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摘要 静电纺丝法制备壳聚糖纳米纤维及其性能研究 摘要 静电纺丝技术制备出的纤维膜具有纤维直径小、比表面积大的特点， 更有利于细胞的粘附和增殖，是理想的组织工程支架材料。近年来，对静 电纺丝装置的改进使静电纺丝技术得到了迅速发展，同轴静电纺丝就是其 中种。核壳结构电纺丝可以在内层负载某些药物和生物活性因子，作 为药物缓释载体及组织工程支架。壳聚糖是一种具有良好的生物相容性和 生物可降解性的天然高分子，而羟基磷灰石是天然骨的主要成分，具有骨 传导性和诱导性，两者在组织工程领域应用很广泛。 本文利用静电纺丝技术制备壳聚糖羟基磷灰石复合纳米纤维膜，羟 基磷灰石通过共混和原位矿化沉积的方法被负载于壳聚糖纤维内部或表 面。研究发现采用共混方法时，随着羟基磷灰石含量增多，纤维的直径也 随之增大，羟基磷灰石的加入增加了纤维膜的刚性，但是更高含量的羟基 磷灰石会导致纳米颗粒在纤维中的团聚，材料会在羟基磷灰石和聚合物分 界面发生断裂。羧乙基壳聚糖电纺丝膜的方法经1 8 小时原位矿化后可以 在纤维表面观察到分布均匀的矿物质，随着矿化时间的增加，纤维表面的 矿物晶体增长，经过2 5 天后成为直径4 0 n m 针状晶体聚集体。细胞毒性 实验( m t t 法) 表明壳聚糖羟基磷灰石纤维对小鼠成纤维细胞( l 9 2 9 ) 没有毒性，细胞在纺丝支架上培育4 8 h 后观察发现l 9 2 9 与纤维膜粘附紧 密，生长状况良好。 北京化工大学硕十学位论文 通过同轴静电纺丝技术成功制备出核壳双层结构的壳聚糖聚乙烯 醇聚碳酸亚丙酯电纺丝纤维。外层聚酯溶液采用氯仿n ，n 二甲基甲酰 胺( 1 1 ) 复配溶剂可以有效的避免聚合物溶液在喷丝口处的凝结现象。同单 纺纤维相比，核壳结构的纤维直径分布较宽，在透射电镜下纤维壳层和核 层界限清晰。最后为了改善壳聚糖纺丝纤维的耐水性，将光交联剂聚乙二 醇( 6 0 0 ) 双甲基丙烯酸酯和光引发剂2 羟基2 甲基1 对羟乙基醚基苯基丙 酮引入壳聚糖聚乙烯醇纺丝液中，制得电纺丝膜在紫外光下进行交联。 结果表明经过光交联的电纺丝纤维在浸水后仍能够保持基本的纤维形貌， 并且随着交联剂的增加，纤维的形貌及电纺丝膜的多孔特征保持的越好。 当交联剂含量为2 0 叭时，溶胀率降低到未光交联的壳聚糖纳米纤维膜的 半，而进一步增加光交联剂含量达5 0 w t 时，溶胀率的值只达到未光交 联的电纺丝膜的1 8 。 关键词：静电纺丝，壳聚糖，羟基磷灰石，核一壳结构，光交联，生物相 容性 a b s t r a c t p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fc h i t o s a n e l e c t r o s p i n n i n gf i b e r s a b s t r a c t t h en a n o 助r o u sp r e p a r e d b ye l e c 仃o s p i l l n i n gh a dd r a w ng r e a ti n t e r e s ti n m u l t i p l eb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n sb e c a u s eo ft h e i rp r o p e n i e sa r eu n i q u ew h e n c o m p a r e dw i t h f i b e r p r o d u c e db yc o n v e n t i o n a l m e t h o d s ， s u c ha sl a r g e r s p e c i f i cs u r f a c ea r e a sa n ds m a l l e rp o r e s i th a db e e ns u g g e s t e dm a tv e 巧h i 曲 s u r f a c ea r e a t o v o l u m er a t i oa n dh i g hp o r o s i t yc a nb ea c h i e v e df o rb e t t e rc e u j n c o m o r a t i o na n dd e r m s i o n c o a x i a le l e c t r o s p i i u l i n gw o u l dp r o v i d ea n m c o r d o r a t l o na n dp e r f u s l o n u o a x l a ie l e c t r o s p l i u l m gw o u l qp i 。