（植物学专业论文）金属离子与天花粉蛋白的相互作用研究.pdf

塑! ! 查些查堂壁主堂壁! 兰些! 堡苎 摘要 在生物分子结构的研究中，很重要的方面是了解金属蛋白和金属酶。金属蛋 白和金属酶中仅含少域的金属离子，但它们起至关重要的作用。金属离子及其配 位环境往往就是生物分子的活性中心，因而对金属离子及其微环境的研究具有 重要意义。金属蛋白和金属酶中金属离子的基态及最低激发态往往与它们所处 的环境有直接的联系。 天花粉蛋白是从葫芦科植物栝楼块根中分离得到的一种单链核糖体失活蛋 f l l ，足中药犬花粉的有效成分，具有重要的理论研究和实际应用价值。近几年 旧f 究表明，天花粉蛋白对癌症、a i d s 等疾病有一定疗效。天花粉蛋白也是 一种金属蛋白。c a ”处于其活性中心部位。 本试验通过荧光光谱法、紫外光谱法研究了z n ”、c u ”、c o ”、c a “、f e 3 + 等儿种生物体中重要的金属离子与天花粉蛋白的相互作用，初步研究了金属离 子对天花粉蛋白结构的影响。 n ：试验过程中通过荧光光谱法确定了以2 8 5 n m 作为研究天花粉蛋白内源 荧光的激发波长，p h = 6 8 的混酸缓冲液作为反应体系的缓冲液。 试验结果表明： 在近似生理条件下( p h = 6 8 ，生理盐水缓冲液) ，金属离子浓度在0 o 5 m m o l 几范围内，z n ”、c u ”、c o “、c a ”、f e “等5 种金属离子均没有使天 花粉蛋白最大发射峰产生明显位移。其中c o ”、c a ”对天花粉蛋白的内源荧光 强度无明显影响，z n 2 + 可能有一定影响但很微弱。c u ”、f e ”对天花粉蛋白的内 源荧光强度有明显的猝灭作用，其中f e ”的影响作用大于c u ”，但二者的猝灭 过程并不相同。 在不同的酸度条件下，f e ”均可使天花粉蛋白的荧光强度发生猝灭。加入 f e ”前后2 9 5 n m 发射光谱发射光谱有所不同。 试验也研究了天花粉蛋白与e d t a 的相互作用，发现当e d t a 浓度达到 4 0 m m o l l ( 是反应体系中蛋白浓度的2 万倍) 时，e d t a 对天花粉蛋白内源荧 光强度的影响依然很微弱。 综合上述结果，五种离子的加入都没有使天花粉蛋白的3 3 2 n m 的荧光发射 峰产生明显位移。加入c i ”、f e ”后可使t c s 蛋白质的的内源荧光强度发生猝 塑! ! 查些盔兰堡主堂垡! 兰些! 堡苎 一一 灭，说明可能在一定程度上影响天花粉蛋白的结构，从而影响天花粉蛋白的功 能。虽然z n ”、c 0 2 + 是一：价金属离子，但这两种离子与天花粉蛋白作用时可能 并没有取代天花粉蛋白活性部位的c a ”，或部分取代但并没有改变天花粉蛋白 分子的空间结构，以致天花粉蛋白的荧光强度无明显变化。高浓度的c a ”也没 有影响天花粉蛋白的内源荧光。 关键词：金属离子；天花粉蛋白：荧光光谱法；紫外光谱法；荧光猝灭 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师搔导下进行的研究工作及取得的研 究成果。援我所知，除了文中特别加以标注和致谢的她方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得麴2 坠盛燃或其他教 育机构的学位或证书而使阁过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了葫确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：晰签字日期：o 了年月上f 疆 学位论文版权使用授权书 率学位论文作者完全了解翅丝墅5 f 未；琏有关傈留、使用学位论文的规定， 有权保留并向西家有关部门或机构送交论文的复印馋和磁盘，允许论文被盎阅鄹 借阅。本人授权趱丛鳘塾量；女i 釜可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印鼓扫描等复制手段保套、汇编学镘论文。 ( 傈密的学位论文在解密后适用本授权书) 撒馘储戤j 埘绎 签字日期：颦6 月吕 ， 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 名：却) 也 签字目期：。2 年f 月邓嚣 电话： s 编； 塑! ! 查些盔堂堡主堂垡! 望些! 堡塞 文献综述 1 天花粉蛋白的研究现状 天花粉蛋白( t r i c h o s a n t h i n ，t c s ) 是一种从葫芦科栝楼属植物栝楼 ( t r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i m ) 块根中分离得到的一种单链核糖体失活蛋白 ( r i b o s o m ei n a c t i v a t i n gp r o t e i n s r i p s ) 。作为一种传统中药，天花粉早在秦汉时 期的神农本草经中就有记载，直到今天还用于引产、生滓、消肿等，中药 天花粉的有效成分就是t c s 。临床上还发现它对宫外孕、死胎、恶性葡萄胎、 绒毛膜上皮癌等疾病也有一定疗效，但有时它会引起病人出现不同程度的过敏 反应i ”。