（细胞生物学专业论文）rb和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究.pdf

中山人学坝i ：学位论文r b 和j e 它胎盘发育相关基嗍舟小鼠者珠前胚胎中的表j 厶研究吴超 r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的 表达研究 专业：细胞生物学 硕士生：吴超 导师：刘林教授 摘要 孤雌发育( p a r t h e n o g e n e s i s ，p a ) 胚胎是在没有精子的参与下，通过激活卵 子发育而来的。由于胎盘发育不良，这类胚胎通常在怀孕中期时死亡。相比较之 下，由j 下常受精2 细胞期胚胎电融合发育而来的四倍体( t e t r a p l o i d ，t r ) 胚胎 在着床后则表现为胎盘发育过度。因此，p a 和t r 胚胎可作为理想模型以研究 调控内细胞团( i c m ) 、滋养层( t e ) 分化和胎盘形成的分子机制。但是，这两 类胚胎中t e 的分化异常是否在着床前阶段已经存在尚未清楚。本论文对一个已 知的影响t e 分化的基因，c d x 2 ，在p a 和t r 胚胎中进行研究，以观察p a 和 t r 胚胎在着床i j i 阶段的分化情况是否异于正常受精胚胎。利用免疫荧光的方法， 我们发现f 常受精胚胎中，c d x 2 蛋白桑椹胚期之前没有表达，而在桑椹胚外层 细胞和囊胚的t e 细胞核中表达。p a 和t r 囊胚中该蛋白的细胞内定位情况与正 常受精囊胚中的一致。应用荧光定量p c r 的方法，我们发现，与讵常受精囊胚 相比，c d x 2 的m r n a 表达量在p a 囊胚中有轻微下调，而在t r 囊胚中显著上 升。这些结果证明了c d x 2 在t e 分化的过程中确实起着十分重要的作用。 我们进一步对几个调控细胞g 1 期，同时也可能与胎盘发育相关的基因( 包 括，r b 、e 2 f i 、c y c l i ne 和e 2 f i ) 在着床i j i 胚胎中的表达进行了研究。结果发 现，r b 蛋白表达于1 细胞期和2 细胞期胚胎的细胞核中，而从4 一细胞期胚胎到 桑椹胚的细胞核中没有表达，直到囊胚期才重新发现该蛋白于细胞质内表达。 r t - p c r 的结果也证实了免疫荧光结果的可靠性。p a 和t r 囊胚中r b 蛋白的细 胞内表达情况与正常受精囊胚相似，即均为细胞质内表达，细胞核中无表达。对 h d a c l 的研究发现，该蛋白在1 细胞期和2 细胞期胚胎中没有表达，从4 细胞 开始直到囊胚都在细胞核内表达，并且其在有丝分裂过程中与染色体结合。在 p a 和t r 囊胚中，该蛋白的表达情况与正常受精囊胚无明显差别。然而通过荧 光定量p c r 的方法，我们发现，r b 的相对表达量在p a 和t r 囊胚中较正常囊 胚显著上升，其它三个基因则为显著性下调。综合上述结果，我们得出以下结论； 尽管蛋白的细胞内定为情况相似，p a 胚胎胎盘发育不良和t r 胚胎胎盘发育过 度可能与这两类胚胎在囊胚阶段c d x 2 。r b ，h d a c l ，e y c l i nea n de 2 f i 等基因的 表达异常有关。本论文的数据为进一步探明胎盘发育缺陷的起因、人类不孕和克 卜 中山人学坝i 学位论文r b 年l jl 它胎盘发育相关皋陋m 小鼠若珠前】f i = 胎中的表达圳究 是超 隆胚胎的研究等提供了参考。 关键词：小鼠着床前胚胎，滋养层，c d x 2 ，r b ，分子机制 - i i - 中山人学坝i ：学位论文r b 和j t 它胎盘发育相关摧洲靠孙鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 e x p r e s s i o np a t t e r n so fr ba n do t h e rp l a c e n t ar e l a t e d g e n e si nt h em o u s ep r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s m a j o r ：c e l lb i o l o g y n a m e ，uc h a o s u p e r v i s o r ：p r o f l i u l i n a b s t r a c t p a r t h e n o g e n e t i c ( p a ) e m b r y o sa r ed e r i v e df r o ma c t i v a t i o no fo o c y t e sw i t h o u t i n v o l v e m e n to fs p e r ma n du s u a l l ya b o r ta r o u n dm i d g e s t a t i o nd u et oh y p o g e n e t i e p l a c e n t a b yc o n t r a s t ，t e t r a p l o i d ( n ue m b r y o st h a tc a nb ed e r i