o v l 【l e m 1 a l t e m a t i v ea n ds i m p l em e t h o dt oe n c a p s u l a t ed r u g st od e l i v e rab i o m o l e c u l a r d r u gi nas u s t a i n e df a s h i o n c h i t o s a n ( c s ) w a st h es e c o n dm o s ta b u n d a n t n a t u r a lp o l y s a c c h 撕d ei nt h ew o r l d i tw a sw i d e l ys t u d i e db e c a u s eo fi t s b i 0 1 0 9 i c a lp r o p e m e s ，s u c ha sb i o d e g r a d a b i l i 吼b i o a c t i v 埘a n da n t i b a c t e r i a l p r o p e n i e s h y d r o x y 印a t i t e ( h a p ) w a st h ec l i n i c a l l ye s t a b l i s h e dm a t e r i a lf o r t h e r e p a i r a n dr e c o n s t r u c t i o no fh a r dt i s s u e s b e c a u s eo fi t si n l l e r e n t o s t e o c o n d u c t i v eb e h a v i o ra n di t sa b i l i t yt oi n t e g r a t ew i t hb o n e i nt h i st h e s i s ，n a n o f i b r o u sb i o c o r n p o s i t es c a f - f o l d so fc h i t o s a n ，p 0 1 y ( v i n y l a l c o h 0 1 ) ( p v a ) a n dh y d r o x y 印a t i t e ( h a p ) w e r ep r 印a r e db ye l e c t r o s p i n n i n g m 北京化工大学硕十学位论文 t h ef i b e rd i a m e t e ra n dt e n s i l es t r e n g t hi n c r e a s e dw i ma ni n c r e a s ei nn a n o h a p c o n t e n t t h ei n c r e a s ei nt e n s i l es t r e n 百hm a yb ea t t r i b u t e dt oa ni n c r e a s ei n r i g i d i t y ，b e c a u s eh a pi st y p i c a lo fh a r di n o 娼a n i cp h a s e s h i g h e rp e i e n t a g e l o a d i n go fh a pm i g h th a v er e s u l t e di ni n t e g r a t i n go ft h en a n o h a pp o w d e ri n t h ec s p v am a t r i x ，b e c a u s ef a i l u r eo ft h ec o m p o s i t em a t e r i a l su s u a l l yo c c u r s a tt h e i n t e r f a c eo ft h ep o l y m e ra n dt h eh a p f u r t h e m o r e ，h a pw i t h n c a 而o x y e t h y l c h i t o s a n ( c e c s ) p v a s c a f f 0 1 d sw a so b t a i n e dv i a a m i n e r a l i z a t i o nm e t h o dw i t he l e c t r o s p u nn a n o f i b r o u sc e c s p v as c a f f 0 1 d sa s a no 玛a n i cm a t r i x t h e 锄o u n to fm i n e r a lp h a s ei n c r e a s e dw i t hi n c r e a s eo f i n c u b a t i o nt i m e ，w h e r e b yac o n t i i m o u sm i n e r a ll a y e rw a sf o 珊e do nt h e s c a f - f o l ds u r f i a c ea r e r2 5d a y s c e uc u l t u r es e mi m a g i n gs h o w e dt h a tt h e m o u s ef i b r o b l a s t ( l 9 2 9 ) g r e wo nm es u r f a c eo fn a n