（材料学专业论文）非水介质中生物催化制备酯化葡甘聚糖新方法的研究.pdf

摘要 摘要 本研究旨在以我国特有的植物可再生资源一魔芋葡甘聚糖( k g m ) 为反应底物，利用非水介质中生物催化转酯化反应来制各酯化葡甘聚糖， 以期建立一种制备具有独特的生物、药理和表面活性的葡甘聚糖酯化衍 生物的环境友好的、高选择性的新方法，开辟天然，合成高分子的生物催 化改性的新途径。 以多种脂肪酶和蛋白酶为生物催化剂，初步探讨了在非水介质如有 机溶剂体系、无溶剂体系、a o t 异辛烷反相胶束体系和离子液体体系中 生物催化k g m 与酰基供体乙酸乙烯酯的转酯化反应。通过对转酯化反应 产物的取代度( d s ) 的测定，评价了所用酶对该反应的催化能力。实验 结果表明，对于这一反应，8 种脂肪酶( l i p o z y mt l1 0 0 l 、l i p a s et y p e v i i 、 l i p o z y mt l i m 、n o v o z y m4 3 5 、l i p o z y mr mi m 、l i p a s em y 、l i p a s ei m 、 l i p a s eo f ) 和3 种蛋白酶( 中性蛋白酶n e u t r a s e 、胰蛋白酶p t n 6 0 s 、 木瓜蛋白酶p a p a i n ) 在适当的非水介质中均有一定的催化活力。其中， 以离子液体体系中n o v o z y m4 3 5 的催化效果最佳。 在有机溶剂中采用固定化脂肪酶催化反应具有产物易于分离提纯、 反应体系相对简单、有利于酶的反复使用的优点，因而系统地研究了这 三种固定化脂肪酶l i p o z y mt l i m 、n o v o z y m4 3 5 、l i p o z y mr mi m 在有 机溶剂n n 一二甲基乙酰胺、甲苯和异辛烷中催化k g m 与乙酸乙烯酯 的转酯化反应。通过测定反应产物的d s ，考察了各相关因素如生物催化 剂、反应物的配比、反应介质的疏水性l g p 、反应时间、反应温度、反应 体系的水活度aw 、底物分子量等对反应的影响及其规律。研究发现，a 。 对反应有很大的影响，不同反应介质中对应的最佳水活度不同：以l g p 分别为一1 0 和4 7 的n ，n 一二甲基乙酰胺和异辛烷为反应介质时，最佳 口。为0 5 3 ；以l g p 为2 5 的甲苯为反应介质时，最佳a 。为0 8 4 。 通过f t i r 、1 h 和1 3 cn m r 对k g m 转酯化产物的结构进行了分析， 证实了在有机溶剂中的酶催化k g m 的转酯化反应具有优异的位置选择 性，k g m 主链上糖单元中c 6 位上的羟基优先参与反应。 进一步地研究了不同结构的酰基供体( 乙酸乙烯酯、乙酸异丙稀酯、 乙酸烯丙酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯) 对在有机溶剂甲苯( a w = 0 8 4 ) 和异辛烷( 口。= o 5 3 ) 中n o v o z y m4 3 5 、l i p o z y m r m i m 和l i p o z y mt l i m 催化k g m 转酯化反应的影响。结果表明，除乙 酸烯丙酯外其它的酰基供体都能进行转酯化反应；转酯化反应产物的d s 华南理工大学硕士学位论文 随着脂肪酸乙烯酯的碳链长度增加而提高。特别是k g m 的转酯化反应具 有优异的位置选择性，k g m 主链上糖单元中c 6 位上的羟基优先参与反 应。 通过x r d 研究发现转酯化产物的结晶结构无明显变化：t g 分析发现 转酯化产物的热稳定性随着d s 的增加而提高。 关键词：葡甘聚糖；生物催化：酶：水活度；选择性反应；转酯化反应 a b s t r a c t t h ep r e p a r a t i o no ft r a n s e s t e r i f i e dk o n j a cg l u c o m a n n a nt h r o u g ht h e b i o c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o ni nn o n - a q u e o u sm e d i a w a ss t u d i e du s i n g k o n j a cg l u c o m a n n a n ( k g m ) a s as u bs t r a t e ，w h i c hi sa na b u n d a n t ， i n e x p e n s i v e ，n a t u r a l l yo c c u r r i n g a n dr e n e w a b l er e s o u r c ef r o m p l a n t g r o w i n gi nc h i n a i t i se x p e c t e dt oe x p l o r ea ne n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y ， h i g h l y s e l e c t i v ea n dn e wm e a n so f p r e p a r i n g t r a n s e s t e r i f i e dk