v e df r o mf u s i o no f 2 - c e l lb l a s t o m e r e ss h o w 锄o v e r g r o w n p l a c e n t ad u r i n gp o s t i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n t p aa n dt re m b r y o sc o u l dp r o v i d ea na p p r o p r i a t em o d e lt os t u d ym e c h a n i s m s c o n t r o l l i n gd i f f e r e n t i a t i o no fi c ma n dt ea sw e l la sp l a c e n t af o r l l a t i o n i tr e m a i n s n n k n o w nw h e t h e ra b e r r a n td i f f e r e n t i a t i o no ft ea l r e a d yo c c u r si nt h e s ee m b r y o sa t t h eb l a s t o c y s ts t a g e w ei n v e s t i g a t e dw h e t h e re x p r e s s i o no fc d x 2 ak n o w ng e n e r e l a t e dt ot ef o r m a t i o n i np aa n dt re m b r y o sd i f f e rf r o mn o r m a l l yf e r t i l i z e d e m b r y o sd u r i n gp r e i m p l a n t a t i o nd e v e l o p m e n t u s i n g i m m u n o f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y , w ef o u n dt h a tc d x 2p r o t e i nd i dn o te x p r e s su n t i lm o r u l as t a g e c d x 2w a s r e s t r i c t e di nt h en u c l e io f o u t e rc e l l si nt h em o r u l aa n dt h et r o p h e c t o d e r m ( t e lc e l l si n b l a s t o c y s t sf r o mn o r m a l l yf e r t i l i z e de m b r y o s s i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r no fc d x 2 p r o t e i nw a sf o u n di n p aa n dt re m b r y o s b yq u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c r p a r t h e n o g e n e s i se x h i b i t e ds l i g h t l yd e c r e a s e de x p r e s s i o no fc d x 2w h e r e a st e t r a p l o i d e m b r y o ss h o wi n c r e a s e de x p r e s s i o no fc d x 2 c o m p a r e dt on o r m a lf e r t i l i z e d b l a s t o c y s t s ，f u r t h e rs u g g e s t i n gt h a tc d x 2e x p r e s s i o np l a y sar o l ei nt h ed i f f e r e n t i a t i o n o f t r o p h e c t o d e r m f u r t h e r m o r e w ea n a l y z e de x p r e s s i o no fg e n e st h a ta r ec r i t i c a lf o rg le e l lc y c l e c o n t r o la n dp o t e n t i a l l yr e l a t e dt od e v e l o p m e n to fp l a c e n t a , i n c l u d i n gr b 。