o f i b r o u ss t m c t u r e ，a n dt h e c e l lm o 印h o l o g ya n dv i a b i l i t yw e r em a i n t a i n e d c o r e s h e ns t r u c t l l r e dc h i t o s a p v a p o l y ( p r o p y l e n ec a r b o n a t e ) ( p p c ) f i b e r sw e r ep r e p a r e db yc o a 撕a le l e c t r o s p i n n i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e u s eo fc h l o r o f o m 佃m f ( 1 1 ) m i x e ds o l v e n t sc o u l da v o i da g g l o m e r a t i o no f p o l y l n e ra t t h e c a p i l l a l yt i pd u r i n g c o a x i a le l e c t r o s p i n n i n gp r o c e s s ，a n d c o n t 曲u t e dt og o o dm o 印h o l o g y t h es e ma n dt e mo b s e r v a t i o ni n d i c a t e d t h a tt h ed i a m e t e ro ft h ec s p v a ( c o r e ) 一p p c ( s h e l l ) f i b e r s 锄o u n t e dt oa b o u t 3o o n m ，w h e r e a st h ed i a m e t e ro fm ec o r er e g i o nw a sa b o u t6 0 n m t h e c o r e s h e l ls t m c t u r ec o u l dc l e a r l yb e e ns e e nw i t has h a 印i n t e 而c eb e 呐e e nt h e c o r ea n ds h e uf i b e r t oi m p r o v et h ew a t e rr e s i s t a i l c eo fc s - b a s e dn a n o f i b e r s i v a b s t r a c t t h ee l e c t r o s p u nf i b e r s ( c s p v a ) w e r ec r o s s l i n k e db yt h e i n c o 印o r a t i o no f p h o t o c r o s s l i n k i n ga g e n tp o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) 一6 0 0 - d i m e t h a c 巧l a t e ( p e g d m a ) a n d p h o t o i n i t i a t o r 2 - h y d r o x y - l - 4 - ( 2 h y d r o x y e t h o x y ) p h e n y l 】2 一m e t h y l 1 p r o p a n o n e ( h e p k ) i n t ot h es p i i l i l i n gs o l u t i o n sa n das u b s e q u e n ti m d i a t i o nb y u vl i g h t t h ew a t e rr e s i s t a n c eo fp h o t o c r o s s l i n k e dc s b a s e dn a n o f i b e r sw a s i m p r o v e do b v i o u s l ya n dt h es w e l l i n gr a t i od e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g c o n t e mo fp e g d m a h e p k m e nm ec o n c e n t r a t i o no fc r o s s l i n l ( i n ga g e n t w a s2 0 w c ，m es w e l l i n gr a t i ov a l u ed e c r e a s e dt oh a l fo ft h a ti nn o n e c r o s s l i n k i n gc s p v an a n o f i b e rm e i i 】【b r a n e s ，如r t h e ri n c r e a s ec o n c e n t r