（生物医学工程专业论文）膜片钳等电生理技术在中药川楝素研究中的应用.pdf

华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t e l e p h y s i o l o g i c a lr e s e a r c hb e n e f i t st h ei l l u s t r a t i o no fm e d i c a lm e c h a n i s mi nt h e m i c r o c o s m i cl e v e l i n t r a c e l l u l a rc a 2 + i sa l li m p o r t a n tk i n do fi n t r a c e l l u l a rs e c o n d m e s s e n g e r s i tr e g u l a t e sm a n yc e l l u l a rp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e sa n di sa l s oi n v o l v e di nt h e o c c u r r e n c eo fm a n yp a t h o l o g i c a le v e n t s u n d e rn o r m a lc o n d i t i o n st h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o n ( c a 2 + oi sc o n t r o l l e db yv a d o u sm e c h a n i s m st om a i n t a i na tar e l a t i v e s t a b l el e v e l t o o s e n d a n i ni sat r i t e r p e n o i dd e r i v a t i v ee x t r a c t e df r o mt h eb a r ko fm e l i a t o o s e n d a n i ns e i be tz u e cw h i c hi su s e di nc h i n e s e 仃a d i t i o n a lm e d i c i n ea g a i n s ta s c a r i s a n db o t u l i s m u s t h em e c h a n i s mi sr e l a t e dt oi t se f f e c to nn e u r o m u s c u l a rs y s t e m i no r d e r t ou n d e r s t a n dt h em i c r o c o s m i cm e c h a n i s m so fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n et o o s e n d a n i n t h ep a t c hc l a m pa n dm i c r o f l u o r o m e t r yt e c h n i q u e sw e r eu s e dt os t u d yt h em e m b r a n ei o n i c c h a n n e l sa n dt h ee f f e c to ft o o s e n d a n i no n 【c a 2 + 】ii ns i n g l er a tc h r o m a f f i nc e l l t h em a i n r e s u l t so b t a i n e da r el i s t e db e l o w ： 1 ) i m p r o v e m e n to fm e t h o d sf o ri s o l a t i o na n dc u l t u r eo fs i n g l er a tc h r o m a f f i nc e l l 2 ) v o l t a g eg a t e dc h a n n e lc u r r e n t s a r er e c o r d e di ns i n g l er a tc h r o m a f f i nc e l l ， i n c l u d i n gn a + k a n dc a 2 + c h a n n e l t o o s e n d a n i ni sf o u n dt oe n h a n c et h ec a 2 + c u r r e n t s o fl - c a “c h a n n e l s 3 ) 【c a 2 + 】ii sm e a s u r e db yu s i n gm i c r o f l u o r e m e t r i ct e c h n i q u e i ti st h ef i r s tr e p o r to f t o o s