近年来的研究发现，t c s 是一种核糖体失活蛋白，结构与蓖麻毒素a 链( r 1 a ) 、苦瓜籽毒素( m a p ) 、美洲商陆毒素( p a p ) 等有一定同源性。最 近，t c s 的基因已被克隆i 3 ，4 ，5 1 ，并在原核生物和真核生物中得到高效表达1 7 ， ”。它的一级结构和高级结构也得到了精确的解析b4 ，5 ，6 ，1 0 , 1 ”。它的活性部位 的结构及催化核糖体失活的过程也得以详细说明”，1 3 , “i 。 1 1 天花粉蛋白的结构 1 9 8 6 年我国科学家王猷等首先报道了天花粉蛋白的一级结构【l ”。1 9 9 0 年 c o l l i n s 对其结构做修正【3 l 。最近，p - c s h a w 等报道了1 9 3 h 天花粉蛋白晶体x 射线衍射结构图，天花粉蛋白分子量为2 7 1 4 3 d ，氨基酸数为2 4 8 ，蛋白结构中 包含1 1 个q 一螺旋，1 4 个b 一折叠i 1 6 i 。 天花粉蛋白三级结构： 引自：参考文献 1 6 天花粉蛋白的一级结构序列： i 5 1 01 5 m dvs frl sg a t s s s y g v fis 2 12 5 3 0 n l r k a l ，p n e r k l y d i p l l r s 4 5 5 05 5 s l pgsq rya l i h l t n y a d e t 6 l6 5 7 07 5 i s v a i d v t n v y i m g y r a g d t 8 l8 5 9 09 5 s y f f n e asa t e a akyv f x da t o l1 0 51 1 01 1 5 m r k vt lpy s g n ye r l q t a a g 1 2 11 2 51 3 01 3 5 k i r en 1 p l g lp a l ds ，a i t tl 1 4 11 4 5 15 0 1 5 5 f y y na n saas a l m v li q s t s 1 6 11 7 5 a a a ry k f1eo q tg krvd k tf 1 8 l1 8 51 9 01 9 5 l p sl a i i s la n sw s al s k q i 2 0 l 2 0 52 1 02 1 5 oias t nn g q ee s pv v ，l i na o 2 2 12 2 52 3 02 3 5 n q rv t i t nv da g v v ts n i a l 2 4 l2 4 5 l ln r nn ma 引自：参考文献 1 6 3 2 翌! ! 垒些查兰堡主兰笪! 兰些! 堡壅 t c s 的氨基酸序列中含有1 5 个最保守的残基，其中g i n l 5 6 、g l n l 6 0 、a r g l 6 3 、 g i u l 8 9 4 个极性氨基酸残基聚集在人小结构域交界处的凹槽中并位于分子表面， 它们之间依靠离子键，氢键，范德华力构成t c s 活性中心。其它几个保守残基 则起稳定活性中心、支持蛋白质肽链折叠的作用。 1 2 天花粉蛋白的功能及应用 1 2 1 功能 t c s 在功能上是一种r n an 一糖苷酶，它能使真核细胞核糖体6 0 s 大亚 基的2 8 sr r n a 上第4 3 2 4 位的腺嘌呤碱基脱落”，1 8 1 , 使核糖体不能与延伸因子 一2 结合，从而终止蛋白质合成。目前，t c s 的一些新功能正不断被发现。1 9 8 9 年，m c g r a t h 等报道t c s 在急性感染的t 淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞中能 强烈抑制艾滋病毒h i v - - 1 的复制，而对非感染细胞则无作用【，这一专一性 抗h i v 活性引起了人们的极大重视，一、二期! 临床试验也在进行中。l i 等人 2 0 l 发现t c s 表现出类似d n a s e 的活性，可在体外裂解超螺旋的双链d n a ，使之 断裂解旋为缺口环状和线状d n a 。有人比较了t c s 、r t a 、r n a s eh ( 来自e c o l i ) 和反转录病毒逆转录酶的一级结构，发现它们有一定程度的同源性，几个功能 保守的氨基酸残基都相同，有可能来自同一祖先蛋白，这说明t c s 可能可以直 接作用于核酸1 2 1 】。 1 2 2 应用 在应用方面，天花粉蛋白作为一种植物药用蛋白，人们已经进行了较多的 研究，特别是医学方面对t c s 的研究非常活跃。除用于抗h i v 一1 外，还发现 在培养的细胞系统中t c s 对乙型脑炎、乙型肝炎、麻疹、单纯疱疹病毒、水疱 性口腔炎等病毒均有明显抑制作用，并且这种抑制作用随t c s 浓度增大丽提 高，所以天花粉蛋白被认为是一种具有广谱抗病毒作用的蛋白。此外，t c s 还 表现出选择性的免疫调节功能，如抑制t 、b 细胞的活化、增殖及分化，但对 n k 细胞无作用”i 。x c h e n 等发现t c s 可通过补体替代途径激活血清补体系 统。t c s 还可刺激细胞免疫系统，诱导l g g 和l g e 产生1 2 4 l2 ”。