o d 印o s i t d i a 请e n t - s i z e da n d d i 贰r e n t l a y e rq d sb yt h el b la s s e n 曲l ya p p r o a c h n l cp r o p e r t i e so fq d s a r ew d ls u i t e d 矗m w a v e l e n g m - a i l d i n t e i l s i t yi n u l t i p l e xc o d e ，w h i c hc o u l dp o t e l l t i a l l y ) ，i e l dal a 昭en 瑚曲e ro f c o d e s d u et 0m el l i g hp o r o s i 够鲫【dl a r g eg u r f a c ea r e ao fs c c b s ，am u c hs t l 0 n g e r f l u o r e s c e n c es i 盟a lo fd e t e 嘶o nc 肌0 b s e r v e d 1 1 1 es a m es i z e dq d c o a t e ds c c b s a i l d 哲a s s b e a d sw e r ei i s e di nd n ah ) i b r i d i z a t i o n 如rc o m p 撕s 0 n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tm e d e t e 嘶o nl i i i l i tf o rq d - c o a t e ds c c b s ( 6 7p m o 儿) w a sm u ( ml o w e rm a l lm a t 南r 西a s sb e a d s i t l 东雨人学博i ：学位论义 ( 8 9 0p m o l i j t h e s ei i l i c r o c a r r i e rb a s e dm u l t i p l e x e da s s a y s 啪p r o v i d el a 唱en u i 】曲e r so f c o d c s 觚dl l i g l ld e t e c t i o ns e i l s i t i v i 够s ot l l ed e s i g n e dm i c r o c 孤1 f i e r sa r ep m m i s i n g 内rp r a c 石c a l a p p l i c a t i o n si i lm u l t i p l e xa n dh i 曲一t h r o u g h p u ta s s a y s ( 3 ) a nn o v e lm u l t i p l e x e d 嬲s a ys 缸a t e g ) ，向rd n aw 硒d e v e l o p e db ym e 嬲u r i n g l e f l u o f e s c c cr e s o n a i l c ee i l 唧仃锄s 缸( f r e t ) b e t 、) l r e 铋q d sa n dg o l dn a n o p 硎c l e s ( a u n p s ) 0 nt h es c c b s h l 锄ss y s t 锄，w h i l ed o n o rq d si n 埘o b i l i z e d0 nm es u 嘞c eo fs c c b sw 嬲 q u 饥c h e dd u et 0m ep r e s 朗c eo fau _ n p s ( e n 鹕ya c c 印t o r ) i nd o s ep r o x i m i t y l et a r g 烈d n a c 锄s e dm o d u l 撕0 ni nm ee f j f i c i e i l c yo f 1 ee i l e r g yt r a n s 向b e 帆e e i lm ea c c 印t o r 觚dd o n o r t l l i i sr e a l z i n gt h ed n a 硒s a y i nc o m p a r i s o nt 0t h eq d d y cs y s t e m ，t h ec 