a t i o no f c r o s s l i l l l ( i n ga g e n tt o5 0 、v t ，t h es w e l l i n gr a t i ov a l u ew a so n ee i g h t ho ft h e n o n ec r o s s l i i 止i n gc s p v an a n o f i b e rm e m b 啪e s k e y w o r d s ：e l c t r o s p i i u l i n g ，c h i t o s a n ，h y d r o x y a p a t i t e ，c o r e - s h e ns t r u c t u r e ， p h o t o - c r o s s l i n k n g ，b i o c o m p a t i b i l i t y v 符号说明 c s p v a p p c h a p c h c l 3 d m f p e g d m a h e p k f t i r s e m x r d t e m d s c t g m t t l 9 2 9 p a s w t m w c i n 2 符号说明 壳聚糖 聚乙烯醇 聚碳酸亚丙酯 羟基磷灰石 氯仿 n ，n 二甲基甲酰胺 聚乙二醇( 6 0 0 ) 双甲基丙烯酸酯 2 羟基一2 一甲基一1 一对羟乙基 醚基苯基丙酮 红外光谱仪 扫描电子显微镜 x 射线衍射仪 透射电子显微镜 差热扫描量热仪 玻璃化转变温度 四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法 小鼠结缔组织成纤维细胞 帕秒 质量分数 光强 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：叠圭至 日期： 。g 本6 问2 目 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：堑垒垂日期：2 殳旦堡至垒日兰叠二作者签名：验鱼鱼日期：2 殳旦堇生鱼爿兰壁二 导师签名：丝坠日期：五盟立：兰 第一章绪论 1 1 静电纺丝技术 第一章绪论 静电纤维制造是目前得到纳米纤维最重要的基本方法之一。这一技术的核心， 是使带电荷的高分子溶液或熔体在静电场中流动与变形，经溶剂蒸发或熔体冷却而固 化得到纤维状物质，因而这一过程又称为静电纺丝，简称电纺【l 】。电纺最早出现于1 9 3 4 年，f o m l l l a l s 在一篇专利中首次介绍了利用静电斥力获得聚合物纤丝的方法【2 】。2 0 世纪8 0 年代后，尤其是9 0 年代中期以来，随着纳米技术的快速发展，电纺丝技术越 来越引起人们的关注，静电纺丝的理论研究才。有了进一步的深入发展。 1 1 1 静电纺丝的原理和纺丝工艺 图l 所示就是静电纺丝的基本装置图，该装置基本上由三部分组成：一个高压静 电发生器，一个顶部带有小孔的装有聚合物溶液或熔体的细管及一个金属收集屏。聚 合物的熔体或溶液的输送速度可由空气压力、微量注射泵控制，也可通过把装有液体 的储液管与水平成一定角度放置从而由聚合物本身的重力来控制。高压电场的两极分 别与聚合物液体、收集装置相连。在静电纺丝中，常常通过插入聚合物液体中的金属 丝，或通过毛细管出口处与聚合物液体相连的金属夹，使聚合物液体接上高压电；收 集装置通常为接地的金属箔、金属网或转鼓【4 5 】。 ，羔淼吲夸 ；j 。，m e r o l u ： o n j，。， r 一磊鬟7砖务 嗥裟关篙。 ： l ”r 辫“宅t 秘j 譬蓼? ：，：i ) ? 3 o h - n h 2 。在碱性条件下，壳聚糖可与环氧乙烷和环氧丙烷直接反 应，得到的是n ，o 位取代的衍生物酬。通常，羟基化壳聚糖衍生物具有水溶性，也 1 2 第一章绪论 有良好的生物相容性。 壳聚糖的m i c h a e l 加成反应作为一种壳聚糖化学改性新方法，可以用来解决壳聚 糖在水中溶解性问题。m i c h a e l 反应是在碱性催化下，具有活性亚甲基的化合物与含 有活性双键和活性叁键化合物( a ，p 不饱和羰基化合物、酯或腈) 发生加成反应。h i t o s l l i s a s l l i w a 首先报道了壳聚糖与丙烯酸进行m i c h a d 反应【5 7 】，在这个反应中丙烯酸既作 为质子供体使壳聚糖溶于水介质中，又作为m i c h a e l 加成的反应试剂制备出水溶性n 羧乙基壳聚糖。他的研究小组还将多种丙烯酸类或丙烯酸酯类化合物在醋酸水溶液中 与壳聚糖进行m i c h a e l 加成反应【5 8 枷】，成功获得不同种类水溶性的n 一取代壳聚糖衍生 物( 图1 8 ) ，反应程度通过调节温度、反应时间和丙烯酸类试剂的加入量进行控制。 洳尺一删足h洳、o 八删b 广吣h l 2 凡p ；h 八 = h o 少n h 2 5 4 c lo f o h 图1 培壳聚糖与各类丙烯酸类试剂进行m i c h l 加成反应5 s 】 f i g 1 8m i c h a e lr e a c t i o no fc h i t o s a i ii n 、珊t e r 锄da c o h 谢t l iv 撕o l l sa c r y lr e a g 衄t s 【5 8 j 1 4 1 3 壳聚糖的生物医学性质 经过国内外大量研究表明，壳聚糖是无毒的，美国食品与医药卫生管理局( f d a ) 已批准其为食品添加剂。