g m d e r i v a t i v es p o s s e s s i n g e x c e l l e n t b i o d e g r a d a b i l i t y ，b i o c o m p a t i b i l i t y ， n o n t o x i c ，u n i q u ep h a r m a c o l o g i c a la n ds u r f a c ea c t i v i t y ，t h u so p e n i n gan e w w a yt ot h eb i o c a t a l y z e dm o d i f i c a t i o no fn a t u r a l ，s y n t h e t i cp o l y m e r s s e v e r a l l i p a s e s a n dp r o t e a s e sw e r eu s e da s b i o c a t a l y s t s i nt h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g mw i t ha c y ld o n o rv i n y la c e t a t e t h ep r e l i m i n a r y s t u d yo nt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g mc o n d u c t e di nn o n a q u e o u sm e d i a s u c ha so r g a n i cs o l v e n ts y s t e m s ，as o l v e n t f r e es y s t e m ，a na o t ，i s o o c t a n e r e v e r s e dm i c e l l e s ys t e m a n da ni o n i c l i q u i ds y s t e m w a sm a d e t h e c a t a l y z i n ga b i l i t yo f e a c he n z y m ef o rt h i sr e a c t i o nw a se v a l u a t e db y m e a s u r i n g t h e d e g r e e o f s u b s t i t u t i o n ( d s ) o ft h e c o r r e s p o n d i n g t r a n s e s t e r i f i e dp r o d u c t so fk g m t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a ta l lt h e e i g h tl i p a s e s ( l i p o z y mt l1 0 0 l ，l i p a s et y p ev i i ，l i p o z y mt l i m ，n o v o z y m 4 3 5 ，l i p o z y mr mi m ，l i p a s em y ，l i p a s ei ma n dl i p a s eo f ) a n dt h r e e p r o t e a s e s ( n e u t r a s e ，p n t 6 0 s ，p a p a i n ) u s e di nt h es t u d i e sp o s s e s st h e a c t i v i t y t oc a t a l y z et h et r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g mw i t hv i n y la c e t a t et o s o m ee x t e n ti np r o p e rn o n a q u e o u sm e d i a a m o n gt h e m ，n o v o z y m4 3 5 e x h i b i t st h eh i g h e s ta b i l i t yf o rt h er e a c t i o np e r f o r m e di na ni o n i cl i q u i d s y s t e m t h er e a c t i o n sc a t a l y z e db yi m m o b i l i z e dl i p a s e si n o r g a n i c s o l v e n t s p o s s e s ss o m ea d v a n t a g e s s u c ha sa ne a s ys e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p r o d u c t s ，as i m p l e r e a c t i o n s y s t e m ，a n dc o n v e n i e n c ef o r t h e r e u s ea n d r e c y c l eo fe n z