0 n j u g a t eo ft h e q d a u n pg a v er i s et 0h i 曲e f 明盯g y 眺f 打e 伍c i e i l c y ( 8 4 3 ) ，r e s u l t i l 培i l lq 唧l t i t a t i v c a s s a yo fd n a 谢t hm o r e 辩l l s i 缸访够am u l t i p l e x e dd n a 硒s a yw 弱跚c c 懿s 如l l ya c m e w ：d s i i l c em e 黼sc o u l db eu s c d 勰ac 0 m m o n e r 野a c c e p t o ri l lc 0 匈删o n 埘mq d s 龇g d i 蚴c 0 l o 瑙s o 吐1 ep r o l ，o s e dm e 吐l o d ，杜c hh 够l l i 曲t l d u 曲挪n 细s c r e e n i n go f b i o l n o l e c u l 鹤，i sp r o m i s i i l gi nm 啪p l e xb i o 邪s a yf o rd n a i i lp i a 硝c a ls 锄p l 销 ( 4 ) t h el i m l 卸l e xc o d i r 培b e a d s 弱e n c o d e dc a 仃i e r sc a nb eu s e df 0 rm u l t i p l e xi m m u n 0 嬲s a 弘 u s 吨c a r c i n 0 朋蛳l l i c 锄t i g 吼( c e a ) 锄dq f e t 0 1 ) r o t e i i l ( a f p ) 嬲m o d e l 觚a l y t e s ，m e h i g h l ye f f i c i e n ti i l 】删a s s a ys h o w sal i l l e a rr a i l g eo f1 ot 01 0 0n 劝 i l l a f p 锄dc e ac 0 u l d b er a p i d l y 嬲s a y e d 谢md e t e c t i o nl i m i t so fo 7 2 a i l do 8 9n g m l ，r e s p e c t i v e l y1 1 h e 弱s a y r 懿u l t so fc l i n i c a ls 饥珊s 锄p l 懿、柝t l lt l l ep i 0 p o s 。dm e ( h o dw e r ei na na c c 印t d b l e 雄弦e i i l e n t 丽mm er e f e r 鼬c ev a l u e s t l l i sn 0 v d i l i 】1 1 i l u n o s e i l s i i l gs y s t e mb 嬲e do nn m l t i p l e xc o d i i l gb e a d s p r o v i d e da na u t o m a t e d ，r c u s a b l c ，s i i n p l e ，s e n s i t i v ea n dl o w - c o s ta p p r o a c h 如rm u l t i a l l a l y t e i n l 删m i d a s s a yw i 也0 u tu s i n go fe x p e l l s i v ea m y d e t e c t o r 蛋哂w o r d s ：n 觚o p a i t i c l e s ；q u a 触珊d o t s ；p h o t o i l i cc r y s t a l ；e n c o d e dc a r r i 粥；f l u o r e s c e n c e r e s o n 觚c ee i l e r 影h 肌s f 配s e l f a s s e i l l b l y ；m h n u i l o a s s a y ；1 、l l l l o rm a r k e r s i v 目录 目录 中文摘要。i a t s t r i c t i i i 第章绪论。