壳聚糖作为一种含量丰富的天然高分子，其分子链上带有特 殊的氨基、羟基官能团，是一种功能高分子，广泛应用在医学、农业、食品、环境污 水处理等领域。在生物医学领域，研究发现壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降 解性、还有广谱抗茵性、抗感染性和很强的凝血作用，以及促进伤口愈合、调节血脂 和增强免疫力和抗肿瘤等多种生理活性作用。根据上述性质，可将壳聚糖制备成组织 工程支架、医用敷料、手术缝合线、人造皮肤以及药物缓释载体等多种生物材料。【6 1 舶】 1 3 北京化工人学硕士学位论文 1 4 2 壳聚糖静电纺丝的制备 人们一直希望将壳聚糖这种具有良好的生物性能天然多糖电纺，关于纯壳聚糖溶 液体系静电纺丝的报道却不多。可能是在高的静电压下，壳聚糖主链上的离子之间的 斥力阻碍了电纺纤维的形成，尤其是在射流中的弯曲不稳定性和鞭动不稳定性出现的 时候，这就造成了纯的壳聚糖体系静电纺丝的困难。但是关于纯的壳聚糖溶液体系的 静电纺丝还是取得了一些进展【6 m 9 1 。日本学者o l l k a w a 【6 7 】在试过在一系列溶剂( 如稀 盐酸、无水蚁酸、醋酸以及甲醇、乙醇、二氯甲烷等有机溶剂的混合溶剂) 中配制的 壳聚糖电纺丝溶液都不能得到可见的喷射液流后，发现以三氟醋酸( t f a ) 为溶剂得到 的壳聚糖溶液能够在一定浓度范围内得到电纺丝纤维，并且在浓度为8 训：时电纺丝 效果最好( 平均直径4 9 0 1 1 1 l l ，分布范围3 9 0 6 1 0 姗) ，在溶剂中混入较小比例的二氯 甲烷会有利于形成更均一的纤维形貌。使用t f a 为溶剂获得壳聚糖电纺丝原因可能如 下：首先，三氟醋酸与壳聚糖的氨基形成盐，破坏壳聚糖分子之间的氢键作用；其次， t f a 的高挥发性会加速电纺射流的固化，从而形成壳聚糖纤维。 关于壳聚糖静电纺丝更多的报道是关于将壳聚糖与其他聚合物混合电纺成纤维 的。选择与其他较为容易电纺成纤的高分子混合纺丝，不仅可以改善壳聚糖本身不易 电纺的缺点，还可以赋予壳聚糖纤维一些新的性能。最常见的是壳聚糖与聚乙烯醇 ( p v a ) 混合电纺成纤。p v a 是一种常见的分子结构规整、分子链柔顺的水溶性高分 子，其溶解度随着醇解度高低而不同。醇解度在8 7 8 9 范围内冷水和热水都可溶解， 醇解度8 9 9 0 以上的聚乙烯醇不溶于冷水，只溶于6 0 以上的热水。p v a 无毒，并 具有良好的生物相容性和化学稳定性，因此在生物医药、食品包装等领域有着广泛的 应用。p v a 的水溶液可以进行静电纺丝，并能得到很好的纤维。通过调节溶液浓度和 原料配比，壳聚糖与p v a 混合溶液可以通过静电纺丝得到光滑完好的纤维，并作为 组织工程支架或伤口敷料在生物医用材料领域有很好的应用前景【7 0 - 7 2 1 。壳聚糖还能与 其他一些合成高分子混合制备电纺纤维，如壳聚糖和p e o 【7 3 7 4 1 ，壳聚糖和p v p 【7 5 】等。 p 酞等人【7 6 】将壳聚糖与另一种天然高分子丝素蛋白共混后静电纺丝，研究发现壳聚糖 的含量只有达到3 0 时才能得到好的纤维，壳聚糖的加入使纤维的直径降低，但也增 加了纤维的脆性。 1 4 3 壳聚糖纤维的交联 1 4 3 1 戊二醛交联的方法 壳聚糖电纺纤维会在水中溶胀或溶解，而在一些水环境中的应用则要求壳聚糖纤 维在水中具有一定的稳定性，这就需要对壳聚糖纤维交联后再使用。利用戊二醛蒸汽 对壳聚糖纤维进行交联是一种常用的方法，主要利用壳聚糖的胺基和戊二醛的醛基发 1 4 第一章绪论 生了s c h i 版应【7 7 7 引，从而使壳聚糖分子之间通过化学键相连成网状结构。 j 懿s i c ad ，s c h i 缅n a n 【7 9 】详细研究了利用戊二醛蒸汽对壳聚糖电纺丝纤维进行交联 的方法，并通过扫描电镜、红外谱图、机械性能测试对交联后壳聚糖膜进行了表征。 结果表明未经交联的壳聚糖纺丝膜溶于酸性溶液和水中，其杨氏模量为1 5 4 9 4 0 0 m p a ，并且出现伪屈服点；经过交联后，纤维的直径增加到1 6 l n m ，杨氏模量略 有降低，不溶于酸性溶液和水。尽管不知道戊二醛蒸汽侵入到壳聚糖纤维中的程度， 但是可以知道交联反应导致膜脆性的增加，颜色的改变，同时伪屈服点的消失说明了 纤维的滑动受到了限制。s c l l i m n a i l 还提出了一步法制备交联壳聚糖电纺纤维，将戊二 醛水溶液加入到壳聚糖三氟醋酸溶液中，在纺丝过程中发生交联反应，这种方法将会 有助于壳聚糖纳米纤维膜的大规模生产【】。 1 4 3 2 光交联的方法 利用戊二醛交联存在膜的脆性增加和发生黄变的缺点，所以需要寻找其他方法实 现电纺丝的交联。紫外光交联技术具有交联速度快、节能方便等特点，因此被用来实 现电纺丝纤维的交联。 