h d a c l ， e y c l i nea n de 2 f i r bp r o t e i nw a sf o u n di nt h en u c l e io fl - c e i la n d2 - c e l le m b r y o s b u tw a su n d e t e c t a b l ei nt h en u c l e io f4 - e e l lt om o r u l as t a g ee m b r y o s y e t r b e x p r e s s i o nw a sf o u n da g a i ni nb l a s t o e y s t sa n dw a sl o c a l i z e di nt h ec y t o p l a s mi n s t e a d o f n u c l e i p ac l e a v a g ee m b r y o sa n dt rb l a s t o c y s t se x h i b i t e de x p r e s s i o nd a 仕e i l lo f r b s i m i l a rt ot h o s eo ff e r t i l i z e de m b r y o s f u r t h e r m o r e h d a c ld i dn o te x p r e s si n1 a n d 2 c e l le m b r y o s a n dl o c a l i z e dt ot h en u c l e if r o m4 - e e l lt ob l a s t o c y s ts t a g e h d a c l w a sa s s o c i a t e dw i t hc h r o m o s o m e sd u r i n gm i t o s i s p aa n dt rb l a s t o e y s t sa l s o e x h i b i t e de x p r e s s i o no fh d a c li l lt h en u c l e i n oo b v i o u sd i f i e r e n tf r o mf e r t i l i z e d b l a s t o c y s t s q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r d e m o n s t r a t e dt h a tr e l a t i v eq u a n t i t yo fr bw a s h i 曲e ri nt h ep aa n dt rt h a ni nf e r t i l i z e db l a s t o c y s t s i nc o n t r a s t , e x p r e s s i o no f h d a c l e y c l i nea n de 2 f 1w e r es i g n i f i c a n t l yr e d u c e di np aa n dt r t h a ni nf e r t i l i z e d 中山人学坝l 学位论文r b 和j c 它胎盘发育相关早订外鼠着睐前肝胎中的表哒研究 是超 b l a s t o c y s t s t o g e t h e r , t h ea p l a s i ao fe x t r a e m b r y o n i cs t r u c t u r e si np a r t h e n o g e n e s i s e m b r y o sa n dt h eo v e r p r o l i f e r a t i o no ft e t r a p l o i dp l a c e n t am i g h tb er e l a t e dt o d i f r e r e n t i a le x p r e s s i o no fc d x 2 ，r b ，h d a c l ，c y c l i nea n de 2 f 1t h a to c c u r sa tt h e b l a s t o c y s ts t a g e d e s p i t et h em o r p h o l o g i c a ls i m i l a r i t i e sa m o n gp a 。t ra n df e r t i l i z e d e m b r y o s t h e s ed a t am a ya l s oh a v ei m p l i c a t i o n si nu n d e r s t a n d i n gd e f e c t i v ep l a c e n t a d e v e l o p m e n ta n df e t a l l o s si ni n f e r t i l i t yp a t i e n t sa n dc l o n e da n i m a l s k e yw o r d s ：m o u s ep r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s ，t r o p h e c t o d e r m ，c d x 2 ，r b ，m o l e c u l a r m e c h a n i s m i v 中山大学硬士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 第1 章前言 1 小鼠着床前胚胎发育概述 小鼠的着床前( p r e i m p l a n t a t i o n ) 胚胎发育时期是指从卵子受精开始一直到 胚胎着床( i m p l a n t a t i o n ) 前的一段时期。