l 1 1 生物分子编码载体1 1 1 1 化学编码2 1 1 2 电子编码2 1 1 3 图形编码3 1 1 4 光学编码5 1 2 光子晶体8 1 2 1 光子晶体的制备9 1 2 2 光子晶体在生物分析中的应用9 1 3 纳米粒子在生物编码检测中的应用1 l 1 3 1 量子点1 l 1 3 2 金纳米粒子：1 9 1 4 本论文的主要研究工作2 l 参考文献2 3 第二章量子点与光子晶体复合编码微球的制备及应用研究。3 2 2 1 弓i 言：i ：1 2 2 实验部分3 3 2 2 1 试剂与仪器3 3 2 2 2 二氧化硅纳米微球的制备：3 3 2 2 3 单分散光子晶体微球的制备3 4 2 3 水相量子点的制备3 5 2 3 1 实验部分3 5 2 3 2 电解反应过程3 6 2 3 3 量子点的形貌及结构特点3 6 2 3 4c d t e 量子点的光致发光性质3 7 2 4 量子点与光子晶体复合编码微球的制备3 8 2 4 1 实验部分3 8 2 4 2 结果与讨论4 1 2 5 本章小结4 7 参考文献4 9 第三章多功能编码微球的制备及在生物检测中的应用研究5 1 3 1 引言5l 3 2 实验部分5 2 3 2 1 试剂及仪器5 2 3 2 2 光子晶体微球内部缝隙的填充5 3 3 2 3 多功能编码微球的制备5 3 3 3 结果和讨论。5 4 3 3 1 量子点编码的准确性5 4 3 3 2 量子点编码5 5 3 3 3 光子晶体微球的增强效应5 6 3 3 4 填充后光子晶体微球的增强效应5 9 3 3 5 多功能编码微球的检测灵敏度6 0 3 3 6 多功能编码微球的多元d n a 杂交反应6 l 3 4 本章小结6 2 参考文献6 3 第四章基于荧光能量转移的多重编码检测研究韶 4 1 ；i 言6 5 4 2 实验部分6 7 i 东南人学博上学位论文 4 2 1 试剂与仪器6 7 4 2 2 纳米金标记d i n a 6 8 4 2 3 非标记d n a 的金纳米粒子的制备6 8 4 2 4 基于荧光能量转移的多元d n a 检测6 8 4 3 结果与讨论6 9 4 3 1 量子点浓度对荧光能量转移效率的影响6 9 4 3 2a u d n a 浓度对荧光淬灭效率的影响7 l 4 3 3 金纳米粒子、有机染料和自由金对荧光能量转移效率的影响一7 2 4 3 4 目标d n a 的定量检测7 5 4 3 5 多重编码检测7 6 4 4 本章小结7 8 参考文献7 9 第五章基于复合编码微球的肿瘤标志物检测8 l 5 1 引言8l 5 2 实验部分8 2 5 2 1 试剂及仪器8 2 5 2 2 免疫检测过程8 3 5 2 3 样本收集和安全事项8 3 5 3 结果与讨论8 3 5 3 1 免疫检测条件的优化8 3 5 3 2 绘制岍和c e a 标准浓度曲线8 4 5 3 3 临床检测对比及系统的重现性、稳定性8 5 5 4 ，j 、结8 6 参考文献。8 7 第六章总结与展望8 9 博士期间发表的论文及申请专利9 l h 第一章绪论 1 1 生物分子编码载体 第一章绪论 在生物学研究和临床诊断中，经常需要了解研究标本或临床标本中含有多少种生物 分子及其含量的信息。随着人类基因组( 测序) 计划( h u m 锄g e n o m ep r o j e c t ) 的逐 步实施以及分子生物学等相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因 组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。同时在临床免疫 学检测中，往往都是要检测一份标本中多项指标，特别是新的病原微生物被不断发现， 与疾病相关的新的免疫学指标也在不断被发现，临床检测项目也必然会不断增加。为此， 建立新型杂交和测序方法从而实现对大量的遗传信息、临床样本进行高效、快速的检测、 分析就显得格外重要了。目前，一个有效的办法是将不同的探针分子固定在作了不同标 记的载体上，通过载体上的标记来跟踪和识别每一个结合反应【l 捌，从而达到高通量的生 物分子检测技术，我们称之为生物分子的编码载体。 生物芯片( b i o d l i p s ) ，。又称基因芯片、d n a 芯片，是目前最常见的固定编码载体。 它是利用微型电子与微机械系统( m i c r oe l e c 仃o i l i cm e c h a i l i c a ls y s t 锄，m e m s ) ，将不 同的探针分子分别固定在某个固相支持物上，并排列成有序的点阵，在固定过程中每一 种探针分子被固定在事先确定好的位置上，这样，每一种探针分子都对应一个确定的 x y 坐标。