为降低t c s 诱导的超敏反应以及延长其体内半衰期，有些研究者用葡聚糖等大分子来修饰 t c s ，取得了良好的效果陋2 7 ，2 ”。另外，t c s 抗肿瘤活性研究也取得了一些新 的进展”“】，用t c s 制成的抗人黑色素瘤的免疫毒素对体外培养的黑色素瘤 细胞有强烈的抑制作用i ”i 。 塑j ! 查些查兰堡主堂堡! 望些! 兰壅一 2 核糖体失活蛋白的研究 核糖体失活蛋白( r i b o s o m ei n a c t i v a t i n gp r o t e i n sr i p s ) 是一类广泛存 在于自然界的毒蛋白，天花粉蛋白就是一种r i p s 。r i p s 能作用于真核和原核细 胞的核糖体，破坏核糖体结构，抑制蛋白质在生物体内合成。凝集素研究学者 也认为它属于凝集素的一种嵌合体凝集素。目前，除少数几种真菌和细菌 中发现r i p s 外，几乎所有的r i p s 均来源于被子植物，裸子植物中还未发现其 存在的明确证据。体外研究表明r i p s 对兔网织红细胞、鼠网织红细胞、鼠脑、 鼠肝无细胞系统的蛋白翻译都有强烈的抑制作用，而且对小鼠表现出不同程度 的毒性【3 3 1 。 很早以前人们就知道蓖麻种子有很强的毒性，1 8 8 8 年，s t i l i m a r k 证明蓖 麻种子中的有毒成分是一种核糖体失活蛋白蓖麻毒素( r i c i n ) 。虽然蓖麻 毒蛋白分离较早，但直到1 9 7 0 年l i n 等发现r i p s 对肿瘤细胞的毒性大于正常 细胞o ”1 后，对r i p s 的研究才大范围开展起来。1 9 8 7 年e n d o 等阐明了r i p s 作 用于核糖体抑制蛋白质合成的作用机制，完成了具有里程碑意义的工作鲫。 1 9 8 9 年，m c g r a t h 等报道了t c s 在急性感染的t 淋巴细胞和慢性感染的巨噬细 胞中能强烈抑制a i d s 病毒h i v 一1 的复制，而对非感染细胞则无作用”1 ，这一 专一性抗h i v 活性引起了人们的极大兴趣。r i p s 的研究工作也由此引向深入， 大量新的r i p s 被发现1 3 7 , 3 9 , 3 9 , 4 0 1 ，许多r i p s 的一级结构和高级结构得到精确解 析。 2 1 核糖体失活蛋白的结构及作用机制 2 1 1 结构 已发现的r i p s ，一般根据其肽链数目不同分为两种类型，i 型r i p s 和i i 型r i p s 。 i 型r i p s 除玉米b 一3 2 外均为一条具有r n a n - 糖苷酶活性的单链。玉米b 一3 2 的成熟结构则由两条非肽键相连的多肽链组成，二者均是由一个前体蛋白水解 而来h ”。i 型r i p s 不含凝集素活性的肽链，这类蛋白的分子量多数都在3 0 0 0 0 d 左右，等电点p i 9 ，如商陆毒蛋白( p a p ) ，天花粉蛋白( t c s ) ，苦瓜毒蛋白( y c , p ) 等。也有少数例外，克木毒蛋白p i = 6 1 ，巴豆毒蛋白1 1 分子量仅为1 5 0 0 0 d ， p i = 6 7 。 i i 型r i p s 一股由a 、b 两条多肽链借助二硫键连接而成i 。它们的相对分 4 塑! ! 窒些查兰堡圭兰垡! 望些! 堡苎 子量都在6 0 0 0 0 d 左右，如蓖麻毒素，相思子毒素，槲寄生毒素等。其中a 链的 结构与i 型r i p s 相似，而b 链则具有半乳糖特异凝集素的功能。蓖麻毒素就是 一种i i 型核糖体失活蛋白，它的a 链( r t a ) 的空间结构对r i p s 具有广泛的适 用性。现已建立的天花粉蛋白与相思子毒蛋白a 链的空间结构都与蓖麻毒蛋白 a 链的空间结构十分相似4 ”。r t a 的空间结构呈“蘑菇云”状，由8 个a 一螺 旋，8 个b 一折叠和一些无规则卷曲等构象单位组成，共分三个结构域。其n 端1 1 7 个氨基酸残基( 约占整个链长的4 0 ) ，组成一个比较紧密的结构域( 叭) 。 结构域d 1 的主要特征是b 一折叠较多，由6 个b 一折叠和2 个a 一螺旋组成。 结构域d 2 也由近4 0 的残基组成( 1 1 8 - - 2 1 0 ) ，主要由。一螺旋组成，5 个n 一螺旋中，e 一螺旋最长，由2 0 个氮基酸残基组成( 1 6 1 1 8 0 ) ，结构域d 2 在 长度上超过5 个螺旋，位于整个分子的中心，并有一个弯曲，偏向c 端约3 0 0 ， 这一弯曲使g l u l 7 7 和a r g l 8 0 伸向分子表面形成活性中心。剩下的2 0 氮基酸 残基( 2 1 1 - - 2 6 7 ) 组成结构域d 3 主要由无规则卷曲组成，只有一个q 一螺旋 和一对不规则的反向平行9 一折叠，形成一个紧密的结构。结构域d 3 的另一个 特征是靠近c 一端富含疏水氨基酸2 4 7 - - 2 5 7 位的一个疏水氨基酸簇，可能对 r i c i m 链的跨膜运输起着重要作用。其一侧形成活性位点的一部分，另一侧通 过疏水作用与r t b 结合。 双链核糖体失活蛋白的a 链及单链r i p s 一般由2 1 0 - - 2 7 0 个氨基酸组成。 r i p s 间的氨基酸顺序相似性较低，通常只有1 5 - 3 0 左右，但在它们的活性区域 中间许多氨基酸同源性却相当高。