y m e s t h e r e f o r e ，t h r e ei m m o b i l i z e dl i p a s e sl i p o z y mt l i m ， n o v o z y m4 3 5 ，a n dl i p o z y mr mi mw e r eu s e di nt h ef u r t h e rr e s e a r c hi n t o t h et r a n s es t e r i f i c a t i o no fk g mi nt h r e e o r g a n i c s o l v e n t s n ， n d i m e t h y l a c e t a m i n e ( d m a c ) ，t o l u e n e a n di s o o c t a n e ( i o c t ) t h e i n f l u e n c e so ft h er e l a t e df a c t o r s ，i n c l u d i n gab i o c a t a l y s t ，ar e a c t i o nm e d i u m i i 华南理丁大学硕士学位论文 f o r m u l a t i o n so ft h er e a c t a n t s ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m e ，w a t e ra c t i v i t y o fr e a c t i o n s ys t e m ( a ) a n dm o l e c u l a rw e i g h t o fa s u b s t r a t e ，o nt h e b i o c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g m w e r es y s t e m a t i c a l l yi n s p e c t e db y m e a s u r i n gt h ed so fr e a c t i o np r o d u c t s t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ew a t e r a c t i v i t y ，a w ，h a s a g r e a t e f f e c to nt h er e a c t i o na n dt h eo p t i m a lw a t e r r e a c t i v i t yd e p e n d so nar e a c t i o nm e d i u mf o rt h es t u d i e dr e a c t i o n si nt h i s w o r k t h eo p t i m a lw a t e rr e a c t i v i t yi s0 5 3f o rt h er e a c t i o nc o n d u c t e di n d m a ca n di o c tw h o s el g pv a l u e sa r e 一1 0a n d4 7 ，r e s p e c t i v e l y ，a n do 8 4 f o rt h a ti nt o l u e n ew h o s el g pi s2 5 t h es t r u c t u r a la n a l y s e so ft r a n s e s t e r i f i e dp r o d u c t sb ym e a n so ff t i r ， 1 ha n d 1 3 cn m r s p e c t r af u l l yp r o v et h a tt h ee n z y m a t i ct r a n s e s t e r i f i c a t i o n o fk g mw i t h v i n y l a c e t a t ei n o r g a n i c s o l v e n t s p o ss e s s e s h i g h r e g i os e l e c t i v i t y ，a n dt h eh y d r o x y lg r o u p sa tc 6o ns u g a ru n i t so fk g m c a n f i r s t l yp a r t i c i p a t ei nt h er e a c t i o n a c y ld o n o r s w i t hd i f f e r e n ts t r u c t u r e s ，i n c l u d i n gi s o p r o p e n y la c e t a t e ， a l l y la c e t a t e ，n b u t y r i ca c i dv i n y le s t e r ，n - c a p r y l i ca c i dv i n y les t e r ( v i n y l n o c t a n o a t e ) ，v i n y ll a u r a t e ，a n dp a l m i t i ca c i dv i n y le s t e r ，w e r eu s e di nt h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g mi ni s o o c t a n e ( a 。