根据预先确定的位点与待测分子的对应关系，一次检测反应就可以检出待测 标本中成千上万的生物分子( 图1 1 a ) 。生物芯片技术引起了相关领域学者的极大兴趣而 被高度重视，被不断派生、发展和应用，对比较基因组学、蛋白质组学、药物筛选和临 床检测等学科的发展起到了积极的推动作用，被誉为2 l 世纪生命支撑平台。但是，生 物芯片也存在由其方法学原理所决定的固有不足，主要是：( 1 ) 反应效率不高，所有探针 分子都被固定在一个固相基片上，使得芯片与待测标本的杂交成为一种固液相模式的 杂交，固液相杂交反应中总是存在空间位阻作用，降低了探针分子与待测分子结合的效 率，使得芯片杂交往往需要较长时间( 过夜) ；( 2 ) 重复性不佳，生物芯片的不同片基对 待测样品的吸附能力不同，片基不同位点吸附待测样品的效率不同，探针分子对不同标 本的标记效率也存在差异，这使得生物芯片难以取得较好的重复性，有报道指出生物芯 片的重复性一般在小于8 5 ；( 3 ) 不能用于定量分析，由于抗体抗原结合的差异、标记差 异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同待测生物分子的含量是不 恰当的。 另外一种是生物分子编码载体是流动载体编码f 3 5 1 ( 图1 一l b ) ，这种载体的位置可以随 意改变，也就是说当编码载体可以在溶液中任意运动( 如被搅拌时) 其编码不变。流动 编码载体在检测时由于探针分子和被检测分子可以在溶液中被充分混合，因而极大地减 少了目标分子到达相应探针分子的扩散时间，提高目标分子和探针分子的反应速度。但 l 东南大学博士学位论文 是在使用流动编码载体时，由于流动载体的空间不确定性，空间坐标不能被用来对探针 分子进行编码，因此需要一个新的对探针分子进行识别的编码方法。根据编码原理的不 同，可分为化学编码、电子编码、图形编码、光学编码等。 ab 图1 1 ( a ) 固定编码载体( 生物芯片) ；( b ) 流动式编码载体 1 1 1 化学编码 化学编码主要是指用组合化学编码方法。1 9 9 2 年b r a m e r 等人【6 】首先提出了一种使 用交替平行合成法来合成组合库的方法，被称为编码组合化学。该方法的原理是通过寡 核苷酸序列来编码合成的，即每当固相载体上有新的单体连接时，需同时连接一个用以 编码该单体的寡核苷酸分子，作为这一事件的标记。随着化合物库的增大，寡核苷酸标 签分子长度也平行增长。最后从筛选结果中挑出带有阳性的编码载体，利用聚合酶链式 反应( p c r ) 扩增微球上的编码寡核苷酸，再对寡核苷酸测序，就可以判断微球上连接的 阳性化合物分子构成。化学编码包括寡核苷酸标签，多肽标签、卤代烃标签、二级胺标 签和二烃基胺标签等。除此之外，通过化学编码方法还衍生出了质谱，x 射线和红外拉 曼光谱等标签编码方法。这些方法各有其优点，但是每种方法都有其限定的应用范围， 而且应用中还会受到诸如反应条件等诸多因素的制约和影响。此外，这些方法都是高度 专业化和技术化的，不仅仅需要复杂的精密的仪器和熟练的操作人员，而且要求有相关 技术支持才能够有效的进行。 1 1 2 电子编码 电子编码是利用无线电频率( r a d i o 丘明c i l c y r f ) 存储器标记物对组合化合物库进行 编码的方法0 1 。如图1 2 a 所示，无线电频率存储器标记物由被封装在同一个玻璃空腔 中的天线和含有激光刻蚀识别码的微电子芯片组成。当无线电存储器标记物靠近与电脑 相连的无线电接收装置的时候，天线接收到无线电接收装置发出的电磁波信号，并且将 之转化为电能，激活芯片。在激活的同时，芯片以电磁脉冲的形式向无线电接收装置发 出自身的识别码。接收装置读出识别码，从而识别标记物。最初这种电子元件被封装到 玻璃胶囊中后，尺寸为8m m l n h n ln h n ，对于生物分子检测来说偏大，所以主要用于 组合化学。后p h a n n a s e q 公司发明了一种体积仅为2 5 0 2 5 0 1 0 0 哪的6 4 位只读存储装 2 第一章绪论 置标记物【l l 】，编码量达到了2 4 0 ，可用于单核苷酸多态性( s n p ) 和d n a 检测。 