通过x 一射线衍射分析所建立的结构模型表 明，i 型r i p s 以及i f 型r i p s 的a 链的三级结构很相似州j 。 r i p s 经常以不同的亚型( i s o f 0 h n ) 存在州。它们的氨基酸序列不同。这不是 由于翻译后加工造成的，而是由于它们的基因编码序列不同。它们是同一个基 因家族的不同成员。另外糖基化不均一也是产生不同亚型的原因之一。核糖体 失活蛋白大多是单链或双链的糖蛋白，含糖量一般在1 7 左右。它的寡糖链一 般都由两个n - 乙酰基氨基葡萄糖单元和一个甘露糖单元组成核心构造。寡糖链 构造一般可分两大类：高甘露糖型和混合型。糖通过还原端的n 乙酰基氨基葡 萄糖与肽链中天冬氮酸相连，典型的糖连接位点的氨基酸顺序为a s nx t h r s e r 。糖链在r i p s 中的功能目前还不十分清楚，据推测可能与它们在植物 中的溶解度以及与靶细胞位点的结合有关。 翌! ! 垒些查堂堡主兰堡! 兰些! 墼 2 1 2 作用机制 r i p s 的作用类型一般分为两类： ( 1 ) r n a 水解酶型。如帚曲菌素( a s a r c i n ) ，专一水解2 8 sr r n a 的6 4 3 2 5 位和a 4 3 2 6 位间磷酸二酯键。( 2 ) r n a n - 糖苷酶型。绝大多数r i p s 的作用类型为r n an - 糖苷酶型。具有n - 糖苷酶活性 的r i p s ，能脱去核糖体2 8 s 大亚基r n a 颈环结构上g a g a 保守序列特定位点的 腺嘌呤，干扰核糖体与延伸因子e f _ t u 和e f - g 的结合，抑制蛋白质的合成【4 4 】。 虽然，r i p s 对动物、植物、酵母、大肠杆菌核糖体r n a 的作用位点具有同源性 【4 6 】，但r i p s 对不同来源的r n a 敏感性不同，并且对裸露的纯化2 8 s r r n a 的作 用却不敏感，这一点说明r i p s 不仅需要识别特定的r n a 结构而且需要识别一定 的蛋白构象。有证据表明【4 7 j 8 lr n an - 糖苷酶导致的6 0 s 亚基的失活还伴随着因 2 8 s r r n a 的a 4 3 2 4 位脱腺嘌呤而产生的构象变化。r i p s 对d n a 也有不同程度的 脱腺嘌呤作用。有趣的是，所研究的i i 型r i p s 在未还原时也能脱去d n a 的腺嘌 呤，而作用于核糖体时，它们必须预先还原使其a 、b 链分开，这可能与核糖体 和d n a 的不同立体障碍有关。 另外，不同r i p s 起作用需要的辅助成分不同。天花粉蛋白( t r i c h o s a n t h i n ， t c s ) 需要c a 2 + n ”，多花白树毒蛋白( g e o n i n ) 的作用受m g ”，a t p 的影响1 j ； t r n a 对r i p s 的活性也有调控作用，但多花自树毒蛋白( g e l o n i n ) 需要t r n a ( t r p ) ，麦仙翁毒蛋白( a g r o s t i n ) 需要t r n a ( a l a ) ，大麦的r i p s 需要t r n a ( a l a 、v a l ) ，而商陆毒蛋白一s ( p a p - s ) 则需要t r n a ( g l y ) p 。 2 2 核糖体失活蛋白的生物活性 核糖体失活蛋白的r n an 一糖苷酶活性已经得到了广泛的研究。近几年来， 人们又发现了r i p s 的一些新的活性。 1 、d n a 解旋酶活性：r i c i na - c h a i n 、商陆毒蛋白、天花粉蛋白、a 一苦 瓜子蛋白等r i p s 都可以使超螺旋d n a 解旋，变成带缺刻的环状d n a 甚至线状 d n a ”j ，其酶学机制主要是依赖于超螺旋d n a 的单链核酸内切酶【4 9 】。 2 、超氧化物歧化酶活性：刘望夷、陈淮扬等发现，克木毒蛋白( c a m p h o r i n ) ”具有超氧化物歧化酶的活性，这是首次发现r i p s 具有这种活性。 3 、免疫调节活性：r i p s 都是强致免疫性的，许多r i p s 都是强有力的过敏 原。同时，所有的r i p s 都具有免疫抑制活性。 4 、抗病毒活性：r i p s 对动植物病毒都有抑制活性。r i p s 抗病毒的机制可 6 塑j ! 奎些杰兰堡主兰垡! 兰些! 堡苎 能是细胞被感染后，r i p s 易于进入，阻止蛋白的生物合成，从而减少病毒复制， 达到抗病毒效果。 5 、抗a i d s 病病毒活性：t c s 、一和b 一苦瓜子蛋白f 5 3 】、多花树抗h i v 蛋 白( g a p 3 1 ) 、美洲商陆抗病毒蛋白( p a p ) 以及新发现的a l o c a s i n 9 ”、 f o e t i d i s s i m i n ”i 等r i p s 都具有抗h i v 复制的活性。r i p s 除可抑制h i v 外，还 对随h i v 并发的h s v 等病毒感染有抵抗作用。