e n d a n i ne f f e c to n 【c a 2 q ii ns i n g l er a tc h r o m a f f i nc e l l r e s u l t ss h o w ：( 1 ) t o o s e n d a n i n i n d u c e s 【c a “】ii n c r e a s e i nc o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n c em a n n e r ( 2 ) t h em e c h a n i s m u n d e r l i e st o o s e n d a n i ne f f e c to n 【c a 2 + 】ii sr e l a t e dt ot h ei n f u xo fe x t r a c e l l u l a rc a l c i u m ( 3 ) l - t y p ec a “c h a n n e li si n v o l v e di nt h ei n f l u xo fe x t r a c e l l u l a rc a l c i u m ( 4 ) t h ec a l c i u m s t o r em a yn o tp l a yad o m i n a n tr o l ei nt h em e d i a t i o no ft o o s e n d a n i no n c a “】“ k e yw o r d s ：p a t c hc l a m p m i c r o f l u o r e s c e n tc a l c i u mm e a s u r e m e n t t o o s e n d a n i n r a ta d r e n a lc h r o m a f f i nc e l l m e m b r a n ei o n i cc h a n n e l i n t r a c e l l u l a r f r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 r 期：埘年，。月塔日 学位论文版权使用授权书 叶琴 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：叶孚 f i # ：脚年1 o 月。归 指导教师签名 日期：力咖朋栌 华中科技大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 引言 中西医之间由于发展的历程不同，存在着相当大的差异。中医所持的“证”1 1 】 不同于西医里的病症，它不易定量测量，领域极广，而含义有伸缩性，因此无法标准 化，这更使得其不易教学和广为接受。 中医现代化，简单的说，就是用现代化的科学技术包括西医学的方法来研究和 解释中医。具体来说，是通过沟通中西医两者间名词和概念上的差异，运用西医惯 用的微观方法使中医的症候尽量客观化、定量化、标准化，解释症候的生理病理学 机理，之后，再研究中药复方体系的药理学作用，将结果系统化而使中医现代化和 系统化。中医现代化已有几十年的历史，虽然在中医历史发展的长河中是很短暂的 段时间，但由于处于当前科学技术的高速发展的时代，所以这时期的中医现代化 努力，无论在中医应用科学现代化研究，还是中医基础理论现代化研究方面都取得 了许多成果。它们包括中医中各种“证”型动物模型的建立，一些常见的难症的中 医疗法的治病机理的研究，同病异证、异病同证的机理研究以及常见中药复方的研 究等等。 随着新技术的应用和正确的研究方法的采用，中医现代化，同时又促进医学现 代化的努力取得了很大的进展【2 , 3 1 。但是，目前对于中医中药的方证机理的研究仍然 存在着很大的不足。大多数的研究还停留在临床或是器官组织水平上，而未能进一 步深入到对细胞以及分子水平上发生的机制进行探讨，即外界条件的变化是如何通 过细胞第一信使、第二信使而作用于细胞内环境，引起整体上病证发生的。因此，进 一步的研究就需要应用近年来比较流行的电生理学方法如膜片钳方法等，以及分子 生物学的方法。尤其是膜片钳和荧光测量技术的发展，大大地拓宽了电生理的研究 领域，同时在电生理研究与分子生物学研究之间驾起了一座桥梁，为深入地探求生 命活动在微观上的表现提供了必要的手段。 华中科技大学硕士学位论文 1 2 电生理技术的发展以及在中药药理的研究现状 在人与其他动物的各种组织中，神经细胞、肌肉细胞和腺细胞有较高的兴奋性， 被称为可兴奋性细胞，他们在受到一定的刺激的时候，就可以产生兴奋，表现为一 系列的可逆的电变化。这些电变化不仅可以看成是兴奋的表征，而且是兴奋细胞 实现一些重要功能的关键或是决定因素。从细胞或是亚细胞的水平阐明生物电产生 机理，解释电变化和细胞功能间的关系，始终是电生理研究的一个重要领域。 考察各种电生理技术在西方医学和生物学中的进展状况，对于我们明确如何开 展中医中药在细胞和分子水平上的研究有着重要的参考意义。 1 2 1 膜片钳技术的发展 早在1 7 8 9 年，g a l v a n i 就发现人体上存在电活动。