以交配后天数( d a y sp o s t c o i t u m ，d p c ) 计算，这一段时期又可以具体划分为以下几个时期： 1 ) 受精( f e r t i l i z a t i o n ) ：0d p c ，受精后第二极体捧出，精子的细胞核解体， 形成雄原核。至此，两原核形成 2 ) 2 一细胞期( 2 一o e n ) ：id p c ，合子基因激活( z y g o t i cg 胁ea c t i v a t i o n ，z g a ) 启动，胚胎中原来来自于母体的m r n a 和蛋白质逐步消耗殆尽，胚胎开始合成自 身的m r n a 和蛋白质 3 ) 4 8 细胞期( 4 8 一c e l l ) ：1 5 2 5 d p c 。在体积基本不变的情况下，胚胎 进行第二、第三次有丝分裂。8 一细胞形成后，由于受到c a ? 、e - c a d h c r i n 和胚胎 外一些分子信号的作用，卵裂球交得扁平，相互之间接触增加，胚胎骨架结构发 生改变，出现紧密化( c o m p a c t i o n ) 1 。 4 ) 桑椹胚期( m o r u l a ) ：2 5 3 5d p c ，包裹在内部的细胞将发育成为内细 胞团( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) ，外层的细胞将发育成为滋养外胚层( t m p h c c t o d c r m ， t e ) 。这是小鼠早期发育中的第一次分化事件。分化后的两类细胞各自具有不同 的命运，i c m 将发育成为胎儿和部分胚外( e x t r a - e m b r y o n i c ) 组织，而t e 则完全 发育为胚外组织。 5 ) 囊胚期( b l a s t o c y s t ) ：3 5 4 5 d p c ，由于受n a + i c - a t p 酶的和某些生长因 子的作用，n a + 在胚胎内外的浓度梯度发生变化，水分及一些可透过的小分子进 入胚胎内部，形成内含大量液体的囊胚腔 2 囊胚腔的形成使胚胎向分化状态 进一步过渡，i c m 和t e 至此真正形成。i c m 和t e 的分化涉及众多信号通路的 调控，一些关键性基因，如o c t 4 、n a n o g 和c d x 2 等，对于i c m 和t e 的正常分 化和多能性的维持，以及胚胎干细胞和滋养层干细胞的发育多能性的维持起重要 作用。 6 ) 孵出( h a t c h i n g ) ：4 5 - - 5 5 d p e ，囊胚由于进一步扩张和受到一些子宫分泌 的胰酶的消化作用，从透明带中孵出，准备着床。 7 ) 着床( i m p l a n t a t i o n ) ：5 5 d p e ，孵出的囊胚附着在子宫内膜上。 i 中山大学硕士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 2 调控i c l 和t e 分化的分子机制 囊胚期是小鼠早期发育中的一个关键时期，调控i c m 和t e 分化的分子机制 也成为研究的热点。利用从i c m 分离培养得到的胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e m c e l l s ，e s c s ) 和从t e 分离培养得到的滋养层干细胞( t r o p h c c t o d e r ms t e mc e i l s ， t s c s ) ，人们已经对调控这两个胚层分化的分子机制有了基本的认识。其中最受 关注的调控基因有o c t 4 、n a n o g 和c d x 2 。他们相互之间协同作用，保证了胚胎 能够朝着正确的方向进行分化。 含有p o u 结构域的核转录因子o c t 4 ( 也被称为0 c t 3 4 、p o u s f l ) ，最早表达 于8 , - - 1 6 细胞期的桑椹胚。其表达量在囊胚初期时增加，到晚期囊胚时下调并局 限于内细胞团( i c m ) 中 3 】。o c t 4 突变的小鼠可以发育到囊胚期，但是其内细 胞团并非真正意义上i c m ，因其不具多能性而只能朝着胚外滋养层的方向发育。 并且，由于缺乏真正的i c m ，这种胚胎的t e 细胞增殖也受到影响。所以这种老 鼠通常在着床前后死t z 4 l 。由此得知，o c t 4 对于内细胞团的特化( s p e c i f i c a t i o n ) 是必不可少的，同时对于t e 的正确分化和正常增殖也是必要的。在胚胎干细胞 中，o c t 4 的适量表达是细胞保持未分化状态和保持其多能性的一个标志，若o c t 4 表达量过高则会导致e s c s 向胚外内胚层( e x l r a e m b r y o n i ce n d o d e r m ) 分化【5 】。 