0 5 3 )a n dt o l u e n e ( a w 0 8 4 ) c a t a l y z e db yl i p o z y mt l i m ，n o v o z y m4 3 5 a n dl i p o z y mr m i m t h e e f f e c t so ft h es t r u c t u r eo fa c y ld o n o r so nt h et f a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g m w e r ei n v e s t i g a t e d t h er es u l t ss h o wt h a tt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g m c a no c c u rw i t ha l lt h ea c y ld o n o r se x c e p ta l l y la c e t a t ea n dt h a tt h ed so f t r a n s e s t e r i f i e dp r o d u c t si n c r e a s e sw i t ha ni n c r e a s ei nt h ec a r b o n c h a i n l e n g t h o f f a t t y a c i d v i n y le s t e r s a d d i t i o n a l l y ，t h er e a c t i o n i s h i g h l y r e g i o s e l e c t i v ea n do c c u r so n l ya tc 6o ns u g a ru n i t so fk g m i nt h ec a s eo f d sb e l o w1 t h ex r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) a n dt h e r m a lg r a v i t ya n a l ys i s ( t g ) w e r e u s e dt o a n a l y z ec r y s t a l l i n es t r u c t u r ea n dt h e r m a l p r o p e r t i e s o ft h e t r a n s e s t e r i f i e d p r o d u c t s ，r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h e c r y s t a l l i n es t r u c t u r eo fp r o d u c t si sh a r d l yc h a n g e da n dt h et h e r m a ls t a b i l i t y o fp r o d u c t si n c r e a s e sw i t ht h e i rd sv a l u e s k e yw o r d s ：k o n j a cg l u c o m a n n a n ，b i o c a t a l ys t s ，e n z y m e ，w a t e ra c t i v i t y ， s e l e c t i v er e a c t i o n ，t r a n s e s t e r i f i c a t i o n 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进 行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作 品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：丁枷日期：2 0 0 5 年6 月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：丁锐 导师签名：虏荔乞 日期：2 0 0 5 年6 月2 日 日期：2 0 0 5 年6 月2 日 第一章绪论 第一章绪论 聚多糖是非常丰富的生物质资源，其中来自草本植物魔芋 ( a m o r p h o p h a l l u sk o n j a c ) 的魔芋葡甘聚糖( k o n j a cg l u c o m a n n a n ，简称 k g m ) 是我国和一些东南亚国家所特有的中性天然聚多糖，也是迄今发现 的自然界唯一可以大量获得的葡甘聚糖【l 】。一直以来，魔芋主要用作食品 和食品添加剂；此外，它还具有一定的保健和药用价值，可治疗肿痛、咳 嗽、解毒、降低人体中血糖肝糖含量、调节脂肪代谢，具有减肥和抗肿 瘤等作用。 