j u nz e i l u 利用噻吩基丙烯酰氯对p v a 进行改性，得到带有噻吩基丙烯酸基团的 p v a 衍生物( p v a t i l i o ) ，反应方程式见图1 9 。将1 0 叭的p v a 1 1 1 i o 溶液静电纺丝 成直径为1 0 0 2 0 0 i l l i l 纤维，经过紫外光( 3 0 0 衄) 照射后，纤维能够耐住9 5 水蒸汽 1 h 并保持基本的纤维形貌。这是由于紫外光引发了次亚乙烯基双键发生了2 + 2 环加成 反应使得分子间发生了光交联反应，可以通过红外光谱中光照后1 6 2 3 锄j 噻吩基和共 轭双键吸收峰消失证明。p a i l k 旬g u p t a 【8 2 】采用肉桂酰氯与甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸羟 乙酯的共聚物( p 0 1 y ( m m a c o h e a ) ) 反应得到肉桂酸功能化的新型聚合物，在n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 中配置成纺丝液，在纺丝的过程中用紫外光照射，同样发生了 次亚乙烯基c = c 双键的环加成反应和肉桂酸基团光致异构化，在索氏提取器中用四氢 呋喃( t h f ) 回流4 h 获得未溶解的纺丝膜凝胶会随着分子中肉桂酸基团摩尔含量的增 大而增多。 磊譬飞夕十一嚣 竺中一嚣 图1 9p v a m i o 的合成【8 1 】 f i g 1 9s y n m e s i so fp v a - t h i o 【8 l 】 1 5 北京化工人学硕士学位论文 还有一些方法是在纺丝溶液体系中加入光交联剂和光引发剂实现对电纺丝纤维 的交联。聚丁二烯( b r ) 电纺丝纤维可以通过在b r 的t h f 纺丝溶液中加入光交联剂 ( 2 一m e m y l - 4 - ( m e t h y l t h i o ) - 2 一m o 印h 0 1 i n o p r o p i o p h e n o n e ) 和光引发剂( t r i m e t l l y l o l p r o p a i l e 3 m e r c a p t o p r o p i o n a t e ) ，并在纺丝过程中采用原位紫外光照的方法实现交联( 见图1 1 0 ) 【8 3 】。实验结果表明交联密度随着交联剂含量的增加而增加，交联后的b r 纤维比原始 的b r 拥有更高的玻璃化转变温度( t g ) 。聚肉桂酸乙烯酯( p v c i ) 可以在光照下发 生交联反应，w o ns c o kl v o o 【8 4 】通过将p h b v 与p v c i 混合后电纺成纤维，经过紫外光 照射后再用氯仿溶剂将p h b v 除去，得到交联的超细p v c i 纤维。 羔 图1 1 0 原位紫外光辐射电纺丝装置【8 3 】 f i g 1 1 0e l e c n 0 s p i n i l i l l ga p p a r a t i l s 谢mi l ls i t i lu v i r r a d i a t i o ns ) r s t e m 【8 3 】 通过光交联方法实现壳聚糖纤维交联的相关研究报道也有出现【8 5 ，8 6 】。m i l c i l a i 肌a t o v a 先以三乙二醇二丙烯酸酯( t e g d a ) 为交联剂，2 ，2 二甲氧基一2 苯基苯乙酮 ( d m p a ) 为光引发剂，实现了壳聚糖p v a 纤维的光交联。还以t e g d a 和4 ，4 二叠 氮基二苯乙烯2 ，2 二磺酸磷酸氢二钠盐( d a s ) 为光交联剂，在d m p a 引发下对壳聚 糖p v p 纤维进行光交联，其中t e g d a 用来交联壳聚糖，d a s 用来交联p v p 。并对上述 两种光交联的壳聚糖纤维进行了抗菌性实验，结果表明所获得壳聚糖纺丝膜能够抑制 革兰氏菌的增长，从而有望作为医用材料使用促进伤口愈合。 1 5 课题的提出 组织工程支架能为细胞提供一个生存的三维空间，使细胞在按照预先设计的三维 形状的支架上生长和分化，形成细胞与支架的活性复合体，将其植入人体病损部位， 种植的细胞继续增殖，并按其特定功能分泌细胞外基质，实现受损组织的修复再生。 1 6 卜 第一章绪论 理想的支架应为三维、多孔网络结构，具有高的表面积和合适的表面理化性质以利于 细胞的粘附、增殖和分化，同时还应具备良好的生物相容性和生物可降解性，并具有 一定的生物力学性能。很多支架材料都是通过浇铸成型后冷冻干燥的方法获得多孔结 构。利用静电纺丝技术制备出的纤维膜具有纤维直径小、孔尺寸小、孔隙率高、比表 面积大的特点，更有利于细胞的黏附和增殖，是理想的组织工程支架材料。壳聚糖( c s ) 是含量丰富的第二大天然高分子，具有良好的生物相容性和生物可降解性，还有广谱 抗菌性、抗感染性和很强的凝血作用，在生物医药领域应用很广泛。羟基磷灰石是自 然骨的主要成分，降解后钙离子和磷酸根离子能促进骨组织修复，具有骨传导性和诱 导性，因此在组织工程领域应用很广泛。