在之后的1 5 0 多年里，关于 人体生理学和医学的基础性研究也类似于目前的中医研究，主要集中在临床的整体 器官及组织水平上。直到1 9 4 6 年美籍华人凌宁将微电极细胞内记录技术引入生理 学，从而开创了细胞生理学的新纪元。他应用这一技术，第一次测得单个细胞的膜 电位和膜电流n1 9 4 9 年出现电压钳记录技术，应用电压钳方法，h o d g k i n 和h u x l e y 于1 9 5 2 年提出并验证了动作电位的n a + 通道学说，并因此而获得诺贝尔生理与医 学奖【5 1 。 1 9 7 0 年前后，有关神经元间通讯的主要信号机制已经确立，突触化学传递的概 念也由于兴奋性后突触电位( e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，e p s p ) 和抑制性后突触 电位( i n h i b i t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，i p s p ) 的深入研究而被人们接受，然而隐含在这 些信号之下的分子机制的问题仍未解决。当时，n a + 通道和k + 通道的概念已经被经 常使用，但是在生物膜上进行测量以证实单个通道的存在，由于较大水平的背景噪 声的原因而不可能实现。 随着科学技术的发展，在离子通道研究上，出现了单通道电流记录技术，即所 谓的膜片钳技术( p a t c hc l a m pt e c h n i q u e ) ，它将离子通道的研究推向高潮。1 9 7 6 年，n e h e r 和s a k m m a n 通过用一根尖端直径微米的玻璃微电极与细胞膜表面相封接， 首次在蛙胸皮肌细胞膜上记录到a c h r 通道的单个通道电流，其分辨率高达p a 级， 华中科技大学硕士学位论文 标志着电生理研究从细胞水平进入到分子水平1 6 】。之后，n e h e r 等继而发明了g f l 封 接技术，即利用玻璃微电极与清洁的细胞膜表面形成的高阻抗的紧密封接，使电极 尖端所吸引的膜片与膜的其他部分在电学上隔离开来，通过形成不同的膜片钳构 型，可完成对单一细胞的离子通道电流( w h o l e c e l lr e c o r d i n g ) 或是某膜片上单 通道离子电流( s i n g l e c h a n n e lr e c o r d i n g ) 的记录。 随着研究的深入，各种派生而来的模式也被发现了。o w e nh a m i l 和b e r t s a k m m a n ( 1 9 8 1 ) 几乎与h o r n 和p a f l a k ( 1 9 8 0 ) 同时发现，只要将已封接好的电极上提， 就可以使膜片从细胞上分离出来，形成”分离膜片”，从而可以方便地改变膜两侧的 溶液；而如果换种方法，用脉动式负压或电脉冲，可使微电极尖端下的膜破裂而 又不影响微电极与细胞膜问的封接，使微电极细胞组装体与胞外浴液仍保持绝缘， 这样能通过控制整个细胞上的电压来测量整个细胞上的电流反应【7 1 。全细胞膜片钳 与传统的微电极穿刺法相比，具有以下的优点： 1 ) 细胞内与浴池间的泄漏作用小。 2 ) 电极接触阻抗与封接阻抗相比很小，电压钳位的条件容易达到。 3 ) 微电极与细胞间弥散交换和平衡快，因而容易控制细胞内液的成分。 由于它的以上特点，使它适于记录大多数细胞培养的标本和分离的组织，特别 是对哺乳类的小细胞进行电生理分析，因为这些细胞无法经受各种传统方法的穿 刺。h a m i l l 等发表的有关膜片钳改造技术的论文，标志着离子单通道技术的成熟。 膜片钳技术的出现不仅为了解生物膜离子通道的开启和关闭、动力学、选择性 和通透性机制提供了直接的研究手段，而且极大地扩展了传统电生理研究的范围， 是电生理的研究从通常的无脊椎动物大细胞中解脱出来，向着哺乳类和人类细胞发 展，因而在欧美日等先进国家的电生理研究学界迅速普及，形成了离子通道的研究 热潮。 应用膜片钳技术已经在分子水平上揭示了心脏病，糖尿病和癫痫等严重的疾病 的病因，并为许多新药品的研制提供了理论依据嗍。该技术正派生出许多其他生物 物理与生物化学技术，如全细胞灌流、分子探针、细胞分泌检测、大脑切片膜片钳、 多聚酶链反应等技术。且该技术不仅适用于动物细胞，亦可推广到植物细胞，总之， 华中科技大学硕士学位论文 膜片钳技术应用前景是十分广泛的1 9 】。 近年来，膜片钳技术更与其他的电生理技术更多的结合在一起，如胞内显微荧 光测量游离钙浓度技术，膜电容监测技术，碳纤微电极记录分泌技术等等，为更深 入的研究理解细胞内各种第二信使，g 蛋白，通道等要素之间的复杂的关系，提供 了必要的手段。 1 2 2 细胞内第二信使一c 一及荧光测钙技术的发展 细胞内c a 2 + 作为细胞内第二信使，起着十分重要的作用1 1 0 1 。早在1 8 8 3 年，英 国生理学家s y n d n e yr i n g e r 就发现离体蛙心脏浸泡在含有c a 2 + 的介质中可以维持肌 肉收缩，认识到c a 2 + 作为细胞调节剂的重要性。本世纪5 0 年代，美国宾州大学的 l vh e f l b r u u n 观察到c a 2 + 注入肌肉纤维后引起肌肉收缩的现象。 