（纺织化学与染整工程专业论文）l乳酸产生菌选育及发酵优化.pdf

l 一乳酸产生菌选育及发酵优化 摘要 本论文采用紫外诱变和亚硝基胍诱变两种方法，对出发菌株米 根霉3 0 3 8 进行诱变筛选得到一株高产正突变菌株，优化了培养基 和培养条件，并对软质聚氨酯泡沫载体固定化米根霉菌丝体发酵生 产l 乳酸进行了研究。 在诱变育种实验部分，采用溴甲酚绿平板变色圈法筛分出变色 圈大的菌株，然后经液体试管培养，用纸层析法定性测定产乳酸情 况，弃去不产乳酸和产乳酸显著减少的菌株，将初筛所得菌株进行 摇瓶复筛。该初筛方法较准确，且简便、易操作。 将米根霉3 0 3 8 进行紫外诱变，筛选出产酸量最高的一株正突 变菌株，将其命名为米根霉d h 1 。然后将米根霉d h 1 进行亚硝 基胍诱变，筛选出产酸量最高的一株正突变菌株产酸为6 0 5 3 9 m ， 比米根霉3 0 3 8 产酸量提高2 4 3 6 ，将它命名为米根霉d h 1 2 。 培养基及培养条件优化结果为：种子培养基碳源浓度为5 o o ， 氮源浓度为o 2 5 ，种子培养温度3 7 。发酵培养基碳源浓度为 1 3 0 0 ，氮源浓度为0 2 0 ，金属离子f e 2 + 对发酵产酸影响较大， f e s 0 4 7 h 2 0 浓度为o 0 4 ，接种量1 0 ，一次性添加碳酸钙5 0 0 。 本论文采用游离菌丝方式进行种子培养，然后控制发酵培养基 中的软质聚氨酯泡沫载体添加量，形成吸附固定化小菌球与游离菌 体自聚集成小球混合发酵产酸。该方法操作简便，且避免了菌丝缠 结成大的菌丝团，又发挥了固定化菌丝发酵和游离菌丝白聚集形成 小菌球体发酵的双重优点，产酸量得到提高。聚氨酯泡沫载体尺寸 大小以2 m m 3 - 3 m m 3 为宜。按体积百分数计，载体的适宜添加量为 5 4 0 。发酵温度3 0 。c ，摇床转速1 6 0r p m 。 关键词：米根霉，l 乳酸，诱变，固定化，混合发酵 s t r a i ns c r e e n i n ga n df e r m e n t a t l 0 n0 f l l a c t i ca c i d a bs t r a c t i nt h i sp a p e r f i r s t l yt h es e e d si m p r o v e m e n to fr h i z o p u so r y z a e 30 38w a sc a r r i e do u t ，a n dt h e nt h ec u t u r ea n dc u l t u r ec o n d i t i o n so ft h e m u t a n tw e r ei n v e s t i g a t e d ，f i n a l l yt h em i x e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h em u t a n tw e r es t u d i e d b yu s i n gt h eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( u v ) a n dn - m e t h y l n 一n i t r o s o n n i t r o g u a n i d i n e ( n t g ) a st h em u t a t i o na n ds e l e c t i n gt h es t r a i n a c c o r d i n gt oi t si n h e r e n tc h a r a c t e r s ，w eg o tas t r a i no v e r p r o d u c i n gt h e l a c t i c a c i d ，w h o s e l l a c t i ca c i d p r o d u c t i o n w a s 6 0 5 3 9 lb y f e r m e n t a t i o nw i t h o u tc a r r i e r s ，w h i c hw a s2 4 3 6 m o r et h a nt h a to ft h e o r i g i n a lo n e w eg o tt h eo p t i m a ls e e dm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o na n da l s o t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc u l t u r ec o n d i t i o n w e r ed e t e r m i n e d t h eo p t i m a ls e e dc u l t u r ei s ：5 0 0 g l u c o s e ，o 2 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，o 0 6 k h 2 p 0 4 ，o 0 2 m g s 0 4 ，o 0 2 f e s 0 4 7 h 2 0 t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc u l t u r ei s ：13 0 0 g l u c o s e ，o 2 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， 0 0 6 k h 2 p 0 4 ，0 0 2 m g s 0 4 ，0 0 4 f e s 0 4 7 h 2 0 