目前尚不清楚r i p s 抗h i v 的机理， 但就t c s 而言，t c s 似乎选择性的影响病毒核酸的合成、加工和稳定，阻断病 毒g p l 2 0 的结合或者影响c d 4 细胞受体与靶分子的融合过程，单纯的核糖体失 活作用并不能完满解释r i p s 的抗a i d s 活性”“。 6 、r i p s 对细胞代谢和细胞凋亡的调控：一方面，鉴于r i p s 对蛋白质合成 的抑制作用，人们认为r i p s 可能通过对核糖体活性的调节来调控植物体中蛋白 质的合成。另一方面当植物衰老或遭受温度、渗透压等胁迫时，r i p s 会被诱 导或活性增加；与微生物共培养的栝楼中的天花粉蛋白含量增高。因此。有可 能当植物处于逆境、衰老或被病原体侵染时由于细胞自身的变化，使自身的 r i p s 被切割成活性形式或从储存处释放出来进入细胞质，与核糖体相接触使其 失活，导致整个细胞由于蛋白合成受阻而死亡或引起细胞凋亡。 最近，b u s s i n g 等报道蓖麻毒素等核糖体失活蛋白可以诱导一种线粒体蛋 白a p 0 2 7 的表达p “( a p 0 2 7 是一种能够介导细胞发生调亡的蛋白) 。类似现象 也在其它r i p s 作用时被发现。这是个非常重要的发现，说明r i p s 强烈的抑 制蛋白合成的同时却能诱导另一些蛋白质的表达。 2 3 核糖体失活蛋白的应用 r i p s 的研究具有理论与实际的双重意义。在应用研究方面，除用于抗h i v 一1 外，t c s 还有较广谱的抗病毒活性，可抑制体外培养的乙肝等7 种病毒生长【5 ”。 t c s 可刺激细胞免疫系统，诱导l g g 和l g e 产生f 2 4 。2 ”。为降低t c s 诱导的超敏 反应以及延长其体内半衰期，有人用葡聚糖等大分子来修饰t c s ，取得了良好 的效果。另外，t c s 抗肿瘤活性研究也取得了一些新进展”1 。 在基因工程方面，由于真菌核糖体是r i p s 的敏感底物，体外实验中天花粉 蛋白( t r i c h o s a n t h i n ，t c s ) 对9 种不同的真菌都有抑制作用。目前r i p s 基因已 被导入一些经济作物，培养出抗病毒或抗虫的转基因作物咖l 。如转天花粉蛋白 ( t r i c h o s a n t h i n ) 和香石竹毒蛋白( d i a n t h i n s ) 基因的烟草分别对胡萝h 花叶病 7 ! ! j ! 查些查堂堡主堂垡! 兰些! ! ! 兰 毒( t u r n i p m o s a i c v i r u s ，t u m v ) 和非洲木薯花口l 病毒 ( a f r i c a n c a s s a v a m o s a i c v i r u s ，a c m v ) 具有抗性1 4 1 6 ”。 理论研究中，r i p s 可作为分子探针用于核糖体结构与功能的研究。核糖体 结构与功能的研究是分子生物学中一个活跃的领域。核糖体可以看作是一个由 多种蛋白质和r r n a 组成的复杂酶系( 合成蛋白质的聚合酶) 。以前，多数人认 为核糖体蛋白质可能发挥催化作用。但近年来，随着r i b o z y m e 的发现1 6 ”，越 来越多的人开始转向认为r r n a 可能是催化蛋白质生物合成的主要物质，而核糖 体蛋白质只不过起着稳定和改变r r n a 构型的辅助作用。r n an - 糖苷酶作用机制 的阐明为后一种观点提供了新证据。因为r r n a 上除去一个腺嘌呤碱基，从分子 量的变化上看，核糖体的损失可以说微乎其微，但核糖体却完全丧失了活力。 这个事实强有力的说明，r r n a 在蛋白质生物合成中具有重要的生物功能。 而且，r i p s 无论是r n a 水解酶型还是r n an - 糖苷酶型，都专一作用于真核 核糖体2 8 sr r n a 或原核核糖体2 6 sr r n a 中一富含嘌呤的高度保守结构域，即 “r sd o m a i n ”，其中的g a g a 序列是r i p s 修饰的具体位点。“r sd o m a i n ” 的细微变化，核糖体失活蛋白的构象变化，延伸因子及各种效应剂与核糖体结 合等均可影响r i p s 的活性。另外，新的研究发现，r i p s 不仅对核糖体r r n a 有 脱腺嘌呤作用，而且还可脱去d n a 、非核糖体r r n a 以及p o l y a 上的腺嘌呤p ”。 因此，r i p s 已成为研究核糖体拓扑结构及r r n a 催化功能的一个有效的分子探 针。 2 4 展望 近几十年来，国内外对r i p s 的结构与功能研究均取得了很大成就，尤其在 蛋白质高级结构及其失活核糖体机制方面。此外，一些新的活性，如类似d n a 酶的解螺旋活性及抗h i v 活性的发现，为它的应用研究开辟了一个崭新的方向。 目前，r i p s 的研究主要集中在特异性免疫毒素的制备及其在癌症、艾滋病等病 毒病防治等应用方面。植物方面深入的机理研究和应用研究并不十分多，r i p s 的生理功能还不太明确。随着研究的深入，相信研究r i p s 的结构，阐明其生理 功能，并定向改造天然r i p s 具有十分广阔的研究前景。 3 微量元素的研究 自然界9 2 种天然元素，已有8 1 种在人体内检出，无疑人体是由多种元素 建造而成州】。生命元素即生物元素，是指在人体中维持其正常生物功能所不可 8 塑! ! 