此后，人们逐渐认识到c a 2 + 几乎可以影响到细胞各方面的生理活动 1 l r1 2 】。例如 c a “能调节许多胞内活动，如细胞的运动、分裂、胞饮、胞吐、受精过程、环腺苷 酸的合成和分解、肌纤收缩、神经递质和某些激素的合成和释放以及在学习和记忆 中突触的伸展性和趋向性，甚至基因的转录等等。c a 2 + 也与很多病理过程相关，例 如人们发现a l z h e i m e r 早老年痴呆症病人的神经细胞内线粒体会引起胞内游离钙离 子自稳平衡受到破坏，致使胞内细胞骨架( c y t o s k e l e t o n ) 瓦解( d i s r u p t i o n ) ，神经轴 突退化，最后引致细胞死亡；而c a m p ，c a “，c a m 涉及的胰岛素释放也与胰岛素 依赖型糖尿病的产生有一定关系。 细胞溶质内的自由状态的c a 2 + 浓度( c a 2 + 1 i ) 大大小于细胞的总c a 2 + 量。这是 因为细胞质内绝大多数的钙被储存在亚细胞器，或结合在细胞结构成分或大分子 上。钙媒介的反应是c a 2 + 与特异性钙调蛋白作用，改变酶的活性，而导致的可以观 察到的细胞反应。因此细胞溶质内游离钙离子浓度f c a 2 + 】i 是调节各种反应的关键【1 3 】。 这样使得胞内游离钙浓度的定量检测变得十分重要。 第一次测定活细胞的【c a 2 是印年代用水母发光蛋白( a e g u o r i n ) 测定巨肌肉 细胞中 c a 2 + 1 i 1 1 4 l 。到7 0 年代，又有两类方法用于 c a 2 + 】t 的测量，双偶氮吸光染 料o r s e n z o l i i ) 和c a 2 + 选择性微电极法【1 5 】。到1 9 8 2 年，r o d g e r 5 ( t s i c n 和其合作者 4 华中科技大学硕士学位论文 合成了一代新的荧光染料q u i n 一2 1 1 6 l ，在不破坏细胞情况下染色测量单个活体小细胞 胞内1 孓2 c a “1 i ，标志着一种有广泛应用前景的新技术的成熟。它为深入理解胞内钙 信号的作用提供了重要的方法。 随后更进一步发展了新的一系列钙离子荧光指示剂，f u r a 一2 、i n d o 1 、f l u o - 3 和 r h o d - 2 等【”剖。这些新的荧光染料被称为钙荧光探针( f l u o r e s c e n tp r o b e ) ，属于一 种无损伤的测量方法。 这些新的荧光测钙的方法与原来的方法相比，优越性很明显。首先表现为便于 使用。荧光染料如q u i n 2 、f u r a 2 、i n d o 1 等都是疏酯分子，不能自由进入细胞，但 是和乙酰甲基酯( a c e t o x y m e t h y le s t e r ) 相连后成为亲酯性的膜通透衍生物，可以进 入细胞。进入细胞后又可以被胞内非特异性酯酶水解成原来的四碳化合物。它可以 与胞内游离钙离子结合，此化合物随着与钙离子的结合的多少在不同的激发波长上 荧光呈现出强弱的不同，可以用来测量胞内钙离子浓度。而染色过程就变得相当简 单了，只要把细胞和所选染料a m e s t e r 分子孵育二至三十分钟，再洗去染料即可。 这样的导入方法也可以维持细胞膜的完整性，从而避免对细胞膜造成损伤引起钙离 子漏电流的增加。 与发光蛋白方法相比，荧光染料测钙法大大地提高了信噪比。而在时间分辨率 上，钙离子荧光染料亦明显高于选择性钙离子微电极和n m r ( 核磁共振法) 。在空间 分辨率上，采用荧光成像技术，钙离子荧光染料是明显优于其它任何用于活细胞 c a 2 + 1 i 的检测技术，也是可用于研究单细胞c a 2 + 信号的空间分布方法1 1 6 1 。表i i 显 示了几种不同的荧光染料的特性。 表i i 几种不同的荧光染料的特性 激发波长( 1 )激发波长( 2 ) 发射波长c a 2 + 解离常数 ( 珊)( n m )( m ) o u i n - 23 3 93 5 24 9 21 2 6 f i l r a 23 4 03 8 05 1 02 2 4 i n d o 13 4 93 5 54 8 52 5 0 f i u o 34 9 05 0 65 2 54 0 0 r h o d 25 5 65 5 05 7 51 0 0 0 华中科技大学硕士学位论文 近年来，随着新的荧光染料的开发和新技术的应用，对于胞内钙离子的研究也 从一般的细胞水平深入到更精细的水平上，如钙信号的基本事件，亚细胞器内的钙 水平等等。同时，研究钙相关的生理过程以及许多疾病的工作也有很大进展。 1 , 2 , 3 细胞电生理技术应用于中医药的研究 通过细胞水平上的研究，膜片钳技术可横向地应用于各类以研究机体系统行为 为目的的学科，如神经科学及从中发展来的脑科学、内分泌学、心血管系统研究、 免疫系统研究等等。不同系统上的研究结果的交流和比较为发现各类细胞的共同特 征及探讨系统发育中细胞分化的原因和结果提供了条件。更为重要的是，对某一特 定系统上关键细胞的研究能够揭示导致系统功能失调的生理病理机制，从而使膜片 钳技术广泛应用于人类重大疾病的研究：如癌症、糖尿病、心血管疾病、神经系统 疾病等等。