t h eo p t i m u m c o n d i t i o no ff e r m e n t a t i o ni s ：10 0 m lm e d i u mi nt h e5 0 0 m lf l a s k ，t h e o n e - o f fa d d i t i o no fc a c 0 35 ，w i t h10 i n o c u l a t es i z e l - l a c t i ca c i d p r o d u c t i o nb ym i x e df e r m e n t a t i o nw i t hf r e ea n d i m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a eb ys o f tp o l y u r e t h a n ef o a mw a ss t u d i e d t h em e t h o do fm i x e df e r m e n t a t i o ni st h a tt h er h i z o p u so r y z a ec e l l s w a sp r e c u l t u r e dw i t h o u tc a r r i e r sa n dt h e nf e r m e n t e dw i t hs o m es o f t p o l y u r e t h a n e f o a mi nt h ef e r m e n t a t i o n c u l t u r e c o m p a r i n g w i t h f r e e c e l l sf e r m e n t a t i o na n di m m o b i l i z e d f e r m e n t a t i o n ，t h e m i x e d f e r m e n t a t i o nw i t hf r e ea n di m m o b i l i z e dr h i z o p u so r y z a eb ys o f t p o l y u r e t h a n ef o a mh a db o t ha d v a n t a g e so ff r e e c e ll sf e n n e n t a t i o na n d i m m o b i l i z e df e r m e n t a t i o na n ds h o w e dh i g h e rp r o d u c t i v i t y c u ix i a o y i n g ( t e x t i l ec h e m i s t r y d y e i n g a n df i n i s h i n ge n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db yc h e nd e z h a o ， z h a n gx i n g q u n k e y w o r d s ：r h i z o p u so r y z a e ，l l a c t i ca c i d ，m u t a t i o n ，i m m o b i l i z e d ， m i x e df e r m e n t a t i o n 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所早交的学位论文，是本人在导 师的指导下，独立进行研究l ：作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲 白撰写，我对所弓的内容负责，并完全意识剑本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：莅) 羹 日期：j p p6 年j 月3 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学佗论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部i j 或机构送交论文的复印什和电子版，允许论文被杏阅或借阅。本人授权东华 人学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密留，住二l 年解密后适瑚本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名：径d 嵌 日期：二口9 年j 月日 指导教师签名：多锰 日期：淝年，月华日 l 乳陵产生菌选育及发酵优化 1 1 乳酸的性质与用途 1 1 1 乳酸的性质眦】 第一章前言 乳酸学名仅- 羟基丙酸( 2 - 羟基丙酸，2 - h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ，分子式 c 3 h 6 0 3 ，分子量9 0 0 8 。它是一种最简单的羟基酸，具有光学活性。在自然界 中，它存在两种对映异构体( l 乳酸和d 乳酸) 和一种外消旋体( d l 乳酸) ， l 乳酸和d 乳酸的结构式见图1 1 ： h o c o o h c h 3 h h c o o h c h 3 o h l ( + ) l a c t i ca c i dd ( - ) l a c t i ca c i d 图1 - 1 乳酸的同分异构体形式 乳酸通常是纯乳酸与乳酸酐的混合物，为无色或微黄色透明粘稠状液体。 稍有酸味。纯乳酸为无色结晶物质。 乳酸不挥发，无气味，吸湿性强，溶于水、乙醇、乙醚，不溶于氯仿和 二硫化碳。 