查些查堂堡主兰堡! 望些! 堕塞 缺少的那些元素。如h 、c 、n 、o 、s 、p 、c a 、m g 、n a 、k 、c i 、f e 、i 、c u 、 z n 、m n 、c o 、m o 、s e 、c r 、s n 、v 、f 、s i 、n i 和a s 等，共计2 6 种。其中 前1 1 种称为宏量元素，前6 种是蛋白质、脂肪、糖和核酸的主要成分，即构成 生物体的基本元素；后5 种则是血液和体液以及许多重要生化、代谢过程的必 需组分。除此之外，存在于活体组织中，显示出重要生物功能，其浓度可用微 克，克或毫微克，克表示的一些元素称为微量元素，如v 、c r 、m n 、f e 、c o 、n i 、 c u 、z n 、m o 、s n 、s e 、f 、s i 和i 、a s 等1 5 种。a s 尚有争议。目前看来，候 选的必需微量元素还有l i 、b 、a i 、g e 等1 6 ”。其中金属占很大比例，而且绝大 多数是过渡金属元素。 过渡金属元素的离子半径小，有空的d 轨道，故有强的配位能力，能和氨 基酸、蛋白质或其它生物配体形成生物配位化合物，并且因配体不同和配位环 境差异，配位数可以不同，有可变的空间几何构型，这些都是微量金属元素能 在生命化学中扮演重要角色的理由。各种必需元素在人体内都有一定的浓度范 围，过量或缺乏都对机体有害。体内对微量元素的平衡机制能调控其浓度，在 摄入量不足时，机体可以动用体内贮存元素，在摄入量偏高时，机体可排泄多 余元素。但摄入量过多，并超出机体排泄能力，这些元素就会在体内积累而致 病。 3 1 微量元素的生理功能 人体中的微量元素有些是对人体有益的，有些是有害的。目前已知对人体 长寿有益的微量元素可能有：s e 、z n 、m n 、c u 、c r 、m g 、r b 、g e 等，这些 金属离子控制着大量的生理生化过程，在不同的生物过程中，起着非常重要的 作用。体内有害微量元素有：c d 、h g 、p b 、s n 、b e 、a s 和a l 等，它们借与天 然螫合剂螯合进入活细胞。螫合作用增大了金属脂溶性。因此有些离子停留在 细胞表面上。另外一些则进入细胞内部，这时螫合物中的配体部分将被溶酶体 水解代谢掉，并将活性极高的金属离子释放出来，它们即与亚细胞组分或其它 生物大分子相结合，从而显示毒性作用。例如镉在人体肝肾中与巯基组氨酶三 甲基金属盐形成配合物，此外还能取代含锌酶的锌，抑制含锌酶的活性。汞可 与蛋白质中的半胱氨酸上的巯基结合，抑制巯基酶功能6 ”。 人体中微量元素的含量虽然十分微少，但与人体的生理功能密切相关，在 人体的生理机能和新陈代谢中起着非常重要的作用 6 8 , 6 9 。研究发现，微量元素 9 翌j ! 奎些盔兰堡主兰垡! 兰些! 笙奎一 的生理功能主要有： 1 、运载作用 分子氧等大量元素对于许多消耗能量的生物过程的再生以及在生物体内合 成一系列化合物是必不可少的。而微量元素就像一种运载工具，把生物体占体 重百分之九十以上的大量元素带到各组织中。例如血液中的铁就是氧的运载1 具。承担贮存和输送氧的功能的最重要蛋白质是含铁蛋白质( 血红蛋白、肌红 蛋白和蚯蚓血红蛋白) 、含铜蛋白( 血青肌) 和含钒蛋白( 血钒蛋白) 。 2 、作为酶的主要组成部分参与体内生命活动 微量元素与酶有着非常密切的关系。人体发现的近千种酶中有5 0 - - - 7 0以 上的酶需要微量元素参加或激活才能发挥生物学作用【7 ”。这些酶促进体内各种 复杂的生物化学反应，例如锌参与碳酸酐酶、d n a 聚合酶、胸腺嘧啶核菅激酶、 碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶等重要酶的合成。体内缺少必需的微量元素就会影响 这些酶的生理功能，使新陈代谢受阻，严重时会导致疾病，甚至死亡。 微量元素中的过渡金属离子，大部分都是酶体系不可缺少的组分。一方面， 某些微量元素是酶的结构成分、活性中心。如钼是亚硝酸盐还原酶的组成成分 川。m i c h e l s e n 等证实锌离子是d n a 聚合酶的一个重要组成成分l ”i 。1 9 7 3 年， r o t r u c k 证实红细胞谷胱甘肽过氧化物酶( e r y t h r o c y t eg l u t h a t h i o n ep e r o x i d a s e ， r b c g p x ) 中含有硒元素，且硒与酶的活性密切相关【7 ”，后经深入研究，证实硒 是酶活性中心的必需组分，参与构成硫氧还蛋白还原酶油i o r e d o x i nr e d u c t a s e ， t r ) 、脱碘酶( i o d o t h y r o n i n e d e i o d i n a s a ，i d ) 等酶的活性中心i ，4 j ：另方面，某些 微量元素离子作为激活剂影响酶的活性。锰和锌等都具有激活酶的作用。微量 元素锌与酶的关系最密切，大约有3 0 0 多种酶与锌有关”。 在酶催化( 生物催化) 中，金属离子具有重要的作用。并且大多都是过渡 金属离子如z n 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 、c 0 2 + 、m 0 2 + 等，这是因为过渡金属离子体积 小、电荷高、电荷密度大，易于和生物配位体形成配合物，在反应中它们是较 强路易斯酸，易接受底物的电子对发生配位作用而使底物活化。 