对重大疾病机制的研究又促进了相应的药理机制的研究。这样，膜片钳 技术又与医学、药学等生命科学的应用科学紧密联系起来了。 应用膜片钳技术和显微荧光测量胞内游离钙离子浓度技术及其他的电生理技 术，并结合分子生物学技术和生物物理的各种方法，使得有关离子通道、受体、转 运体( 载体) 、g t p 结合蛋白( g 蛋白) 以及细胞外基质分子等研究突飞猛进，许多细 胞分子水平上的病理、生理现象的发生机理都有了进一步的了解。 开展中医中药的电生理研究，有利于阐明中医在微观水平上的治病机理和量化 中医药的疗效。它可以按照以下的几个步骤来进行【1 , 2 2 , 2 3 ： 1 ) 建立西医的病与中医的证相对应的人体或动物模型，并得到器官水平上的病 证结合的机理。这一部分的研究已有相当基础。目前的关键是建立病证合一的动物 模型，从而为进一步建立细胞水平上的模型打下基础。 2 ) 利用细胞急性分离和培养技术，得到器官的关键部位的的单个细胞，如糖尿 病研究中的胰腺细胞，肾病研究中的肾上腺髓质嗜铬细胞，肝病研究中的肝细胞等 等、建立病理和正常情况下的不同器官组织的关键细胞模型。根据现有的文献和本 实验室所掌握的细胞培养经验表明，如能够得到病证合一的动物模型，则经过努力 就能够得到相应的细胞模型，进而开展各种电生理等方面的研究。 华中科技大学硕士学位论文 3 ) 应用电生理学的方法研究正常与病理情况下，单个细胞的电生理参数的差异， 初步探讨病证分子水平上的发生机理。由于中药的作用是多靶点作用的，所以可以 对单一证候的动物的多种细胞同时展开研究。其内容又包括： ( 1 ) 病理细胞上的钠通道、钾通道、钙通道电流的水平以及与正常情况下的 对照，研究细胞上动作电位的变化，探讨病理情况下引起的通道构像以及通透性的 变化。 ( 2 ) 应用膜片钳与显微荧光测钙的方法，同时测定细胞内钙通道电流和胞内游 离的钙离子，理解胞内第二信使钙离子在病理条件下的变化过程及引发的效应。 ( 3 ) 在深入理解钙信号的基础上，测量病理细胞的激素分泌的变化( 如肾上腺 嗜铬细胞的儿茶酚胺分泌，胰腺b 细胞上的胰岛素分泌等) ，从而研究目标细胞对激 素作用的其他的多个靶细胞的影响，与器官水平上的研究相结合。 4 ) 利用药理学的方法，并结合分子生物学的方法，通过特定的激动剂和拮抗剂 判断病理引起的电生理信号的变化是通过何种途径的损伤而产生的，即病证发生的 分子机理。 5 ) 研究中药复方体系的作用，可以先从成分相对比较简单的常用药物的研究着 手( 如只有四种成分的四君子汤) 。通过还原法，对将其成分拆开单独作用和混合后 作用在单个细胞水平上的效果进行对比，再应用先进的分子生物学方法研究中药复 方体系在细胞、分子水平上“君臣佐使”来调节身体内环境平衡而达到治病的目的 的机理。 1 3 川楝素的研究进展 川楝素是由传统驱蛔中药川楝( m e l i a t o o s e n d a ns i e be tz u e c ) 树皮中提取的三 萜类化合物【2 4 1 ，自问世后主要作为驱蛔虫药剂而用于临床【2 5 ，2 6 】。到上世纪7 0 年代 末，由于高效合成的驱虫药剂的冲击及其它种种原因而基本停产。八十年代初对川 楝素在生理及药理方面的特征，特别是对神经突触传递的阻抑作用作了探讨，认为 在生理学研究方面很有价值。施玉梁等报道了川楝素对神经肌肉传导的阻掷作用 2 7 , 2 8 。李培忠等报道川楝素主要阻断神经肌肉内的传递功能 2 9 1 。黄世凯等报道川楝 7 华中科技大学硕士学位论文 素在神经肌肉接头处可引起的亚微结构变化【3 0 3 ”。李培忠等发现，川楝素能治愈致 死剂量肉毒中毒的动物1 2 9 , 3 2 , 3 3 l ，另有文献报道川楝素能作用于大鼠中枢神经系统的 呼吸中枢，引起呼吸抑制f 3 4 1 。近年来对川楝素的研究又有了很大的突破，对川楝素 抑制肿瘤细胞增殖的作用及诱发肿瘤细胞凋亡的作用也有报道【3 5 3 7 l 。以上这些研究 充分证明了川楝素具有独特的生理作用，具有医药学的开发应用前景。 对川楝素药理上的现有研究主要有： 1 ) 川楝素可干扰蛔虫体内磷代谢，导致虫体能量供应不足，引起虫体麻痹、 昏迷，从而被寄主排出体外。 2 ) 通过症状学、组织学、酶学及多项生理指标的测试，初步认为川楝素为一 多作用点物质：能破坏虫体的中肠组织，阻断中枢神经传导而引致麻痹、昏迷、死 亡，慢性中毒则抑制解毒酶系，影响消化吸收，干扰呼吸代谢，最后因正常的生理、 生化活动受阻而引致生理病变，使生长发育受到抑制而逐渐死亡或于蜕皮、变态时 形成畸形虫体【3 8 4 1 1 。 3 ) 川楝素可使注射了数倍致死剂量肉毒的动物，如小鼠、大鼠、家兔、猴等 存活下来。研究人员在用肉毒的攻击目标一神经肌肉接头离体标本所做的实验中发 现，川楝素可以把肉毒的毒性降低几个数量级。研究人员还发现，川楝素抗肉毒的 作用部位就在肉毒的作用位点一神经突触的递质释放环节；川楝素对钾离子通道的 抑制作用，为其抗肉毒效应提供了新的解释【4 “4 1 。 4 ) 川楝素可在大鼠离体膈神经一膈肌标本上，川楝素可在突触前阻遏神经肌 肉传递，使终板电位和终板电位量子含量有一暂时升高，而后逐渐下降，直至阻断 2 7 , 2 s 。