分子中一个羟基和一个羧基的存在，赋予了乳酸具有这两种官能团的性 质，因此它可以参与许多反应。如：氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化 反应等，构型不同的乳酸可以形成化学及物理性质很不相同的聚合物及其他 衍生物。在脱水剂存在下，两分子乳酸间的羟基和羧基彼此进行酯化，生成 丙交酯。乳酸经温和氧化生成丙酮酸；如经强烈氧化，则发生碳链断裂，生 成乙醛、二氧化碳和水。 第1 贝共5 3 贝 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 表1 1 乳酸的物化和热力学性质 1 1 2 孚l 酸的应用 乳酸及其衍生物广泛应用于食品、医药、化工、皮革、纺织等领域2 培l 。 ( 1 ) 食品行业：主要用于糖果，饮料( 如啤酒、葡萄酒及乳酸类饮料) 等 食品力h - r - 业中，作为酸味剂及口味调节剂，被称为安全的食品添加剂。另外 还可用于清凉饮料、蔬菜的加工和保藏； ( 2 ) 医药行业：在医药方面广泛用作防腐剂、载体剂、助溶剂、药物制剂、 p h 调节剂等。l 乳酸是一种重要的医药中间体，可用作生产l 乳酸钙、 l 一 乳酸钠、l 乳酸锌、l 乳酸亚铁等药物，还可用作手术室、病房、实验室 等场所的消毒剂； ( 3 ) 化妆品行业：可用作滋润剂、保湿剂、皮肤更新剂、p h 调节剂、去粉 刺剂、去齿垢剂； ( 4 ) 农药行业：l 乳酸具有很高的生物活性，对农作物和土壤无毒无害， 可用作生产新型环保农药，在同、美等发达国家已得到大力的推广； 第2 页共5 3 页 l 乳睃产生菌选育及发酵优化 ( 5 ) 纺织、皮革、烟草行业：乳酸可用来处理纤维，可使之易着色，增加 光泽和触感柔软；可使皮革柔软细腻，从而提高皮革的品质；适量加入l 乳 酸，可提高烟草的品质，并保持烟草的湿度； 除上述用途外，l 乳酸最主要的用途是聚合生成聚乳酸，它具有良好的 相容性和可生物降解性，已广泛应用于包装业、医药行业和纺织业。 聚乳酸( p o l y l a c t i ca c i d ) ，简称( p l a ) ，在人体内降解成l 乳酸；在自然界 中，可在微生物作用下，最终变成c 0 2 和水，有利于环保。聚乳酸具有与聚 苯乙烯相似的光泽度和加工性能，还具有优良的生物相容性和生物分解吸收 功能，因此广泛用于生产生物降解塑料、绿色包装材料( 例如购物袋、保鲜膜、 餐盒、桌布、餐巾) 、农用薄膜、抗癌药物、缓释胶囊制剂、手术缝合线等。 聚乳酸纤维强度高，延伸度较大，可用分散染料常压染色，制成的织物光泽 柔和亮丽，抗皱防缩性能好，有吸湿排汗和抗紫外线功能，是近年来研究丌 发的纺织服装新材料。 由于人和动物体内只有代谢l 乳酸的酶，因此若过量摄入d 乳酸或d l 乳酸，会导致多d 一乳酸在血液中积聚，引起疲劳、代谢紊乱甚至酸中毒。 因此，世界卫生组织规定人体每天摄入的d - 乳酸量不能超过1 0 0 m g k g 体重， 且禁止在3 个月以下婴儿食品中添加d 乳酸或d l 乳酸，而对l 哥l 酸则不加 限制。于是近年来l 乳酸的研究与丌发引起了人们的广泛兴趣。特别是在当 今重视环保的绿色浪潮中，用l 哥l j 酸生产的聚乳酸，具有良好的加工性能和 可生物降解性，是理想的生态循环使用的新型高分子材料，用于生产生物降 解塑料和纤维制品，具有广阔的市场日仃景。 1 2 乳酸的生产方法 1 2 1 发酵法 发酵法制备乳酸是以葡萄糖、淀粉等糖类或牛乳等为原料，经微生物( 乳 酸菌或丝状真菌等) 发酵而制得1 1 。 第3 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 1 2 2 化学合成法 化学合成法生产乳酸可通过多种途径进行，其中具有现实意义的是乳腈 法f 6 1 。该法是乙醛与氢氰酸经碱性催化剂作用生成乳腈，这是一个液相反应， 在常压下进行，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为乳酸，还 产生相应的氨基酸副产物，粗乳酸用甲醇酯化得乳酸甲酯，精馏后再水解为 乳酸。 乳酸的其它一些可行的化学合成法还包括醋酸乙酯羰基化法、乙醛羰基 化法、糖的碱性催化水解、丙烯乙二醇氧化、乙二醇的硝酸氧化等8 1 。 1 2 3 酶法生产乳酸 酶法生成乳酸主要有2 氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化两种【1 , 3 1 。日本 东京大学的本崎等人研究了用酶法生产乳酸，他分别从恶臭假单孢菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 和假单孢菌1 1 3 细胞中抽提纯化出l 2 卤代酸脱卤酶( 简称为 l 酶) 和d l 2 卤代酸脱卤酶( 简称为d l 酶) ，使之作用于底物d l 2 氯丙酸， 就可制得l 乳酸或d 乳酸。h u m m e l 等从d 一乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆 菌( l a c c o n f u s u s ) d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到d 乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙 酮酸作底物制得d 乳酸。 1 2 4 乳酸生产方法的比较 化学合成法的缺点是产品为外消旋乳酸即d l 乳酸。