随着对k g m 及其衍生产品研究和应用的深入，发现k g m 及其衍生物 具有许多独特的理化性质和生理活性，在医药和预防医学、化工、纺织、 石油钻探等领域中都有很高的应用价值。另外，构成k g m 的单体单元葡 萄糖和甘露糖上的羟基都能够参与多种化学反应，如酯化、醚化、氧化以 及交联等反应，得到的k g m 衍生物能够具有许多新的功能，如表面活性、 螯合性及生物活性等，从而能大大地拓展k g m 的应用领域。 在对天然聚多糖进行改性以制备聚多糖衍生物的过程中，我们也注意 到生物催化在单糖、二聚糖和低聚糖改性方面的研究成果。酶作为一类重 要的生物催化荆在小分子物质的生物催化合成与转化领域取得许多理论 和应用的研究成果。在这些研究中，生物催化因其具有许多传统化学催化 剂所不具备的优点而备受关注，特别是自1 9 8 4 年以来，美国麻省理工学 院的科学家k l i b a n o v 和z a k s 【2 3 】的一系列的关于酶在非水介质中具有催化 活性的发现和总结，对酶学研究和应用具有划时代的意义，使非水介质中 的酶催化反应成为生物化学、有机合成以及相关领域研究中一个迅速发展 的热点。 本章拟对本工作所研究的对象k g m 及其衍生物的结构和理化性质、 k g m 衍生物的制备与应用前景、非水介质中的酶催化反应的基本理论以 及相关的国内外研究现状进行综述，从而阐明本工作的研究背景、目的和 意义。 1 1 葡甘聚糖及其衍生物 葡萄糖甘露聚糖k g m 在干魔芋块茎种含量高达6 0 8 0 ，它作为一 种高分子量的水溶性非离子型天然聚合物，其平均分子量因产地、品种、 加工方法不同而有差异，一般可达到1 0 6 数量级 4 1 。精制的k g m 呈白色 华南理工大学硕士学位论文 粉末状，一般溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。k g m 具有聚多糖高分子化合物的普遍特性，其分子链上的大量羟基使其易于 发生化学反应制备各种性质的衍生物。在此，对k g m 及其衍生物相关方 面的物理化学性质做相应介绍。 1 1 1 葡甘聚糖的大分子结构与形态 对k g m 的大分子结构的研究表明，k g m 是由d 葡萄糖( g ) 和d 一甘露糖 ( m ) 按1 ：1 6 或1 ：1 6 9 的摩尔比通过b 一1 ，4 一吡喃糖苷键结合而成的复合 多糖5 q 】。在其主链上甘露糖的c 3 位置上往往存在着通过0 1 ，3 糖苷 键结合的支链结构。此外，在k g m 大分子链上约每6 2 0 个糖单元上有 1 个乙酰基存在6 1 。k g m 的结构如图1 1 所示。 gm g m g 图1 1k g m 的大分子结构 f i g u r e1 - 1t h em a c r o m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fk g m 葡甘聚糖具有甘露糖i 和甘露糖两种结晶变体。天然的葡甘聚糖 多为甘露糖i 型，也即脱水多晶型，晶体中不存在水分子；经过碱处理 的葡甘聚糖多为甘露糖i i 型，也即水合多晶型，晶体中结合有水分子【9 】。 研究表明，高分子量的葡甘聚糖多以甘露糖i i 形态存在，而低分子量的 葡甘聚糖则多以甘露糖i 形态存在【1 0 】。这些结晶变体都以葡甘聚糖为基 础，有相同的化学成分，但其不同的聚集态结构对葡甘聚糖的性质有不 同的影响。 对葡甘聚糖结晶行为的进一步研究表明，葡甘聚糖形成何种结晶变体 取决于以下三个因素：结晶温度、结晶介质的极性和多糖的链长。高温、 低极性和短链长条件下通常得到甘露糖i 型结晶形态：而在低温、高极 性和长链长条件下，则往往得到甘露糖i i 型结晶形态。 2 第一章绪论 1 1 2 葡甘聚糖的溶液性质和凝胶性质 k g m 具有极好的亲水性，其水溶液粘度较高、稳定性较好。当k g m 水溶液的浓度高于7 ( w w ) 时会形成液晶，但其粘度并不会因此而降低。 这可能是由于k g m 溶液的凝胶化作用优于液晶相的形成，从而限制了有 序结构的发展。同时，k g m 水溶液具有明显的剪切变稀现象。随着k g m 浓度的增加，特别是当浓度高于7 ( w w ) 时，粘度对剪切速率的依赖性 降低j 。 分子量高、水合能力强和不带电荷等特性决定了k g m 具有优良的增 稠性能。1 的k g m 水溶液的粘度可达到数十2 0 0p a s ”】。k g m 与常用 的增稠剂黄原胶 13 】、卡拉胶1 4 1 及海藻酸钠可形成协同增稠效应。此外， k g m 具有独特的凝胶特性，在一定条件下可以形成热可逆( 热不稳定) 凝胶和热不可逆( 热稳定) 凝胶。k g m 能与黄原胶、卡拉胶等通过较强 的协同作用而形成热可逆凝胶。这种热可逆凝胶，加热成为液体，冷至 室温成为凝胶【1 5 1 。 1 1 3 葡甘聚糖衍生物的制备、性质和用途 k g m 具有聚多糖高分子化合物的普遍性质。除了通常的降解反应外， 其分子链上大量羟基的存在使其易于发生化学反应，如酯化、接枝、交 联、甲基化、羧甲基化、氧化来制备葡甘聚糖的衍生物等。 1 1 3 1 低聚葡甘聚糖 天然葡甘聚糖的分子量较大，通过降解可以获得低聚葡甘聚糖甚至寡 糖。对k g m 降解反应的研究始于二十世纪六、七十年代。研究者们以酸 1 6 1 7 1 或b 甘露糖酶1 8 19 1 作为催化剂，通过对k g m ：进行不同程度的降解， 结合其它分析方法来确定其结构和组成。