虽然在早期胚胎发育和胚胎干细胞的研究中，o c t 4 被当作是i c m 和具有多能性 细胞的分子标志，但它并非唯一的调控开关，还有另外的基因与之相互协调以保 证多能性的维持。在e s c s 中，s o x 2 通常与o c t 4 结合成为复合体共同作用【6 】。 除此之外，还有一个最近发现的基因，n a n o g 也是与o c c 4 组成调控网络的成员 【7 】。n a n o g 是一个含有同源结构域的蛋白，人们发现，它可以在没有添加l i f 的条件下维持e s c s 的多能性 4 】。n a n o g 突变的胚胎虽然能够产生具有多能性的 细胞，但是这类胚胎立即会向着胚外内胚层的方向分化。这点与o c t 4 突变的胚 胎相似。尽管n a n o g 在发育中的起作用的时间相比o c t 4 晚了一点，但是，两者 对于多能性的维持都是必不可少的。o c t 4 、s o x 2 和n a n o g 三者共同组成了一个 复杂的调控网络( 图1 - 1 ) 。 在囊胚的正常发育中，还有保证t e 正确分化的关键调控基因c d x 2 与o c t 4 、 s o x 2 、n a n o g 等一起作用。c d x 2 也是一个核转录因子，其转录产物是小鼠中与 果蝇c a u d a l t y p e 同源的蛋白。在囊胚期，它只在t e 中特异表达。c d x 2 突变的 纯合胚胎不能着床，因为其没有正常的囊胚腔，滋养层无法维持 8 ，9 】。c d x 2 缺失的同时，囊胚外层细胞中o c t 4 和n a n o g 像在正常胚胎中一样下调，这些外 层细胞最终死亡。由此可推断，c d x 2 与o c t 4 和n a n o g 之间存在相互作用。有人 提出了一个可能的基因调控模式( 图1 2 ) ，桑椹胚时c d x 2 上调、o c t 4 下调的细 胞将发育成为t e ，c d x 2 下调、o c t 4 上调的细胞将发育成为i c m 。i c m 中g a t a 6 上调的细胞发育成为原始内胚层( p r i m i t i v ec n d o d c r m ，p e ) ，g a m 6 下调，n a n o g 皇些大学硕士学位论文_ r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 上调的细胞发育成为原始外胚层( e p i b l a s t ，e p i ) 。o c t 4 和c d x 2 之间的相互抑制 保证了桑椹胚的细胞毹朝着i c m 和t e 两个方向正确分化。同样的，g a t a 6 和 n a n o g 的相互抑制保证了i c m 能正确的分化为p e 和e p i 。 图1 - 1o c t 4 、s o x 2 和n a n o g 共同调控胚胎干细胞的发育多能性f l o 】 图1 - 2o c “、n a n o g 和c d x 2 调控小鼠胚胎发育模式图【1 1 1 3 孤雌发育胚胎和四倍体发育胚胎 大多数生命始于精子和卵子的结合，但是有些动物中存在不经过精子激活， 卵子就能自行发育成为个体的生殖方式，称之为“孤雌生殖”( p a r t h e n o g e n e s i s ) 。 然而，在哺乳动物中，成功的孤雌生殖似乎是不可能的。来自父方和来自母方的 基因组对于胎儿正常发育至出生都是同等重要，因为在配子形成过程中，表观遗 传的改变需要父母双方印记基因的平衡表达来实现。孤雌发育的小鼠无法发育到 出生，从形态学上分析，它们的胎盘发育不良；从基因水平上分析，由于缺乏来 r b 和【e 胎蛊发育相关挂n 小鼠右珠前肝胎中的表达”究兑超 自父方的基因组，它们的印记基因表达与币常发育小鼠胚胎相比出现异常 1 2 1 。 人为的对某些印记基因( 如h 1 9 ) 进行修饰之后，孤雌发育的小鼠可发育至出生 1 2 ，1 3 1 。 四倍体( t e r a p l o i d ) 发育胚胎是通过电激的形式将币常二倍体胚胎2 细胞期 的两个细胞的细胞核融合在一起，形成一个新的细胞核。融合后的胚胎与融合i j i 相比，染色体数增加了一倍，因此称为四倍体。有人在实验中发现，用四倍体胚 胎和二倍体胚胎互补( a g g r e g a t i o n ) 形成的嵌合体( c h i m e r a ) 中，四倍体细胞仅 存在于由原始内胚层和滋养层发育来的组织中，而在由原始外胚层发育来的组织 中，没有发现有四倍体细胞。这说明，四倍体胚胎可能更倾向于朝着胚外组织的 方向发展 1 4 】。由于四倍体胚胎的发育局限性，在胚胎干细胞的研究中它们通常 被作为嵌合体互补之用。四倍体胚胎无一能发育到出生，解剖发现，它们普遍存 在发育过度的胎盘 1 5 】。这与孤雌发育胚胎的胎盘发育情况恰好相反。因此，二 者是作为胎盘发育研究的理想材料。它们的早期囊胚可用于研究i c m 和t e 的分 化机理。 4 研究目的和意义 早期发育的分子调控机制越来越为人们所关注。但是多数实验集中于胚胎干 细胞上，而在着床前囊胚中进行的相对较少。其实作为体外分离培养的胚胎干细 胞，由于受到培养条件、环境和传代时机械分离或者酶消化作用的影响，它们的 生物学特性在一定程度上发生了改变。