另外，由于合成法 所用的原料是乙醛和剧毒物氢氰酸，尽管美国食品和药物管理局( f d a ) 已将合 成法生产的乳酸列为安全品，但许多人还是对其安全性表示担心，加之其生 产成本较高，因而合成法生产乳酸大大受到限制。 酶法生产乳酸虽可以专一性地得到旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到 工业上还有待于进一步研究。 微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得具有立体 箱4 噍r 其5 3 炙 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 专一性的d 哥l 酸或l 乳酸或是两种异构体以一定比例混合的消旋体，以满足 生产聚乳酸的需要。另外发酵法生产乳酸除能以葡萄糖、乳糖等单糖为原料 外，还能以淀粉、纤维素为原料发酵生产乳酸。因此，微生物发酵法生产乳 酸因其原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、安全性高等优点而成 为生产乳酸的重要方法【10 1 。 1 3 发酵产酸机理 发酵法生产l 乳酸，提高收率和质量的关键技术之一是选育出高产率、 高纯度、性能优良的l 乳酸菌种。尤其是生产聚乳酸。据国外报导【8 】1 0 0 l 乳酸产品合成聚乳酸收率最高，纯度9 0 l 乳酸产品则收率大大降低。世界 各国科研人员都在开展高纯度l 乳酸菌种的研究，期望能获得1 0 0 l 乳酸的 产品，以满足聚乳酸生产的需要。 1 3 1 菌种 自然界中可产生l 乳酸的微生物很多，但产酸能力强，可应用到工业上 的只有霉菌中的根霉属( r h i z o p u s ) 及细菌中的乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌 属( s t r e p o t o c o c c u s ) 5 乏芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 中的一些种类u , 8 1 。 根霉属中常用的菌种有米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 、美丽根霉( r h i z o p u s e l e g e n s ) 、小麦曲根霉( r h i z o p u st r i t i c i ) 等。 用根霉生产l 乳酸与乳酸菌相比，根霉对糖转化率低，其理论值为7 5 。 但是，2 0 0 2 年白冬梅】等人对米根霉r 10 21 进行了代谢通量分析并对代谢网络 模型优化计算得出米根霉l ( + ) 乳酸最大理论得率为9 8 2 。使用乳酸菌时， 糖的转化率理论值达1 0 0 ，在实际生产中达9 0 以上。但细菌营养要求复杂， 需多种生长因子，如氨基酸、维生素和无机盐等，而根霉营养要求相对简单， 只需无机氮及少量其他无机盐即可。且根霉具有淀粉糖化能力，可以利用廉 价易得的淀粉质原料如大米、薯干、玉米、高粱、土豆粉等进行乳酸发酵。 第5 爽共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 根霉菌丝体比细菌大，易分离，有利于制得高质量的产品。1 9 11 年，斋藤确 认了根霉所产乳酸为l ( + ) 型【12 1 。细菌发酵常因消旋作用得到的是d l 乳酸， 而根霉发酵很少发现消旋酶的逆转作用，因此易制得高纯度的l 乳酸【8 , 1 3 , 1 4 】。 1 3 2 根霉菌发酵产酸机理【3 】 现已确认，根霉发酵除产乳酸外，还产生乙醇、富马酸、琥珀酸、节果 酸、乙酸等，他们之间的比例随菌种及工艺不同而改变。福井认为，根霉的 糖代谢主要有以下几种反应： ( 1 ) 正常呼吸：c 6 h 1 2 0 6 + 6 0 2 _ 6 c 0 2 + 6 h 2 0 ( 2 ) 富马酸发酵：c 6 h 1 2 0 6 + 3 0 2 _ c 4 h 4 0 4 + 2 c 0 2 + 4 h 2 0 ( 3 ) 酒精发酵：c 6 h 1 2 0 6 _ 2 c 2 h 6 0 h + 2 c 0 2 ( 4 ) 乳酸发酵：c 6 h 1 2 0 6 _ 2 c 3 h 6 0 3 ( 5 ) 同化作用( 生成菌体) ：干菌体量的9 5 来自碳水化合物。 如果抑制( 1 ) 、( 2 ) 和( 3 ) 反应，乳酸收率就有可能增加。 发酵过程中，供氧充足可促进根霉产生乳酸，而在通气不良或厌气状况 下，乳酸产量明显下降，乙醇产量显著增加。经实验证明，消耗葡萄糖与所 产生的乳酸、乙醇克分子之比几乎是l ：1 ：l ，此时的反应式为： c 6 h 1 2 0 6 _ c 3 h 6 0 3 + c 0 2 当进行好气发酵时，乳酸产量明显增加，据w a k s m a n 与f o s t e r 的研究。提 出如下反应式： 2c 6 h 1 2 0 6 _ 2c 3 h 6 0 3 + c 2 h 6 0 h + c 0 2 此时乳酸对糖的理论转化率为7 5 ，与乳酸菌的同型乳酸发酵相近。 1 4 微生物的诱变育种【1 6 ，1 7 】 工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，是决定该发酵产品 能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。工业微生物育种对于提高 第6 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 发酵工业产品的产量和质量，具有重大意义。 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，根据遗传学基础理 论和方法人为引起菌种遗传变异的诱变育种，以及杂交育种、原生质融合和 基因工程等技术。 