这意味着神经末梢在川楝素作用下，递质( 乙酰胆碱a c h ) 的释放先易化后 抑制。易化的机制已知是由于川楝素抑制膜上的快钾通道，引起外钙内流，从而促 进了递质释放【4 5 1 。 5 ) 对大鼠海马脑片灌流实验表明，川楝素可增强海马脑片释放去钾肾上腺素， 初步研究表明其机理可能是由于川楝素激发了i p 3 敏感型的胞内钙库，使胞内钙升 高，刺激递质分泌【4 吼。 6 ) 川楝素对多种肿瘤细胞具广谱的增殖抑制效应，且与目前应用于临床的抗癌 华中科技大学硕士学位论文 药物，如v p 1 6 ，c i s p l a t i n 及t a x o l 等相比，川楝素具有更强的抑制肿瘤细胞增殖及促 发细胞凋亡的能力，进一步的工作表明，川楝素所引发的细胞凋亡与凋亡的线粒体 通路和胞内c a 2 + 超载有关【3 5 翊。实验表明，川楝素可能是潜在的抗癌药物候选者 3 7 】。 以上研究均涉及神经递质的分泌水平，而关于川楝素对内分泌细胞的激素分泌 的效应则尚无了解。由以上结果也说明：川楝素在不同的标本上对钙的作用和对分 泌的影响是不同的。此外，上述药理研究中对细胞内钙浓度的变化只是根据递质分 泌活动来推测，并未实际地测量【c a “】i 的动态变化，因此本课题的研究具有较大的意 义。 1 4 本课题的研究内容 本课题以大鼠肾上腺嗜铬细胞为标本，研究川楝素对胞内钙水平的影响以及作 用机制。其主要内容包括： 1 ) 大鼠肾上腺嗜铬细胞的分离和培养 建立一个能稳定培养的标本是生物实验的前提，因此本课题一个首要内容就是 建立单个嗜铬细胞的分离和培养方法。由于在此研究之前国内未见有关成年大鼠肾 上腺嗜铬细胞培养方法的介绍，此项工作应该对促进国内对嗜铬细胞的电生理研究 有所裨益。 2 ) 应用膜片钳技术记录嗜铬细胞基本的通道电流 细胞膜上离子通道的活动在其分泌偶联中非常重要，建立离子通道的研究方 法，鉴别所选择生物标本上关键离子通道的种类和特性，是深入研究其分泌偶联的 基础。本课题采用细胞贴附式或标准全细胞膜片钳方式记录嗜铬细胞跨膜电流信 号，观测川楝素对钙电流的影响。 3 ) 川楝素对细胞内游离钙离子浓度的影响 胞内游离钙离子是胞内一种重要的第二信使，它不仅调控着细胞内的许多生理 过程，还涉及到许多病理的发生过程。本课题采用f u r a 2 a m 为c a “的荧光指示剂， 观测川楝素对嗜铬细胞胞内钙浓度( c a 2 + 】i ) 的影响动态，以及作用浓度与效应的关 系等。 华中科技大学硕士学位论文 2 1 材料和方法 2 实验方法、技术和原理 2 1 1 试剂 胶原酶l 、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶( d n a s e ) 、多聚赖氨酸( p o l y - l - l y s i n e ) 、 h e p e s 、e g t a 、t h a p s i g a r g i n 、f u r a - 2 a m 、c d c l 2 皆为s i g m a 公司产品，胎牛血清 为g i b c o 公司，川楝素( 纯度大于9 5 以上) 由南开大学元素有机化学研究所提供， 其它的试剂为国产分析纯。 2 1 2 主要溶液的配制 膜片钳实验细胞外液成分为：n a c l1 4 0 m m o l l ，k c l2 8 m m o l l ，m g c l 2 2 m m o l l ， c a c l 22m m o l l ，h e p e s1 0m m o l l td g l u c o s e2m g m l ，p h7 2 。 细胞贴附式中电极内液为胞外液；全细胞记录时电极内液( 单位r e t o o l l ) 为： k c i1 4 0 ，n a c l3 0 ，g l u c o s e2 5 ，h e p e s1 0 ，e g t a 1 0 m g c l 22 5 。 膜片钳实验中只记录c a 2 + 通道电流时，细胞外液用b a 2 + 来代替c a 2 + 以增强通过 细胞膜上的c a 2 + 通道的电流，内液和外液中用c s + 来代替k + 以抑制我们所不感兴趣 的k + 通道电流。 标准荧光测钙时，胞外液的成分是( 单位r e t o o l l ) ：n a c l1 4 0 ，k c l2 8 ，m g c l 2 1 ，c a c l 22 ，h e p e s1 0 ，葡萄糖1 0 ；p h7 3 。在胞外无钙时，用e g t a ( 0 2 m m o l l ) 来 代替c a c l 2 。 2 1 3 药物的施加方法 药物的施加方法有两种。一是用微取液器滴加。从而以终浓度计算影响；二是 拉出孔径为5 州的玻璃微管，加好药物，在显微镜下通过加药微操纵器置于离细 胞3 0 啪处，施加正压使药物喷出，镜下可见液体流过细胞1 4 7 1 。 