1 1 3 图形编码 g l 毯嚣c a 磷m b 图1 2 无线电频率只读存储装置标记物【0 1 图形编码可分为简单的一维条形码和复杂的二维阵列图形两种。条形码的形成方法 很多，有激光刻蚀法、光学平版印刷法、干燥刻蚀法、电镀法等。 蓐2纛3 78 ；ll；llil 图1 3 ( a ) 激光刻蚀二维条形码1 2 】；( b ) 电镀法在金属棒上得到的条形码图形【1 3 】；( c ) 稀 土元素条形码；( d ) 带有用光漂白荧光染料法获得的条形码的微球1 6 1 图1 - 3 a 中所示的是利用激光刻蚀法在陶瓷的基底上，制备二维的图形编码【1 2 1 。2 0 0 1 年由n i c e w 锄昏p e 矗a 等人【1 3 】提出了金属棒条形码编码法，其方法是先用交替电沉积的方 3 东南大学博士学位论文 法在多孔铝模板的细长微孔中沉积金和银两种不同的金属，然后用化学方法将多孔铝模 板去除，得到细长的金属棒。在波长为4 0 51 1 1 n 的光的照射下，银的条带很明亮而金的条 带则很暗( 图1 3 b ) ，因此在制备过程中可以通过控制沉积顺序得到具有不同序列的具有 类似条形码特征的金属棒。在进行检测时，每一种探针分子的信息通过金属棒中金属的 排列读出，而探针分子是否与目标分子反应则通过荧光读出。d 锄e s 等人【1 4 】利用半导体 微加工技术在微米级的铝棒上打出不同序列的孔洞并由此组成条形码。c o u r t e s yo f c o r n j n g 公司的d e j n e k a 等人【1 5 】在几十微米长的玻璃棒中按预先设定的顺序掺杂不同的稀 土元素，在紫外光照射下可以产生彩色的条形码，大大增加了编码的种类( 图1 3 c ) 。此 外，还有另外一种条形码编码方法也得到了广泛的关注。在作为编码载体的微球中掺入 荧光类染料，通过选择性光漂白的方法在微球中写入条形码图形【l 酬，得到的已编码的微 球如图1 3 d 所示。光漂白是指光诱导荧光分子失去它们的荧光特性导致颜色的褪去，而 通过激光扫描共聚焦显微镜可以在荧光微球内部的任何地方诱导形成条形码图形。这类 方法的缺点就是对于识别码的读取比较复杂而且费时，在读取条形码信息的时候对于微 球需要非常精确的定位以确保对编码图形识别的正确性。 3 dm o l e c l l l 甜s c i 锄c e s 公司的e v a n s 等人【1 7 】通过掩模光照的方法在聚合物晶片上刻 出由孔洞组成的二维图形，进一步提高了编码量。p r e 西b o n 等人【1 8 1 利用流动式平板印刷 技术实现了二维图形编码生物载体的量产化。他们在y 型微流控通道的一个进样口注入 探针分子标记的聚合物单体，在另一个进样口注入荧光标记的聚合物单体，使两者在反 应通道内形成层流。用紫外光通过图形掩模照射通道中的聚合物单体并引发光聚合，使 得最终得到的载体产物的一半带上探针分子，另一半带上编码图形( 图1 。4 ) ，在荧光照射 下，既能检测生物分子反应又能读出图形编码。而且由于编码和生物反应在载体上不同 的区域进行，两者互不影响，从而提高了解码的准确性。 ：u v 。 、。| b 锄蝴矧 鬈知蝻脯钠_ 嘲荫- - 譬，0 塞溆霜暑蕊品 e 瓴0 1 0 2 绷嘲啊曩曩 溯黝_ 囊湖 融目嬲豳 融_ 曩一 图1 - 4 聚合物二维图形编码载体【1 8 】 4 第一章绪论 1 1 4 光学编码 光学编码是各种编码中操作、检测最简单，应用最广的一种编码方式。光学编码通 常的做法是将染料分子共价固定或吸附在载体的表面，利用载体上不同染料分子的不同 的吸收或者发射光谱识别固定在载体上的各种化合物。染料分子可以是带有化学发光基 团的分子、荧光染料分子或量子点等。编码的数量由染料的颜色数量以及各自使用的比 例来决定。 1 1 4 1 荧光染料编码 荧光编码方法的原理将荧光染料或含有荧光染料的粒子用物理或化学方法结合到 微球载体表面，通过识别荧光信号就可以确定与载体结合的探针分子的种类。t r 叭等人 u 巩2 0 】把不同的荧光染料分层共价包被在二氧化硅微球的外面，荧光染料层之间再用二氧 化硅层来物理隔离，得到了稳定的编码载体。i ，u m i n e x 公司【2 l 】采用混合荧光染料的方法 来编码聚合物微球，用两种不同的荧光染料掺入到直径约5 6 凹1 的聚苯乙烯微球中( 图 1 5 ) ，编码数量由染料的颜色数量以及各自使用的比例来决定。由于荧光染料自身的缺 点，容易产生光漂白等，造成编码十分不稳定甚至造成错码，因此这种方法最多可以获 得1 0 0 种荧光编码的微球，而在实际的应用中仅有6 0 种。