当前发酵工业中使用的各种优良高产菌株，绝大部分都是通过诱变育种 而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产 品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和 收效显著等特点。目前仍是广泛使用的主要育种方法之一。 因此，本论文研究采用诱变剂对菌种进行诱变育种的方法对原有能够产 生l 乳酸的米根霉菌株进行改造，达到提高产量和改善产品质量的目的。 1 4 1 菌种诱变的生物学原理 生物的性状是由遗传物质决定的。d n a 作为遗传物质有三个功能：一是 通过复制将遗传信息由亲代传递到子代；二是通过转录使遗传信息在子代得 以表达；三是通过变异在自然选择过程中获得新的遗传信息。变异是d n a 的 核苷酸序列改变的结果，它包括由于d n a 损伤和错配得不到修复引起的突 变，以及由于不同d n a 分子之间的减缓而引起的遗传重组。 在自然条件下发生的突变称为自发突变。自发突变的突变率非常低，在 1 0 。1 0 左右。能够提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂。物理的诱变剂包 括紫外线、电离辐射和激光等物理因素。紫外线的高能量可以使相邻嘧啶之 间双键打开形成二聚体，造成d n a 异常状态，影响d n a 复制而引起突变。 电离辐射的作用比较复杂，除射线直接效应外还可以通过水在电离时所形成 的自由基起作用。大剂量照射时，还会出现碱基的破坏。某些化学诱变剂通 过对d n a 碱基的修饰作用而改变其配对性质。亚硝酸能脱去碱基上的氨基。 烷化剂能够使d n a 碱基上的氮原子烷基化引起分子电荷分布的变化而改变 碱基配对的性质。亚硝基胍在适宜条件下可使大肠杆菌每一个细胞发生一个 第7 页共5 3 页 l 一乳酸产生菌选育及发酵优化 以上的突变，典型的变化是在d n a 复制叉部位出现多个紧相靠近的一簇突 变。一次控制加入亚硝基胍的时间和剂量可选择性地使细胞d n a 特殊片段发 生突变。 1 4 2 诱变剂 在人工的物理或化学诱变因素作用下，菌株的突变率得以大大提高，有 利性状的突变株被筛选到的可能性大大增强。 物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、x 射线、y 射线、激光和快中子等 都是常用的诱变剂。化学诱变剂的种类很多。根据其作用方式的不同分为三 类：一是可以与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，此类主要有烷化剂、亚硝 酸和羟胺等。二是一些碱基类似物。它们与碱基的结构类似，在d n a 复制时， 它们可以被错误的掺入d n a ，引起诱变效应。三是具有移码突变能力的突变 剂。移码突变是指由一种诱变剂引起d n a 分子中的一个或少数几个核苷酸的 插入或缺失。从而使该部分后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类 突变。亚啶类化合物属于这一类的诱变剂。 物理诱变中的紫外线诱变具有操作简单，效果比较良好的特点。成为众 多微生物诱变的首选的物理诱变方法。化学诱变剂中亚硝基胍具有诱变剂之 王的美誉，对于微生物具有很好的诱变的效果。 结合本试验室的条件和本次菌种选育研究的特点，选择了紫外线诱变和 亚硝基胍诱变方法。下面就两种诱变方法的特点和操作进行说明。 ( 1 ) 紫外线辐射 紫外线辐射是物理诱变因子中较有效、较普遍的方法之一。紫外线的波 长在2 0 0 , - - 一3 8 0 n m 之间，但是对诱变最有效的波长仅仅是2 5 3 2 6 5 n m ，一般紫 外线杀菌灯所发射的紫外线大约有8 0 是2 5 4 n m 。紫外线照射后的最主要效 应是导致d n a 形成嘧啶二聚体，而在可见光作用下的光复活作用，又可专一 的修复由紫外线导致的d n a 嘧啶二聚体，催化此修复过程的酶是光复活酶 笫8 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 ( p h o t o r e a c t i v a t i n ge n z y m e ) 或d n a 光解酶( p h o t o l y a s e ) 。为了避免光复活，紫外 线照射过程在暗室内进行，经照射后的样品必须用黑纸或者黑布包裹。 ( 2 ) 亚硝基胍( n t g ) 诱变 n t g 是最有效、也是用得最广泛的化学诱变剂之一。依靠n t g 诱发的突 变主要是g ：c - - - + a ：t 转换，另外还有小范围切除、移码突变及g ：c 对的缺失。 在自然条件下n t g 容易分解，而在酸性( p h 8 0 ) 条件下，n t g 会形成重氮甲烷( c h 2 n 2 ) ， 对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液p h 为6 0 时，n t g 本身和d n a 起烷化反应而导致突变。通常在p h 6 0 的条件下进行诱变处理。由于酸碱条 件影响n t g 的诱变效果，因此，无论是配制n t g 溶液，还是制备菌悬液都 要用适宜的缓冲体系。一般采用磷酸盐的缓冲液作为反应体系。微生物孢子 或菌丝体在亚硝基胍溶液中反应一定的时间，用稀释的方法来终止反应，涂 布平板。在一定特殊设计的培养基中生长，经过筛选可以得到需要的微生物 菌种。 1 4 3 诱变处理方式 诱变剂的处理方式，可分为单因子处理和复合因子处理。 