3 、参与激素的合成 激素在体内的作用就像一个大工厂中的管理系统，它控制着全部生理活动。 大量研究证明，微量元素能影响激素的生物学作用。例如，锶可以促进胰岛素 的功能；铜可以促进色素的功能；钼可以促进雄性激素功能：硒促进免疫功能； 1 0 ! 型! 查些丕堂堡主兰垡! 望些土兰苎一 锌促进激素功能；而碘则是甲状腺原激素，甲状腺素和三碘甲状腺素的必要成 分，它通过形成甲状腺素发挥生理作用。 4 、核酸稳定性 微量元素c u 2 + 、m n “、z n 2 + 、n i “、c 0 2 + 等可进入核酸的碱基对之间，影 响核酸的稳定性7 “。用酶切技术等表明，随着c u 2 + 与d n a 作用的加强，d n a 构象由b 型转变为c 型，结合发生在d n a 的g ：c 区，c u 2 + 还可作用于双螺 旋d n a 使其中的键断裂，双股螺旋解旋。体内外研究表明，镍与d n a 、蛋白 质相互作用，可引起d n a 一蛋白质( 可能是染色体) 交联和d n a 单链断裂。 导致d n a 损伤和细胞毒害作用，改变了存活细胞的基因表达。镍还能破坏细 胞内的信息沟通，这是肿瘤促进剂的一个特征【7 l 7 $ 。 5 、基因表达调控作用： 必需微量金属元素可通过摄入量的变化影响金属元素效应元件与效应元件 结合蛋白的结合反应，从而起到基因转录或转录后的正向或负向调节作用。例 如，铁可以调控铁蛋白基因表达，铁含量越高铁蛋白基因表达就越强，并且这 种调控并非发生在转录水平，而是发生在转录后水平；b e r m a n og 0 9 1 研究认为， 缺硒引起肝脏g p x i 和g p x 4 的m r n a 活力改变，不是由于基因转录的改变而 是由于谷胱甘肽过氧化物酶对m r n a 的稳定性和翻译具有调控作用，导致硒缺 乏对不同谷胱甘肽过氧化物酶活力有不同影响。锌参与基因表达调控主要通过 以下三种形式：( 1 ) 构成遗传物质：( 2 ) 锌依赖核酸酶；( 3 ) 锌结合蛋白。另 外，铜是诱导酵母m t 基因表达的有效金属，促使m t 基因中c u p i 启动子结 合调节蛋白a c e l 。b r e m n e r t s 。l 证明铜元素的增加将显著提高m t 基因的表达量。 金属元素调控作用在工、农业方面也具有极大的应用价值。如利用m t 嵌 合基因的可诱导性进行植物选种”“、基因工程制备药物等。 6 、构成电子传递系统 铁形成的细胞色素系统及琥珀酸脱氢酶均是主要的电子传递物质。细胞色 素的化学本质为色蛋白，其辅基是铁一卟啉。f e 2 + 与f e ”之间的往复变化，即 可使电子不断传递。因此铁- u b 啉辅基中所含的一个铁原子是细胞色素酶系在 传递电子过程中的主要成分。细胞色素可把电子从黄素蛋白传递给分子氧。 另外，铜锌还可以通过多种机制起到抗自由基作用【8 2 j 。钴是维生素b 1 2 的 主要成分，维生素b 1 2 和它的衍生物发挥着高效能的生血作用，同时还参与许 l l 翌j ! 查些查兰堡主兰垡! 生些三丝塞一 多生物反应。硅和氟在体内起着一种重要的结构作用，影响着骨胶原和骨组织 的生物合成它对发挥上皮组织和结缔组织的正常功能是必不可少的。氟对牙 齿和骨骼的形成、结构以及钙及磷的代谢均有重要作用。适量的氟能被牙齿中 的羟磷灰石吸附，形成坚硬致密的氟磷灰石表面保护层。缺氟将发生龋齿，老 年人缺氟可致骨质松脆。 3 2 微量元素与疾病 人体中的微量元素只能在一个严格的、较狭窄的合适浓度范围内发挥其有 益作用，摄取过多或不足，都会破坏体内的代谢平衡，引起生化演变而致病。 微量元素都来自与人类生活有关的自下而上的地质环境中，由于不同地区 的地质面貌、气候条件不同，元素的分布呈明显的地区性差异。研究表明，干 旱或湿润地区都是元素分布异常区，生活在这些地区的居民容易患各种地方病。 如缺乏碘会引起地方性甲状腺肿及克汀病( 呆小病) 等。 同时，必需( 有益) 微量元素在过量时对人体也有害l ”i ，如，锌的过茸与 缺乏都会导致中枢神经系统的损伤【。而且已经证明铬、钴、镍、锌等金属以 及镍、钛、铁的特殊有机化合物是致癌的，锰、铜等也具有难以解释的致癌性 。 微量元素除了与癌、地方病的相关性以外，还与内分泌、心血管、肺气肿、 肾功能、免疫缺陷、自内障等其它疾病的发病有关系【8 6 i 。研究表明，铜、锌、 铁、铬、锰、硒、氟、钒、铅、镉等微量元素都与冠心病的发病有关 8 7 , s s l 。缺 铁可导致贫血，免疫功能障碍，头痛与注意力低下m 。微量元素铬与糖尿病关 系密切，补存铬有助于糖尿病的缓解【”，1 ，”。钒也具有降糖作用，并且具有抑 制胆固醇合成，促进造血功能等作用【”, 9 4 , 9 5 1 。 业已发现，病人与健康人之间体液或脏器中的微量元素的含量存在差异， 如急性淋巴细胞白衄病患者淋巴细胞中钴含量明显升高，铁含量减少m 即1 ；尿 毒症患者，铝、镉、镧、锶、铬、锌等微量元素在骨骼中过量积累f ”i ：近几年 研究发现，h i v 感染者及a i d s 患者体内微量元素平衡失调，d w o r k i n 发现a i d s 患者全血及红细胞s e 含量显著降低凹j ，w e i n e r 等学者观察到，a i d s 患者血清 或血浆中z n 含量显著降低【”1 “1 ，s c h u h m a c h e r 等也发现a i d s 患者血清中m n 含量降低。