i o 华中科技大学硕士学位论文 2 2 膜片钳技术 2 2 1 膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是用微电极接触细胞膜，以千兆欧( g i g a o h ms e a l ，1 欧姆) 以上 的阻抗使之封接，使与电极尖端开口处相接的细胞膜的小区域( 膜片) 与其周围在 电学上隔离，并在此基础上圃定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流( p a 级) 进行监测记录的方法。 用场效应管运算放大器( p a 图中a 1 ) 构成的i v 转换器( c o n v e r t e r ) ，即膜片 钳放大器的前级探头( h e a ds t a g e ) 是这个测量回路的核心部分r 图2 1 ) 。在场效应 管运算放大器的正负输入端子为等电位、向正输入端子施加指令电位( c o m m a n d v o l t a g e ，v c h 曲，由于短路负端子以及膜片都可等电位地达到钳制的目的，当膜片微 电极尖端与膜片之间形成1 g q ( 1 0 9 q ) 以上封接时，其间的分流电流达到最小，横 跨膜片的电流( i ) 可1 0 0 作为来自膜片电极的记录电流( i p ) 而被测量出来( 图2 - 1 ) 。 图2 - 1 膜片钳技术的原理图 r s 是与膜片阻抗相串联的局部串联电阻( 或称入路阻抗) ，r s e a l 是封接阻抗。r s 通常为 1 - 5 m q ，如果r s e a t 高达z c _ 抽0 0 9 q ) 以上时成为l p l = r s e a l ( r s + r s e a l ) ，此i p 可做为在i v 转换器( 点线) 内的高阻抗负反馈电阻( r d 的电压下降而被检测出，实际上这时场效应管运算 放大器( a 1 ) 的输出中包括着命令电压v o o 成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大 华中科技大学硕士学位论文 器( a 2 ) 时被减掉 2 2 2 膜片钳系统 本课题所使用的膜片钳放大器是e p c 一9 型计算机全自动化膜片钳放大器 ( h e k a ，l a m b e r t ，g e r m a n y ) 和p c i i 型膜片钳放大器( 华中科技大学生物物理 与生物化学研究所自行研制1 4 8 】) 。 本文中的细胞跨膜电流记录是用e p c 9 膜片钳放大器测出，而细胞的钙电流是 在本所自行研制的p c - i i 型膜片钳放大器上记录的。 e p c 9 膜片钳放大器的数据采集和记录是通过i t c 1 6 数据采集卡( i n s t r u t c c h u s a ) 和p u l s e + p u l s e f i l 8 0 软件( h e r a , l a m b e r t ，g e r m a n y ) 完成。p c - i i 型膜片钳 放大器的刺激信号输出和电流信号记录通过a d 和d a 数据转换装置( 华中科技 大学，d a 1 型) 由计算机控制，电流信号经截止频率1 k h z 的四阶贝赛尔低通滤 波器滤波，采样率5 k h z 。所有实验结果保存在硬盘内供实验后分析。封按时微电 极是用精密压电微操纵器( b u d e i g h ，u s a ) 来控制电极的上下移动。另一侧的加 药电极用三维机械微操纵器来控制( n a r a s h i g e ，j a p a n ) 。 2 2 3 操作步骤及注意事项 1 ) 电极的制备 膜片钳用玻璃微电极要求较高。实验中所用的玻璃毛坯来自于上海生理所生产 的g g - 1 7 型硬质玻璃管，长1 0 c m ，外径1 5 r a m ，内径0 9 m m ，无芯。硬质玻璃具 有较小的损耗系数，高电导率和低介电常数，产生的噪声较低【4 9 】。在使用前应确保 电极洁净，并在酒精灯火焰上将二端毛刺烧圆，以免膜片钳系统中电极夹持器内的 防漏气橡胶垫圈受损。 拉制仪使用的是p p 8 3 型拉制仪( n a r a s h i g e ，j a p a n ) 。具体拉制时一般采用两步拉 制法来得到尖端陡峭的，用于实验的玻璃微电极。第一次加热粗拉，加热量较高， 拉长l o - - 1 2 m m ，将玻璃微管从中间拉细拉长，褥到电极的大致形状，使玻璃毛坯 的中部细处直径为2 5 0 岬左右。第二次拉制时，重调加热线圈的中心位置，减小加 热电流，将玻璃电极从中间拉断。电极尖端的直径和形状取决于这一次拉制的加热 华中科技大学硕士学位论文 温度。加热温度越低，电极尖端的开口就越大。第一步拉制的长度和第二步拉制的 温度是最终电极尖端直径的主要决定性参数，如图2 - 2 所示，实验中一般用尖端直 径为1 - 2 p a n ，入水电阻为2 - 6 m f l 的电极a a b c 一“ 图2 - 2 膜片钳电极的两步拉制过程 a ：第一步拉制；b ：重定位加热丝位置；c ：第二次拉制 在记录单一的离子通道电流时，最大的背景噪声来源是电极与细胞外液间的杂 散电容 t r a yc a p a c i t a n c e ) 性噪声c s 。减少c s 噪声的方法是在微电极的尖端表面 涂敷一层疏水性、不导电的物质。通常使用硅酮树脂s y l g a r d ( d o wc o m i n gc o r p ， u s a ) 处理。