本课题就是利用静电纺丝技术制备壳聚糖 羟基磷灰石复合纳米纤维膜，作为潜在的组织工程支架材料，羟基磷灰石通过共混和 原位矿化沉积的方法被负载于壳聚糖纤维的内部或表面，并通过红外光谱、扫描电镜、 透射电镜、x 射线衍射、电子拉伸等表征手段对所获的纤维膜进行分析，用细胞毒性 试验( m t t 法) 和在纤维膜上培育细胞的方法考察复合纺丝膜的生物相容性。 近年来，对静电纺丝装置的改进使静电纺丝技术得到了迅速发展，同轴静电纺丝 就是其中一种。核壳结构的电纺丝的优势在于：首先，解决了某些不能单纺的聚合物 的纳米纤维的制备难题；其次，可以获得中空结构的纳米纤维：另外，核壳结构电纺 丝可以在内层负载某些药物和生物活性因子，作为药物缓释载体及组织工程支架。此 外，通过同轴纺丝技术可以将两种不能均相共混的高分子制备成双层结构的超细复合 纤维，可以满足不同性能的要求。本课题中将c s 作为内层基质的主体，但由于纯壳 聚糖电纺成纤性极差，而且脆性很高，因此，采用成纤性好、与c s 相容性好、已经 在生物材料领域广泛应用的聚乙烯醇( p v a ) 作为其添加物，改善内层溶液的成纤性 以及力学性能；外层基质选用疏水性聚酯聚碳酸亚丙酯( p p c ) ，p p c 是一种以二氧 化碳和环氧丙烷为原料制备的一种新型可降解脂肪族聚酯，利用同轴电纺技术制备出 了c s p v a ( c 0 r e ) p p c ( s h e l l ) 纤维，并进一步在内层负载生物活性物质羟基磷灰石 ( h a p ) ，为同轴静电纺丝技术在药物缓释和组织工程支架领域的应用提供了一种新 的思路。 制得的壳聚糖纳米纤维耐水性较差限制了其在生物医药领域的应用，传统的方法 是采用戊二醛蒸汽对壳聚糖纺丝膜进行交联，但是戊二醛具有刺激性气味，交联后的 膜脆性增加，并且颜色会发生改变。因为光聚合技术具有节能、环保、高效、操作简 单等优点，所以本课题尝试利用光交联方法改善纤维的耐水性。在前期的研究中，以 t e g d m a 作为光交联单体，1 1 7 3 作为光引发剂，对c s p v a 纤维进行光交联，可以 使纤维的耐水性略有提高，但单体或引发剂与水溶性高分子相容性差，进一步增加光 交联剂的含量，会导致分相，纤维可纺性交差。本文中，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯 ( p e g d m a ) 一种是水溶性的光交联剂，2 羟基2 甲基1 对羟乙基醚基苯基丙酮 ( h e p k ) 是一种常用的水溶性光引发剂，将p e g d m a 和h e p k 引入c s p v a 纺丝液 1 7 北京化工大学硕士学位论文 中，交联剂和高分子相的相容性较好，制得电纺丝膜在紫外光下进行交联，利用红外 光谱、热力学分析证明了光交联的发生，利用扫描电镜观察和溶胀率的测试考察了电 纺膜的耐水性能，纺丝膜的生物相容性则用m ，r r 法和支架上细胞的生长情况s e m 观 察来衡量。 1 8 第二章壳聚糖羟基磷灰杠复合电纺丝膜的制备及其性能研究 第二章壳聚糖羟基磷灰石复合电纺丝膜的制备及其性能研究 2 1实验部分 2 1 1实验原料 表2 1 实验原料 t h b i e2 1r a wm a t e r i a l si nt h i ss t u d y 2 1 2 实验仪器 表2 - 2 实验仪器 1 a b l e2 - 2h l s t n i m e n t su s e di i lm i ss t u d y 1 9 北京化工大学硕士学位论文 2 1 3 电纺丝溶液的配制和静电纺丝的过程 在室温条件下称取一定质量的壳聚糖粉末溶于浓醋酸水溶液( 9 0 叭) 中，浓度 是7 叭，密闭磁力搅拌均匀并静置一段时间成均相溶液。因为壳聚糖在醋酸水溶液 中容易降解，所以壳聚糖溶液都是现用现配。称取一定质量的p v a 颗粒溶于去离子 水中，在8 0 水浴中剧烈搅拌4 小时，获得浓度为1 0 的p v a 水溶液。将上述两 种溶液按一定c s p v a 质量比混合均匀后即得c s p v a 纺丝液。将羟基磷灰石按照一 定质量分数( 占溶液中固含量的百分含量) 混入c s p v a 溶液中，超声分散均匀后制 备出c s p 伽a p 电纺丝溶液。 ： n 羧乙基壳聚糖( c e c s ) 通过壳聚糖和丙烯酸发生迈克尔加成反应制备，产物 取代度( d s ) 为o 2 ，即m o l 卜c o o h ) m o l ( c e c s ) = 2 0 。c e c s p v a 纺丝液制备方法同 c s p v a 纺丝液制备方法一致。 静电纺丝装置的示意图见图1 1 。塑料医用注射器作为储液器，磨平的不同型号 不锈钢注射器针头作为喷丝口，与高压发生器正极相连，将纺丝液注入注射器中，施 加电压，纤维收集到针头下方的接地铝箔上形成纤维无纺布。 2 1 4 电纺丝溶液性质的测定 粘度：在恒温水浴( 2 5 ) 中，采用旋转粘度计测定电纺丝液的旋转粘度，测定 单位是m p a s 。 电导率：在室温下，由数字电导率仪测定溶液的电导率，其中电导电极是铂黑电 极，电极常数是1 0 4 。 2 1 5 壳聚糖羟基磷灰石复合电纺丝膜的表征 纤维表面形貌的观察：样品经过喷金后，在扫描电子显微镜下观察其表面形貌， 并采用图像分析软件测量3 0 根纤维的直径并计算出纤维的平均直径。 