因此，许多研究者指出，根据微量元素变化，调节微量元素的含量 有助于病情缓解。 1 2 ： 塑! ! 查些查堂堡圭堂垡! 望些三兰苎一 目前，国内外已有多种微量元素制剂、金属盐和金属螯合物制剂、核医学 诊断药物及金属解毒剂等。而铂、锗、锡等金属螯合物抗癌药物的开发和作用 机制研究，特别是中药微量元素的应用研究，还有待于深入探讨。 因此，了解必需微量元素的生理功能为阐明疾病的发生和诊治提供了依据， 是一个充满希望的研究领域。 3 3 中药中的微量元素 根据资料报道，测定了产地明确的8 0 多种市售生药中镁、铁、铜、锌等元 素的含量，发现四分之三生药中铜含量为1 0 l 矿，虎杖中铜含量最高，达3 6 4 x 1 0 。和1 6 0 0 1 0 4 ；紫草含铁量最高，达3 3 3 0 x1 0 4 。测定多种生药中的金属 含量，发现有利尿作用的中药( 茯苓等) 中钙含量是镁含量的1 0 倍以上，含皂 苷的中药一般钾含量较高，其他代表性的是柴胡中的铁( 3 6 3 1 0 4 ) 、泽泻中 的锰( 3 8 3 1 0 。6 ) 、白术中的锌( 7 0 5 x i 0 4 ) 和麻黄中的锶( 4 7 0 1 0 ) 等。 由此可知，中药除含有多种有机成分外，还含有多种常量和微量元素。中药中 发挥治疗作用的除有机成分外，无机成分也不能忽视【l “】。李恩宽、陈和利、王 健等都先后证明了微量元素与中药四气、五味及中医证等有关系“0 3 ，j 。 张之中等研究发现，地道三七与非地道三七无论在性状方面还是在微量元 素含量方面都有比较显著的差异i ”“。中子活化法测得烟台的黄芪含钼远较四 川、山西的黄芪要高，四川天麻的铷、钼、锰、锌的含量显著不同于l 临近省的 天麻。中国的正品柴胡与日本和朝鲜相比，微量元素的含量也不同，这便是“地 道药材”的实质。品种不同，药性也有差异。青海省的8 个不同品种的大黄， 所含微量元素差异极大。经原予吸收光谱测定、中药微量元素的含量随季节而 变化，是中药“采之有时”的道理。由此可以看出，微量元素在鉴别中药材地 道与否和真伪上有重要意义。 中药寒、凉、温、热四性是中药l 临床用药的重要理论之一。陈和利等对1 0 0 多种道地生药研究发现，中药药性与锰、钴、铬、镍、镁等元素的含量有关【i ”】。 管竞环等学者的研究也发现，药物中各种无机元素含量水平是决定植物类中药 四性的主要因素之一f ”。祁俊生等通过因子分析和聚类分析也证明，通过测定 中药中微量元素含量，在一定程度上能反映中药的性能。因此研究中药中的微 量元素是揭开中药药性机理的途径之一i j ”j 。 微量元素是中药的有效化学成分之一，这已无可置疑，但对它的作用实质 翌韭查些盔堂堡主堂堡! 兰些上兰塞一 尚有争议。有人认为中药微量元素的作用主要取决于微量元素的种类和含量高 低，如认为中药中铁含量高就可补血之类。为了说明问题，举一个大家都熟悉 的微量元素作用的实例，氯化钴( 无机盐) 和维生素b 1 2 ( 钻的配合物) 都能 刺激造血功能，但它们的作用强度后者是前者的5 万倍，为什么差别这样大昵? 原因是，虽然都是钴的作用。但前者是钴离子，后者是钴的配合物，由于微量 元素钴的结构不同，即存在状态不同，使其生物活性发生了相当大的改变。曾 成鸣等发现芦丁对癌细胞无杀伤作用，硫酸铜液对癌细胞仅有轻微杀伤作用， 但芦丁铜( i i ) 络合物的杀伤作用却较大。一系列研究证明，当中药中的微量 元素存在状态发生改变时，即形成配合物后，其生物活性会有下列几方面重要 变化： ( 1 ) 可以具有原有有机成分和微量元素的生物活性； ( 2 ) 可以提高某一成分的生物活性或降低其毒副作用； ( 3 ) 有时可以产生两者所不具备的新的生物活性； ( 4 ) 形成配合物，增大了微量元素的生物利用度。 从上述讨论中可以看出中药微量元素发挥作用的实质在于微量元素在中 药中的存在状态，而不是直接与其种类及含量有关。并且，有机结合态的微量 元素较无机态微量元索具有更大的活性o i 。 中药中化学成分间的协同和拮抗作用是很突出的，尤其当中药中的微量元 素和有机成分发生配合反应后，即改变了它们的物种形态后，会使它们的生物 活性发生改变或产生新的生物活性，因此，中药中化学物种形态与生物活性关 系的研究应是中药微量元素和中药有效化学成分研究的前沿和新生长点中最核 心的内容。 中药微量元素和中药有效化学成分研究的前沿和新生长点主要包括下列具 体内容： ( 1 ) 微量元素和有机成分的配合作用以及它们本身的存在状态和生物活 性的关系。 ( 2 ) 中药中有机金属配合物的提取分离和结构测定以及生物活性研究。 ( 3 ) 中药中微量元素间、有机成分间和配合物问以及它们之间协同和拮 抗作用的研究。 ( 4 ) 中药中微量元素间、有机成分间和配合物间的相互作用及其产物和 1 4 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 生物活性关系的研究。 综上