这样处理后，浸入浴液的电极变成疏水性的，且整体的电容下降。全 细胞膜片钳实验时相对的杂散电容和噪声较小，所以也可以省去这一步。 拉制和涂敷后的电极尖端往往不平整，所以必须抛光后使用。我们使用m f - 8 3 型抛光仪( n a r a s h i g e ，j a p a n ) ，用铂金丝作加热金属丝，在低倍镜下找到电极，再在 高倍显微镜下将电极尖端调清晰，并将加热铂丝调节至与电极尖端同视野，调整铂 丝与电极尖端的距离及加热强度，触发加热开关，通过高倍物镜看到电极尖端略为 回缩变暗时停止加热。经过抛光处理后，玻璃微电极表面变得更加宽阔和光滑。而 v串九八 华中科技大学硕士学位论文 在涂敷硅酮树脂时，黏附于电极尖端附近的s y l g a r d 的溶剂也会被抛光加热去除， 从而保证封接的顺利进行。 2 ) 电极内液的充灌 实验中所用的电极内液必须经过过滤( o 2 n 滤膜) ，以达到无杂质。膜片钳实 验前，充灌电极液时，应先将电极尖端浸于溶液中2 3s ，利用毛细现象充灌电极尖， 再用注射针或聚乙烯的塑料管从电极尾部充灌溶液。还应注意，电极内液不要灌的 太满，否则不仅会增加噪声且浪费溶液。 膜片钳电极由b u r l e i g h 的精密压电微操纵器控制，n a r a s h i g e 的三维机械微操作 器移动加药电极。 3 ) 高阻封接的形成 电极入水之前需对气体管路进行气密性检查，并用新鲜外液置换测试皿表面的 外液以除去可能的漂浮污物。入水后电极电阻饵p c 9 功能框中标为r m e m b r 蛐e ) 会发生变化。p u l s e + p u l s e f i t8 0 设置了声音跟踪功能，可将电极电阻值转化成不同 频率的声音信号，便于实验操作。刚入水时电阻约4 - 6 m f l ，此时在计算机屏幕显示 框中可看到测试脉冲产生的电流波形，一定测试脉冲强度v l 下，放大器输出v 0 为 v 。g 旦 r m 其中g 为放大器增益。通常v t 幅度为5m v ，脉宽为5m s ，开始时g 不宜设得太 高，一般可在0 5 - 2 m v p a 下，以免放大器饱和。由于细胞外液与电极内液之间离 子成分的差异造成了液接电位( 1 l q u i d j u n c t i o np o t e n t i a l ) ，故一般电极刚入水时测试 波形基线并不在零线上。e p c - 9 功能框中的u 补偿即为此而设，按下a u t o 键即可 将基线补偿回零。用微操纵器使电极靠近细胞，当尖端与细胞膜接触时封接电阻指 示r m 会有所上升，将电极稍向下压，细胞膜会出现微微下凹，r m 指示会进一步 上升。当r m 上升幅度达到入水电阻的5 0 左右时，停止下压，并略回拉。通过吮 吸往电极内稍加负压，细胞膜特性良好时r m 一般会快速上升直至形成吉欧封接 ( g i g as e a l ) 。配合着封接电阻的上升，细胞膜的逐步去极化有助于g q 封接的形成。 一般当r m 达到3 0 m q 以上时，可在全细胞记录模式下将钳制电压( vm e m b r a n e ) 1 4 华中科技大学硕士学位论文 由0 m v ，1 0 m v ，2 0 m v ，直至g q 封接时成为一7 0 m v 。 4 ) 单通道和全细胞记录 根据研究的目的的不同，膜片钳记录主要可以分为单通道记录和全细胞记录两 大类【4 9 】，其中单通道记录包括细胞贴附式、内膜外向式和外膜外向式三种， 而全细胞记录又可以分成一般的全细胞记录和穿孔膜片钳记录。细胞贴附式记 录形成后若轻拉电极，使电极局部膜片与细胞体分离而不破坏吉欧封接，便可形成 内膜外向模式；若在细胞贴附式基础上给以短暂的脉冲负压或电刺激打破电极内的 细胞膜，便形成全细胞模式；若在形成细胞贴附式模式后不是将膜吸破而是将电极 内液加入打孔剂【5 0 1 ，便可形成穿孔膜片钳记录。而在全细胞模式下轻拉电极，又可 形成外膜外向模式记录。 本实验主要采用细胞贴附式记录单通道，用给以短暂的脉冲负压打破电极内的 细胞膜记录全细胞电流。 形成吉欧封接后即去除负气压，封接电阻有进一步的升高，大约稳定3 0s 左右 能达到1g q 以上，用快电容补偿将测试波形中的双向峰消除，就形成了细胞贴附 式构型，此种构型下所钳住的小膜片电阻很大，只要封接稳定且细胞具有相对稳定 的静息电位( 不会自发激活和不会因为单个通道的开放而使整个细胞去极化) ，就 可以记录到所钳膜片上的单个离子通道对经由电极施加的刺激电压的响应电流。 电阻与细胞形成稳定的高阻封接后，通过给以短暂的脉冲负压的方式将所钳住的 膜片打破则形成了全细胞构型。在此构型下，电极与细胞之间的串联电阻较小 f 1 1 0 m 1 ) ，故可以用一根电极同时对细胞完成电压钳制和电流记录的工作；全细胞电 流信号大，大大提高了信躁比：同时，此构型下通过对c m 的检测可以研究细胞分泌。 2 3 显微荧光测钙技术 2 3 1f u r a 2 荧光染料测钙的基本原理 实验中，荧光染料f u r a 2 不能自由地通过细胞膜，所以我们采用f u r a 2 a m 衍生 物的形式孵育。f u r a 2 a m ，它可以透过细胞膜，进入细胞胞浆后，能 华中科技大