在实际制备过程中，荧光染 料的配比的可重复性，微球尺寸以及染料包被的可重复性，还有标记荧光对编码荧光的 影响等等都存在局限性。在检测这种编码微球的时候，需要流式细胞仪这样的仪器 ( 1 5 d ) ，用两束不同颜色的激光射向包含有荧光微球的溶液，红色的激光用于显示微 球的编码色，而绿色的激光用于记录流过的微球的数量。丑1 硼血a 公司瞄】贝i j 把带有编码 地址的核酸探针固定到微球的表面，地址序列中标记了两种荧光染料用于编码微球，探 针序列则用于杂交反应来检测核酸分子。 图1 5h 吼i n e x 公司基于荧光微球编码载体及其生物检测装型2 1 】 5 东南大学博七学位论文 1 1 4 2 量子点编码 量子点( q u a n t l 肋d o t s ，q d s ) ，又称半导体纳米晶体，是一种由i i v i 族或i i i v 族元素组成的纳米颗粒。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特 性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。同荧光染料相比，量子点的发射光谱范围窄， 散射少，光漂白作用很小( 比有机染料小l o o 倍) ，光化学性质十分稳定，可用一个激发 光源同时激发多个不同尺寸的量子点，使它们发出不同颜色的光进行多组分多元检测， 因此是作为荧光编码的理想材料。 o 绀。o 重7 t 一，t e 亳奄jr 绝黝魈蟛 孝# t t “一* 知 i - 尊 ，一 t， ：l：l - - - 2：l： 一一 一 3：3 薹 s：善：2 墨誓- 1 0：摹：3 i墓- w ”轴叼搬 图1 6 含有量子点的编码微球载体【2 3 】 聂书明小组【2 3 】通过溶胀的方法将量子点包埋到聚合物微球中，通过调整不同发射波 长的量子点之间的比例，就可以得到一系列的荧光光谱，并将其用于编码( 图1 6 ) ，开创 了量子点用于生物分子编码检测的先河。例如，有1 0 种强度、6 种颜色的不同量子点， 可以制备1 0 6 个特定编码的荧光微球，也就是说，理论上可以在同一样品中对1 0 0 万种 不同组分进行检测。人类基因组大约只有3 - 4 万个基因，因此可以利用量子点编码微球 作标记探针来实现对人类全基因组的检测，并进一步对基因疾病快速诊断。 1 1 4 3 光子晶体编码 由于光子晶体的光子禁带依赖于其内部的周期性结构，其反射峰的半峰宽比荧光量 子点纳米晶体还要小，因此利用光子晶体的反射峰作为流动载体的编码方式不但可以获 得巨大的编码量以实现高通量检测的要求，而且编码十分稳定。另外，这种载体还具有 相对较大的尺寸，不要求有高分辩率的光学系统解码，而且不需要激发荧光，因此大大 简化了解码过程。s a i l o r 等人【砒6 1 首先提出了利用光子晶体多孔硅薄片作为流动式生物 编码载体，并将其用于生物检测( 图1 7 ) 。与其他类型载体相比，其硅基材料无毒性并很 容易与微流控检测分析芯片等整合，所以这种编码载体出现之后受到了很大关注。但是 6 第一章绪论 这种编码载体为片状多孔硅，是一种一维光子晶体，它只在一个方向上具有光子带隙， 也就是说只能在一个方向上来检测其反射光谱，因此这种载体在实际分析应用过程中首 先需要对它进行正确的定位。 嘲b 釉一 图l 一7 基于多孔硅光子晶体编码载体的生物检测 2 4 】 随后，我们课题组的z l l a 0 等人【2 7 乏9 1 通过微流控技术制备了三维光子晶体编码微球， 利用微球的反射光谱作为编码，并成功实现了多元生物检测。这种编码解决了一维光子 晶体需要定位的问题，使得检测过程更加简便易行。所得的编码来自于微球本身的周期 性结构，因此十分稳定，缺点就是编码数量略少。 鞠o ? 棚 图1 8 基于三维光子晶体编码载体的生物检测【2 7 】 综上所述，生物分子的流动编码检测方法是生物学研究和临床诊断的一种重要技术 手段，但现有的编码检测技术都还存在这样或者那样的不足，因此，需要结合以上方法 的优点，开发一种功能更加完备的复合编码技术，来弥补现有技术的不足，近一步促进 7 lii霹 东南大学博士学位论文 生物学研究的发展和临床检测的进步。 1 2 光子晶体 光子晶体( p h o t o m cc r y s t a l ) 的概念是e y a b l o n o v i t c h 和s j