研究发现，无论是在酸降解还 是酶促降解，聚多糖类物质的降解都是由连接糖单元的糖苷键的断裂造 成的。 国内外学者对k g m 的酶催化降解反应的研究”1 几乎都以k g m 的 完全水解以制备寡糖、分析k g m 的结构或研究降解反应的机理为目的。 本课题组以口甘露糖酶催化k g m 的有限，可控降解的研究”1 ，考察 了这一可控降解过程中k g m 溶液的【口】与m 。的关系，得到公式： m = 5 0 6 x 1 0 。m 。”“ ( 1 1 ) 这关系式与k i s h i d a 等“”利用取代度为0 4 5 的甲基化k g m 的水溶 华南理工大学硕士学位论文 液，研究了【玎】与肘。的关系，得到了以下的关系式： m = 6 3 7 1 0 4 m 。“ ( 1 - 2 ) 这两个公式均符合聚合物的分子量与特性粘数的关系m a r k h o u w i n k 方程式玎= k m 。，且二者的口值比较接近。 进一步对不同的酶催化k g m 的降解反应及其动力学的研究2 3 2 5 2 6 1 ， 我们发现无论采用那一种酶催化k g m 的水解降解反应都是一个由零级反 应和一级反应复合起来的反应。在反应初期，降解反应按零级反应动力 学模式进行，降解反应的表观速率常数与底物浓度成反比；到达某一反 应时间之后，反应按一级反应动力学模式进行，降解反应的表观速率常 数与底物浓度无关。 对酶催化k g m 的可控降解进行系统的研究基础上，通过环境友好的 方法在温和的反应条件制备一系列不同分子量的k g m ，以满足不同的用 途成为可能。 1 1 3 2 酯化葡甘聚糖 k g m 分子链上大量存在的羟基使之可被视为一种多元醇而能与各种 无机酸或脂肪酸发生酯化反应。关于k g m 的酯化改性的相关报导较多。 酯化改性的目的在于改善和扩展以k g m 为基质的材料的性能，从而以拓 宽k g m应用范围。如用- 5 来酸酐2 7 28 1 、没食子酸 2 9 , 3 0 1 、磷酸氢二钠一 磷酸二氢钠”和三聚磷酸钠”为酰基供体时，所得k g m 衍生物水溶液 的粘度、稳定性、成膜性以及抗菌性较未改性的k g m 都有了很大的改善。 k g m 的磷酸酯具有絮凝作用，如对高岭土悬浊液絮凝作用1 。用长链 脂肪酸如棕榈酸、月桂酸、辛酸和油酸作为酰基供体，可得到相应的k g m 脂肪酸酯衍生物。这类衍生物可望用做可生物降解的高分子表面活性剂。 已有实验证明，在水包油乳液体系中，合适取代度的葡甘聚糖长链脂肪 酸酯显示出较好的乳化能力，即使在高盐浓度和酸性情况下，仍然具有 好的乳化效果”“”1 。国内学者制各类似肝素结构、具有生物活性的酯化 葡甘聚糖醛酸钠”一，并申请了相关专利1 。 1 1 3 3 接枝和交联葡甘聚糖 以硝酸铈铵为引发剂，k g m 精粉能够在5 0 乙醇中与丙烯酸丁酯发 生接枝共聚反应，所得产物的粘度和对柑桔的涂膜保鲜效果较未改性前 有显著的提高【3 8 ，3 9 。对k g m 进行交联改性，同样可以改善其成膜性能。 如在5 0 6 0 水溶液中，边搅拌边滴加三氯氧磷( p o c l 3 ) ，所得交联产 4 第一章绪论 物的粘度、稳定性、成膜性都较改性前有所提高，制成的膜均匀、光泽 好、强度高，并具有一定的抗菌能力4 们。此外，应用适当的交联剂和反 应条件，可以制得具有良好的强度和力学性能，以及不同的粒度和膨胀 度的珠状交联葡甘聚糖。这样的珠状交联葡甘聚糖可用作离子交换层析 介质，对多种蛋白质有较高的吸附容量，具有一定的分离能力4 1 1 。 1 1 3 4 甲基葡甘聚糖和羧甲基化葡甘聚糖 通过化学改性可以提高k g m 水溶液的粘度、稳定性和抗菌性，但其衍 生物水溶液的透明性都较差。将k g m 进行适当的甲基或羧甲基化可以得 到水溶液透明度较好的葡甘聚糖衍生物。 用硫酸二甲酯可使k g m 甲基化。取代度为0 3 1 4 的甲基化k g m 溶于 水，溶液均匀、粘度高、透明性较高1 。 在乙醇溶液中，k g m 与氯乙酸和氢氧化钠反应所得到的羧甲基葡甘聚 糖水溶液具有高透明度”“。另外，先将k g m 悬浮在二甲基甲酰胺中2 4 小时，再悬浮于6 0 氢氧化钠溶液中3 0 分钟后，将沉淀物过滤、压榨， 随后置于氯乙酸一异丙醇中于5 0 下搅拌反应3 小时后也可以得到羧甲 基化葡甘聚糖。将羧甲基葡甘聚糖用于果蔬涂膜保鲜己取得了良好的效 果【4 4 】。 1 1 3 5 氧化葡甘聚糖 选择适当的氧化反应体系，将k g m 进行两步氧化，可相继得到两种不 同氧化程度的氧化k g m 衍生物，即双醛基k g m 和双羧基k g m 。后者不仅 具有很好的水溶性和生物可降解性，还具有相当的免疫激励能力”。国 内的研究者利用悬浮法和湿法制备氧化k g m ，并且对氧化k g m 的结构做 了系统分析，认为氧化发生在糖单元残基上的c 2 和c 3 位”“。c r e s c e n z i 等”则利用t e m p o n a b r 的作用，实现了在k g m 糖单元上c 6 位的氧化。 1 1 4 葡甘聚糖及其衍生物的生物活陛 葡甘聚糖有明显的抗肿瘤作用。国内外预防医学的研究发现，k g m 有抑制小鼠自发性肝肿瘤”、大鼠二甲肼诱发结肠癌的作用”“、以及 预防甲基硝基亚硝基胍( m n n g ) 诱发的肺癌”“的作用。葡甘聚糖的 抗癌机理可能是一。