单因子处理，是采用单一诱变剂处理。一般单因子处理突变率比复合因 子低，突变类型也较少。 复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。各种诱变因子 的作用机制不一样，主要是d n a 分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收阈 值有较大差异，即不同诱变剂对基因作用位点有其一定的专一性，有的甚至 具有特异性。因此，多因子复合处理，可以取长补短，动摇d n a 分子上多种 基因的遗传稳定性，以弥补某种不亲和性或热点饱和现象，容易得到更多突 变类型。因此，本论文采用紫外线和亚硝基胍复合诱变的处理方式进行诱变 育种。 第9 ! j ：( 共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 1 4 4 诱变育种的基本过程 ( 1 ) 菌种活化 用于进行育种处理的起始菌株称为出发菌株。选取合适的出发菌株是诱 变育种成败的关键之一。出发菌株选取的首要标准是看其是否具有产生特定 产品的能力或生产潜力。 ( 2 ) 制备菌悬液 在微生物诱变操作中，菌体均一性是保证诱变剂和每个细胞充分接触， 从而提高诱变效果的关键。为了避免细胞团的出现，可以用玻璃珠振荡打散 细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤的，得到分散的菌体。对于产生孢子或芽 孢的微生物最好采用孢子或芽孢。本课题采用米根霉菌作为诱变出发菌株， 米根霉是一种产生孢子的菌体。在诱变过程中，选择新鲜的孢子，玻璃珠振 荡，过滤，得到单孢子悬浮液。 ( 3 ) 诱变处理 诱变剂的使用种类在很大程度上还是依靠经验来选择。不同的诱变剂诱 变的机理和作用的效果不同。衡量诱变剂的作用效果的指标应该是一个综合 的指标。仅以诱变剂的剂量或是浓度、作用时间作为诱变的指标，会产生偏 差，不利于重复的操作。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对于诱变 剂的敏感程度不同。在诱变处理前，应该预先做诱变剂用量对菌体致死数量 的致死曲线。选择合适的操作方法和诱变剂的剂量。就一般的微生物而言， 突变率随剂量的增加而增高，但是达到一定剂量后，再加大突变剂的剂量反 而会使突变率下降。人们对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为高 剂量诱变效果较为理想，即：导致菌体致死率在9 0 - - 9 9 9 时的剂量。在这 个剂量下，能够获得较高的f 突变率。有人认为在低致死率( 7 0 - - - - 8 0 ) 能 够提高正突变率，而负突变率出现在高的剂量中。对于这些不同的说法，应 该用实验的方法来验证，不同的微生物诱变的效果不同。由于本试验中所选 用的微生物是米根霉，属于丝状菌，其菌丝体非常发达，为了以单菌落形成 第1 0 页共5 3 页 l 乳睃产生菌选育及发酵优化 的变色圈来初步筛分出高产菌株，本实验以诱变后一平皿中存活的单菌落区 分明显但又不是太少来选择合适的诱变剂剂量。 ( 4 ) 菌种筛选 筛选方法要求快速、简便，具有一个明显的特征来区分变异株。按照这 种要求建立的筛选方法有菌体形态方法、平板快速检验法。平板快速检验法 是将肉眼看不到的微生物的性状转变为可见的“形态”变化。包括显色法、 变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。这些方法一般只能定性或半 定量用，常用于初筛。用于复筛的比较精确的方法一般采用摇瓶培养法，摇 瓶的培养条件和与发酵罐的条件较为接近，在一定程度上能够反映实际情况。 1 5 微生物的营养【1 6 - 2 0 1 5 1 微生物的营养元素 营养是指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质，以 满足f 常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。要对微生物进行有效的 培养就需要对微生物的营养有比较深刻的理解。 1 5 1 1 常量营养元素 ( 1 ) 碳源 碳素是细胞有机物质的组成成分，构成细菌和真菌干重的5 0 左右，通 常用作能源。任何微生物细胞均需要能源，用以转化成细胞合成及其它生命 活动中可以直接使用的代谢能。微生物可利用的含碳化合物很多，而葡萄糖 则是配制微生物生长培养基最普通的选择。合适的碳源还包括碳水化合物的 衍生物、脂肪酸、醇、有机酸、烃和有机含氮化合物，它们的选用与否取决 于所研究的微生物对营养物质的代谢性能。 ( 2 ) 氮源 氮素是微生物细胞蛋白质、核酸和辅酶的组成成分，构成细菌和真菌干 重的8 - - 1 4 。微生物可利用的氮源很广泛，如：硝酸盐、铵盐、尿素、胺、 第11 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 酰胺、嘌呤碱、嘧啶碱、氨基酸、蛋白质等。实验室中常用的蛋白胨、牛肉 膏、酵母膏等作为氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、鱼 粉、等原料作氮源。 ( 3 ) 磷 磷素是核酸、磷脂、核苷酸和某些辅酸的组成成分。就微生物的营养而 言，无机的p 0 4 3 - 通常是磷元素的来源，如k 2 h p 0 4 、k h 2 p 0 4 、n a i l 2 p 0 4 等。 r n a 中含有大量的磷元素，微生物对磷元素的需求随比生长速率增加而增加。 在许多微生物工业过程中，磷是一个非常关键的元素，因为它影响许多次生 代谢物的形成。