纤维内部结构的观察：在电纺丝过程中，将被镀上碳膜的铜网放置在接收铝箔上 收集少量纤维，于透射电子显微镜下观察纤维的内部结构。 热失重分析：通过热重分析仪对纺丝膜中羟基磷灰石的含量进行测定。将5 m g 样 品放在铝坩埚中进行测试，气氛为氩气，气流速度为2 5m m n i n 。升温速度为l o m i n ， 最后升到6 0 0 终止。 电纺丝红外光谱分析：将微量纺丝膜与溴化钾研磨后压片，通过傅立叶红外光谱 仪测定电纺丝化学组分的红外谱图。 x - 射线衍射分析：用x 射线衍射仪测定，c uk n 射线伉= 0 1 5 4 6 n m ) ，2 0 扫描 第二章壳聚糖羟基磷灰石复合电纺丝膜的制备及其性能研究 速率为2 。m i n ，扫描范围为5 0 5 0 0 。电压和电流分别为4 0k v 和3 0 驰。 力学性能测试：由万能材料试验机测定，拉伸速率为l o m m m i n 。测试样品为哑 铃型，有效尺寸为2 0m m 4n u n ；样品的厚度则通过x u t 型厚度计测量，精确度为 o 0 1 m m 。 2 1 6 壳聚糖羟基磷灰石复合电纺丝膜的生物学性能检测 2 1 6 1 细胞毒性试验( m t t 法) m ，i t 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法，是利用活细胞线粒体脱氢酶能将 m t t ( 溴化3 ( 4 ，5 二甲基噻唑基2 ) 2 ，5 二甲苯基四唑) 还原成紫色结晶甲脱并沉 积在细胞中，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜( d m s o ) 能溶解细胞中甲膜，用酶 联免疫检测仪器在5 7 0 n m 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细 胞数范围内，m t t 结晶物形成的量与细胞数成正比。 细胞培养：根据i s 0 1 0 0 9 9 3 5 标准测试方法，使用小鼠结缔组织成纤维细胞( l 9 2 9 ) 进行生物学试验，由北京大学医学部病原生物学系提供。培养基为含1 0 胎牛血清、 1 双抗和1 2 谷氨酰胺的r p m l l 6 4 0 ( g i b c o ) ，在3 7 、5 c 0 2 培养箱内培养。 材料浸提液的制备：材料经去离子水洗涤，滤纸吸干，高压蒸汽灭菌后备用。将 上述材料修剪成直径为1 5 i i l 】【i l 的圆形，每一圆形材料置于2 4 孔板的一个孔中，并分 别加入1 n d 含1 0 胎牛血清的砌，m i l 6 4 0 培养基，3 7 恒温箱中静置浸提4 8h ，用 0 2 2 岬微孔滤器过滤除菌。这阶段结束后，将膜从浸泡液中除去，获得了抽提液。 m 丌实验：将生长至汇合率为7 0 8 0 的l 9 2 9 细胞用胰酶消化，混悬于完全培 养液中。调整细胞浓度为4 1 0 4 m l ，分别接种于9 6 孔培养板上，每孔1 0 0 l ，每个 实验组设6 个复孔。培养2 4h 后，更换培养液，其中阴性对照组加入完全培养液，实 验组加入不同材料的浸提液，阳性对照组加入含o 6 4 苯酚的培养液。培养2 4 h 后， 分别取出1 板，每孔加入2 0 山m t t 溶液( 5 m g m 1 ) ，3 7 继续孵育4 h 。小心吸弃孔 内培养液，每孔加入1 5 0 p 1d m s o ( s i 舭a ，美国) ，震荡1 0 m i i l ，使结晶物充分溶解。 选择5 7 0 姗波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值( o d 值) ，记录结果。抽提 率为6 锄1 珏1 l 。 2 1 6 2 细胞在纺丝膜上的粘附和生长情况观察 材料经去离子水洗涤，滤纸吸干，修剪成直径为1 5 m m 的圆形，并固定在载玻片 上。经高压蒸汽灭菌后，将上述材料置于2 4 孔板中。将生长至汇合率为7 0 - 8 0 的l 9 2 9 细胞用胰酶消化，混悬于完全培养液中。调整细胞浓度为1 5 1 0 4 m l ，分别接种于 2 4 孔培养板的生物材料上，每孔1 m 1 。3 7 、5 c 0 2 培养4 8 小时后，将玻片取出， p b s 冲洗2 次，3 戊二醛预固定1 2 h ，再经锇酸固定、干燥、喷金等处理后在扫描电 镜下观察。 2 1 北京化工人学顾。i ：学位论义 2 2 结果与讨论 2 2 1 c s p v a h a p 共混复合电纺丝膜 焉 01 0 0 2 0 03 0 04 0 0 5 0 0 6 0 0 t 卸p e 例 u 耐 图2 一l 不同羟基磷灰石含量的c s 伊、，a ，h a p 电纺膜的热失重曲线 f i g 2 - 1t gt 1 1 e m o g r a m so fc s p 气h a pe l e c t r o s p u nn a n o f i b e r s ；鲨整撩孵蟊 雳黧嫠漤 蕊萋隧是鎏星 图2 2 电纺丝纤维的扫描电镜照片：( a ) c s p v a 纤维；( b ) c s 伊v a + 2 h a p ( 未交联) ；( c ) c