：k g m 是一种优良的膳食纤维，有润滑肠道、通便的作 用，可减少吸收肠道分解代谢的有毒物质，对肠道癌症有一定的预防作 用；能刺激机体产生一种杀灭癌细胞的物质；k g m 可改变肠道菌群的生 华南理工大学硕士学位论文 态环境，表现为双歧杆菌为代表的厌氧菌占优势，其活菌具有明显的免 疫增强作用，其死菌具有明显的抗肿瘤活性：通过提高机体免疫功能发 挥抗癌作用； 葡甘聚糖作为一种可溶性膳食纤维，k g m 能够与肠内胆汁酸结合， 增加胆汁酸排泄，使体内胆汁酸合成增加，不仅降低血液中胆固醇水平， 也降低甘油三酯水平。通过动物试验表明，k g m 具有调节脂质代谢，预 防高血脂的作用一。研究者制备葡甘聚糖的衍生物酯化葡甘聚糖醛酸钠 是具有类似肝素结构、带有一定生物活性的。 k g m 还有降血糖和肝糖的作用。尽管迄今为止，人们还没有完全确 定糖尿病的病因，但一般认为与过多的食用精制的碳水化合物食品而对 多糖类膳食纤维的摄入量不足有关。k g m 具有改善耐糖性的作用”。另 外，k g m 还有抗衰老、防止骨质疏松、治疗肿痛、解毒、咳嗽等作用“。 1 1 5 葡甘聚糖的国内外研究现状 由于k g m 资源的地域特性，同本学者早在2 0 世纪4 0 年代，就开始 对k g m 进行系统的理论和应用研究，开发出了一系列保健品和其它可用 于医疗、化工等行业的产品。目前，日本对k g m 及其衍生物的开发已经 进入了多学科、多行业与多种技术复合的研究阶段。此外，发达国家的 预防医学科学工作者对k g m 及其衍生物在预防心脑血管疾病以及糖尿 病、胆结石、十二指肠溃疡、肿瘤、肥胖症等疾病中的功能和机理进行 了富有成效的研究，肯定了k g m 及其衍生物的药用价值，展示了它们在 治疗高胆固醇、高血压、高血糖病和药物缓释载体、生物酶的固定化等 方面颇具吸引力的应用前景1 。 k g m 是我国特有的生物质资源，其应用历史相当长，但相关的理论 和实验的研究仅有1 0 余年历史。所涉及的研究领域与国外学者相似，主 要集中在k g m 的提取、纯化、结构分析与表征、食品学性质( 如流变性、 增稠性、胶凝性、成膜性等) 、物化性质( 包括溶液性质、凝胶行为、液 晶行为等) 、作为食品的加工方法、保健功能与药用价值、化学改性等方 面。所开发的产品不多，档次不高，主要用作食品添加剂，并以原料出 口，附加值低。近年来，随着政府、工业界和研究者对可再生资源的开 发和利用h 益重视，对k g m 的研究也日趋活跃。武汉大学的田炳寿等对 k g m 的长链脂肪酸酯的常规化学法制备以及产物的乳化性能进行了探讨 ”“，张俐娜等则对k g m 与其它天然高分子的复配膜和互穿网络产物的 性质和应用进行了较为深入的研究”“；张迎庆、干信等用常规的化学 法制备了k g m k i 聚糖的硫酸酯化衍生物”“。然而，无论是国内还是国 6 第一章绪论 外，除了本课题组前期的研究工作外2 卜23 ，2 5 ，2 6 6 2 6 ”，很少有其它的涉及 生物催化k g m 的改性反应的报道。 1 2 非水介质中酶催化反应的基本理论 根据传统的酶学理论，生物催化剂酶是在水溶液环境中催化水溶性 底物的转化，有机溶剂容易引起酶蛋白变性失活。1 9 8 4 年，美国麻省理 工学院的k l i b a n o v 在s c i e n c e ”1 上发表论文首次报道了猪胰脂肪酶在9 9 的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇之间的转酯化反应，并证实了酶在 1 0 0 高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且还显示出较高的催 化转酯化反应的活力。这一发现使得酶催化反应只能在水溶液中进行的 传统观念受到挑战。2 0 0 1 年k l i b a n o v 在n a t u r e ”上撰文论述非水介质中 酶催化的条件和特点。他明确指出，只要条件合适，酶可以在非生物体 系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化；酶不仅 可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体 系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。 k l i b a n o v 的发现和总结对酶学研究和应用具有划时代的意义，开拓了非水 相酶学研究的新领域，并使之成为生物化学、有机合成以及其它相关学 科研究的热点。 在此后的2 0 多年中，酶在非水介质中的催化反应研究非常活跃，大 量的研究表明，酶在非水介质中不但能够保持活力，还具有许多优点”一 1 ：能够增加非极性底物的溶解性、可进行酶水解的逆反应、有利于减 少副产物、有利于酶和产物的分离和酶的再利用、减少底物和产物对酶 的抑制、增加酶的热稳定性等。严格地讲，酶在绝对无水的条件下是不 具有催化活力的。所谓非水介质，不是指绝对无水，而是指含有微量水 的有机溶剂体系( 含水量 l ，这一体系宏观上是有机溶剂，而作为生 物催化剂酶的微观环境则是水体系。在本节中，将对非水介质中的酶催 化反应的基本理论做简要的概述。 1 2 1 酶在非水介质中的结构与性质 非水介质是指出水以外的所有的反应介质，包括有机溶剂、反相胶束 体系、超l | 缶界流体、离子液体、无溶剂体系等。