p 0 4 3 还是糖代谢和脂代谢的重要调节因子。它调节许多具有 重要商业价值的有机酸( 如柠檬酸) 的产生和分泌。磷酸盐的缺乏可引起几 种代谢的混乱，尤其是葡萄糖利用速率的降低。 ( 4 ) 钾 钾是细胞中重要的无机阳离子。细胞中的相当一部分钾被束缚在原核生 物的核糖体中，钾也是一些酶的辅助因子，是糖代谢所需要的，并且参与许 多输送过程。通常加入无机钾盐( 例如k 2 s 0 4 ，k 2 h p 0 4 或k h p 0 4 ) 来满足细 胞对钾的需求。 ( 5 ) 镁 细菌和真菌的核糖体对镁有特殊要求。镁是许多酶的辅助因子，存在于 细胞壁和细胞膜中。通常用m g s 0 4 7 h 2 0 提供镁。 1 5 1 2 微量营养元素 ( 1 ) 铁、锌 铁是细胞色素和铁氧还原蛋白的重要组成成分，也是微生物细胞内过氧 化氢酶、过氧化物酶的组成元素。此外，铁是次级代谢调节中重要微量元素 之一，对初级代谢产物的分泌也起重要作用。锌是许多真菌酶的功能性组份， 如：乙酸脱氢酶中含有4 个z n ，用c o 代替z n ，结果酶活性降低8 3 。 ( 2 ) 钙 在真菌培养基中一般要加入钙盐，特别是低等真菌的生长过程对钙的需 第1 2 顶其5 3 页 l 碍l 酸产生菌选育及发酵优化 求比较明显。一般来讲，钙能够促进孢子囊的形成。钙也是许多细胞结构的 组分。在真菌的孢子囊、配子囊以及结合孢子中都发现有以草酸钙晶体存在 的钙，结合孢子中的晶体是与细胞壁紧密结合的，有些时候覆盖在细胞壁上。 钙存在于细菌的芽孢，并且是a 淀粉酶和许多蛋白酶的辅助因子。钙通常被 从细胞质中逐出，但能在细胞壁、蛋白质和胞外聚合物的结构方面起重要作 用。 1 5 2 培养基的选择原则 1 5 2 1 选择适宜的营养物质 根据微生物的营养要求，选择适宜的营养物质制备培养基以满足微生物 的营养需求。 1 5 2 2 营养物质的浓度及配比合适 培养基中合适的营养物质浓度是微生物良好生长的必要条件，营养物质 浓度过低时不能满足微生物生长；营养物质浓度过高则可能抑制微生物生长， 例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进徽生物生 长反而起到抑菌和杀菌的作用。另外培养基中各种营养物质的浓度比也直接 影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比的影响最大。 1 5 2 3 控带j j p h 值条件 培养基的p h 必须控制在一定的范围内，以满足不同类型徽生物的生长繁 殖或产生代谢产物的需要，各类微生物的生长繁贿和产生代谢产物的最适p h 条件各不相同。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养 物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基p h 值发生变化，若 不对培养基p h 条件进行控制，往往导致微生物生长速率下降和代谢产物产量 下降，因此为了维持培养基的p h 值相对稳定，通常在培养基中加入缓冲溶液 或难溶盐来进行调节。 1 5 2 4 控制氧化还原电位 不同微生物生长对氧化还原电位的要求不一样，一般好氧微生物比厌氧 微生物的氧化还原电位高。氧化还原电位与氧分压s n p h 值有关，也受代谢产 第1 3 页共5 3 页 l 哥l 酸产生菌选育及发酵优化 物的影响，在p h 一定的条件通过增加通气量( 如震荡或搅拌) 提高培养基的氧 分压，或加入氧化剂，增加氧化还原电位。 1 6 微生物发酵【1 8 。2 2 】 发酵条件的优化包括对温度、通气量、以及培养基系统的p h 值的确定。 ( 1 ) 温度 温度对微生物的影响很大，因为微生物的生长发育是一个极其复杂的生 物化学反应，这种反应需要在一定的温度范围内进行，所以温度对微生物的 整个生命过程都有着极其重要的影响。 一般来说，微生物只有在最适温度下爿4 能充分生长，而它对低温的敏感 度没有对高温敏感度那样显著。在最低生长温度仅停止生长，并不死亡；而 在最高温度以上，微生物不但停止生长，还会引起死亡。 ( 2 ) 通风量 对于好氧性微生物，它在生长过程中需要氧气，因为氧作为呼吸过程中 的最终受氢体，只有在分子氧存在的条件下，它们才能正常生活，大多数微 生物都属于这种类型。在微生物的深层培养中，通气量不但影响微生物的生 长，还影响微生物的代谢产物。 ( 3 ) p h 值 培养基中的p h 值与微生物的生命活动有着密切关系，它的影响是多方 面的。在不同的p h 生长环境中，微生物的代谢途径不同，所最终所生产的产 品也将不同。发酵过程中控制发酵液的p h 值是控制生产的指标之一，p h 值 过高或过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。 第1 4 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 1 7 本课题的提出及主要研究内容 1 7 1 本课题的提出 乳酸是有着广泛用途的有机酸，主要在食品工业用作酸味剂和防腐剂， 同时也是医药、化工、皮革、香料等工业的重要原料。乳酸分子中具有一个 不对称c 原子，存在两种对映异构体( l 乳酸和d 乳酸) 和一种外消旋体( d l 乳 酸) 。由于人体只能利用l 哥l 酸，故世界卫生组织( w h o ) 规定，人体每天摄入 d - 乳酸的量限制在1 0 0 m g k g 下，而l 乳酸不加限制。另外，用于生产可降解 高分子材料聚乳酸的单体也需要较高纯度的单一异构体l 乳酸。因此，研究 提高乳酸产品中l 乳酸光学纯度有着重要的意义。 