其中以有机溶剂应用最 广，研究的最多。因此，这里主要以有机溶剂为例，介绍酶在非水介质 中的结构与性质。 华南理工大学硕士学位论文 1 2 1 1 酶在有机溶剂中的形态与结构 在水溶液中，酶分子( 除固定化酶之外) 是均匀地溶解于其中；在有机 溶剂中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在形式主要有两大类。第一类 是固态酶，包括冷冻干燥酶粉和固定化酶，它们以固体形式存在于有机溶 剂中；第二类是可溶性酶，包括水溶性大分子共价修饰酶，非共价修饰的 高分子一酶复合物、表面活性剂一酶复合物以及微乳液中的酶。 酶不溶于疏水性的有机溶剂，它在含微量水的有机溶剂中以悬浮状 态起催化作用。按照热力学原理预测，酶的蛋白质的构象在水溶液中是 稳定的，在疏水环境中是不稳定的。但是，通过对酶在水相和有机相中的 结构的比较，发现在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性；至少，酶 的活性部位的结构在有机溶剂中与在水溶液中是相同的1 。通过o 2 3 n m 的x 射线晶体衍射研究发现，在有机溶剂中具有催化活性的酶，其在 有机溶剂中蛋白质分子骨架的构象与在水相中无明显变化，从而维护其 三维结构和活性中心的完整1 。 然而，在有机溶剂中酶的催化活力有不同程度的变化。研究者1 认为 酶分子活性中心的改变不是导致不同非水介质中酶活力变化的主要原 因，酶分子结构的动态变化很可能是主要因素。酶作为蛋白质，它在水 溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构象是酶发挥 催化功能所必需的“紧密”而又有“柔性”的状态。紧密状态主要取决 于蛋白质分子内的氢键、溶液中水分子和蛋白质分子之间的氢键使蛋白 质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈现一种“开 启”状态。酶分子在“开启”和“紧密”两种状态中处于一种动态平衡 中，表现出一定的柔性1 。 酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能。 有学者认为，酶悬浮与含微量水的有机溶剂中时，与蛋白质分子形成分子 间氢键的水分子极少，蛋白质分子内的氢键起主导作用，导致蛋白质结构 变得“刚硬”，活动的自由度变小。蛋白质的这种动力学刚硬性限制了疏 水环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态转化，能维持和水溶液中同样 的结构和构象 1 2 1 2 酶在有机溶剂中的一陛质 酶在有机介质中能够保持其整体结构以及活性中心结构的完整，因 此它能发挥催化功能。但是有机溶剂在很大程度上也会影响酶的催化活 力和稳定性。由于有机溶剂的存在改变了疏水相互作用的精细平衡，从 8 第一章绪论 而影响到酶的结合部位。酶和底物相结合的自由能受到影响，会对有机 溶剂中酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性和化学选择性产生影 响。 有机溶剂中酶的热稳定性和存储稳定性比在水溶液中高。v o l k i n ” 和t e w a a s “”认为有机溶剂中酶的热稳定性提高的原因是由于有机溶剂 中缺少使酶热失活的水分子，因此由水而引起的酶分子中天冬酰胺和谷 氨酰胺的脱氨基作用、天冬氨酸肤键的水解、二硫键的破坏、半胱氨酸 的氧化、辅氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活的全过程难以进行。 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性 ”1 。在水溶液中，酶和底物结合主要是依靠疏水相互作用；而在有机溶 剂中，底物和酶之间的疏水作用已不重要，酶主要是利用它和底物之间 的结合的自由能来加速反应。此外，底物和非水介质的疏水性直接影响 底物在二者之间的分配关系，从而影响催化反应的专一性和效率。 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，酶能够选择性地催化底物中 某个区域的基团进行反应。反应的位置选择性和非水介质的疏水性有 较好的相关性，研究者认为这是由于在酶的活性中心存在一个疏水性的 裂缝充当反应的位点”。此外，化学选择性也是非水介质中酶催化地 一个显著特点”1 。 1 2 2 水对有机溶剂中的酶催化反应的作用和影响 由于有机溶剂中的酶催化反应的场所是酶分子周围的水化层，因而在 有机溶剂中酶催化反应的活力和反应系统中的水含量有密切关系。系统 含水量包括与酶水合的结合水、溶于有机溶剂的自由水、固定载体和其 他杂质的结合水。与酶的结合水量是影响酶的活力、稳定性、专一性的 决定性因素。要成功地利用非水介质中的酶催化反应，控制与酶结合的 水量和水与酶结合的位置是关键。 1 2 2 1 有机溶剂中水对酶的作用 在非水介质中，水含量的微量差别会导致酶催化活力的较大改变。水 直接或间接参与酶天然构象中所有的非共价键相互作用，包括氢键、静 电作用、范德华力和疏水相互作用等。此时水充当酶结构的“润滑剂”， 酶需要少量的水保持其活性所必需的三维构象状态。水影响蛋白质的结 构完整性、活性位点的极性