乳酸主要通过化学合成法和微生物发酵法制得，化学合成法和大多数的 乳酸菌发酵法得到的是消旋乳酸，而目f j 应用较多的米根霉发酵法可以得到 较高纯度的l 乳酸。虽然已有许多学者【2 3 确】对米根霉发酵法生产l 乳酸进行 了大量的研究，但是不可否认在菌种生产能力和发酵方法方面还存在一定的 不足，为此有必要对米根霉发酵法生产l 乳酸作进一步的研究。 因此，本论文主要对生产l 乳酸的米根霉菌株进行诱变选育，以提高其 生产能力和改善其生产性能，并对固定化米根霉发酵生产l 乳酸进行一系列 的研究。重点研究菌种的紫外诱变和亚硝基胍诱变选育、高产突变株培养基 及培养条件优化、以聚氨酯泡沫为固定化载体发酵生产l 乳酸的种子培养及 发酵培养方式。 1 7 2 主要研究内容 本论文研究的主要内容包括以下三部分： 1 利用紫外诱变和亚硝基胍诱变筛选出高产菌株。 2 诱变筛选出的高产菌株的培养基优化。主要是优化种子培养基、种子培 养条件和发酵培养基。 第1 5 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 3 对吸附固定化与游离菌体自聚集成小球混合发酵进行初步研究。着重研 究不同种子培养方式和发酵培养方式对根霉乳酸发酵过程中的存在形态的影 响，以及发酵过程中根霉存在形态对产酸的影响。 1 7 3 本论文研究思路 出发菌株一斜面孢子培养一制备孢子悬液一紫外诱 变处理一平板初筛一摇瓶复筛一正突变株一制备 孢子悬液一亚硝基胍( n t g ) 诱变处理_ 平板初筛一摇瓶 复筛一正突变高产菌株一培养基优化一发酵研究 第1 6 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 2 1 引言 第二章米根霉l 乳酸产生菌的诱变选育 2 1 1 诱变育种试验设计的理论基础6 ，1 7 】 2 1 1 1 出发菌株 根霉是真核微生物，属于真菌门，接合菌亚门，藻状菌纲，霉菌类，毛 霉目，根霉属( r h i z o p u s ) 。其菌丝蔓延成网状，有发达的基质菌丝与气生菌丝， 气生菌丝白色、蓬松、如棉花状。有营养菌丝产生弧形匍伏菌丝，由形匍伏 菌丝产生假根，假根起固定作用并能吸收养分。 米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 发育温度为3 0 。c 至3 5 。c ，最适宜温度为3 7 。c ， 4 1 时不能生长。 2 1 1 2 单孢子( 或单细胞) 悬液的制备 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。因为分 散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。产孢子的菌 类进行诱变，处理的材料是孢子，而不是菌丝，因为孢子一般是单核的，菌 丝是多核的。所以制备菌悬液时，采耿分散法，使孢子团块在悬浮液中充分 分散。 2 。1 1 3 诱变剂量的选择 诱变剂量大小一般以致死率和变异率来确定。诱变剂对产量性状的诱变 作用趋向大致为：处理剂量大，杀菌率高，在单位存活细胞中负变菌株多， 正变菌株少。但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。诱变 处理中剂量大小的控制：物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过程 中的条件( 氧、水等) ，以达到最佳的诱变效果：化学诱变剂主要是调节浓度、 处理时间和处理条件( 温度、p h 值等) 。 第1 7 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 2 1 1 4 突变株的分离与筛选 微生物通过诱变因子处理，群体中产生各种类型突变体，其中有j f 突变 型、负突变型和稳定型，需要经过分离筛选，逐个地挑选出来。 筛选根据主次分为初筛和复筛。初筛以多为主，即大量挑选诱变处理后 平板分离的菌落，尽量扩大筛选范围。复筛以质和精为主，即把初筛获得的 少量较优良的菌株，进一步筛选，最后选育出高产或其他优良菌株。 本论文研究采用平板变色圈法初筛后，然后经液体试管培养，用纸层析 法定性测定产乳酸情况，弃去不产乳酸和产乳酸显著减少的菌株，被挑选的 菌落移入试管斜面，然后再进行摇瓶液体培养复筛，逐步筛选出高产菌株。 2 1 2 诱变育种试验设计方案 诱变育种的基本过程如下： 第一轮：出发菌株一斜面孢子培养一制备孢子悬液 一紫外诱变处理一初筛一摇瓶复筛一斜面保藏 第二轮：紫外诱变后选出的菌株一制备孢子悬液一亚硝基 胍( n t g ) 诱变剂处理一初筛一摇瓶复筛一遗传稳定性实 验一斜面保藏 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 3 0 3 8 ，购自中国工业微生物菌种保藏中一0 , ( c i c c ) 。 2 2 2 主要试剂与仪器 2 2 2 1 主要试剂 第1 8 贞共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 2 2 2 2 主要仪器 第1 9 页共5 3 页 l 乳酸产生菌选育及发酵优化 仪器名称 型号生产单位 电子天平 生化培养箱 立式压力蒸汽灭菌锅 回转式恒温调速摇床 精密p h 计 恒温磁力搅拌器 移液枪及枪头 冰箱 水浴锅 显微镜 紫外灯 超净台工作台 血球计数板 j y 一2 u z s p x 1 5 0 b 上海博迅实业有限公司 y x q l s 5 0 s i 上海博迅实业有限公司 y p w - 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