例如，在印记基因和核型方面，表现都与 原代或早代的细胞都有差别【1 6 】，与体内发育的情形相比可能区别更大。因此， 着床f j 胚胎作为与体内发育情形最为相近的实验材料，越来越为人们所重视，并 应用于对早期分化相关分子机制的研究中。另一方面，在早期胚胎中研究所得的 结论也可作为胚胎干细胞研究的参考或者补充。 在胚胎干细胞中，对于自我更新机制的了解已经得到初步的阐明，然而，在 早期胚胎中，其分化的机理尚处于探索阶段。本论文的研究主要集中于小鼠着床 前胚胎的t e 分化和细胞周期调控研究。利用两类胎盘发育迥然不同的胚胎进行 比较实验，将它们在着床后或者更晚时出现的胚外组织发育异常提i j i 至着床自口进 行研究。我们希望能够通过这些研究为目前尚未有明晰认识的t e 分化机制提供 一些参考，并期待能够进一步应用于生产方面，为某些存在胎盘发育缺陷的家畜 出生率和成活率的提高、人类生贿不孕及胚胎干细胞分化机制等提供一些理论上 的参考。 中山大学硬士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 第2 章c d x 2 基因在小鼠孤雌发育胚胎、四 倍体胚胎与正常受精胚胎中的表达比较 1 背景介绍 在小鼠的早期发育过程中，当囊胚腔形成时，第一次分化也同时发生了 这一事件的结果是，卵裂球由于所处位置的不同而被划分为两类一类紧密成团 的细胞称为内细胞团( i c m ) ，而在囊胚腔壁上的一层细胞称为滋养层( t e ) 在 囊胚之后的发育中，i c m 将发育成为胎儿；而t e 将发育成为胎盘，为胎儿提供 营养 关于i c m 和t e 分化的分子机制已经得到初步的阐明其中o c t 4 ( p o u 5 f 1 ) 编码一个含有p o u 区域的转录因子，这种转录因子对于i c m 的分化多潜能性至 关重要，在胚胎干细胞中，通常被作为细胞多能性维持的主要标志0 7 , 1 8 在 桑椹胚时期，o c t 4 在所有卵裂球中均有表达但是到囊胚腔开始形成时，o c t 4 的表达限制于i c m 中，而在t e 细胞中的表达量下调 1 9 】。o c t 4 缺失的小鼠胚胎 无法形成具有发育多潜能性的i c m ，由此猜测小鼠胚胎需要o c t 4 以保证正常 i c m 的形成同时维持其发育的多潜能性 1 7 】。还有实验证明，在胚胎干细胞中条 件性的抑制o c t 4 可导致细胞转变为c a x 2 阳性的t e 细胞 1 8 ，2 0 c d x 2 是一个具有c a u d a l - t y p e 同源区域的转录因子，它被认为是最早( 桑椹 胚) 参与t e 分化的转录因子。到了囊胚期，c d x 2 只在t e 中特异表达【8 】。c d x 2 突变的纯合胚胎中，不仅正常的囊胚腔无法形成，另外一个与t e 分化密切相关 的标志基因e o m a ；的表达量也出现相应下调。这类胚胎在着床前后停止发育并 死亡【8 ，9 】。在这类胚胎的异常的t e 细胞中还发现有o c t 4 和n a n o g 的表达。结 合这些实验，我们推测，o c t 4 和c d x 2 之间是直接或间接相互抑制的【7 ，1 8 】。在 小鼠的囊胚期，这两个转录因子不仅可作为细胞系的标志基因，而且对于i c m 和t e 的建立和维持是至关重要的 孤雌发育是指，卵子不经过精子的作用而发育成为成体。除非人工的对某些 印记基因进行修饰，否则小鼠的孤雌激活胚胎无法发育到出生 1 2 ，1 3 。对这类 胚胎进行解剖发现，它们的胎盘组织往往发育不良。导致这一现象的原因之一是 印记基因的表达发生异常 2 l 】。 然而，尚未有实验显示在早期( 从卵子到着床前) ，这类胚胎的t e 分化是 否已经出现异常。本实验采用免疫荧光的方法，对小鼠孤雌发育的若干阶段( 2 中山大学硕士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究吴超 细胞期，4 细胞期，8 细胞期，桑椹胚期，囊胚期) 分别进行c d x 2 检测。对照 组采用的是正常受精发育的和电融合之后的四倍体的胚胎。与正常受精发育的胚 胎相比，孤雌发育和四倍体胚胎在i c m 和t e 的发育上确实存在较为明显的差异。 进一步，通过荧光定量p c r 的方法，我们希望能够从表达量水平上作比较。结 果显示，与正常组相比，四倍体胚胎的c d x 2 的m r n a 表达量较正常受精胚胎显 著性井高( p l 小时) 的k s o m 中培养 2 1 2 2 收集孤雌发育小鼠胚胎： 注射h c g1 4 1 6 小时后将小鼠断脊椎处死，从壶腹部处取出m 期卵子。 在透明质酸酶中将颗粒细胞去除后移至h k s o m 中洗3 4 次终止酶的消化作用， 移至事先预热( l 小时) c a 2 + - f r e ek s o m 中激活后取出，移至k s o m 中培养。 2 1 2 3 收集四倍体小鼠胚胎： 正常受精发育的胚胎发育至2 细胞期，取出移至预热( l 小时) 的电融合 液中，平衡2 3 次( 2 - 细胞沉至电融合液的底部) ，移至电融合槽中融合。一般 在融合后5 分钟内可观察到融合后的1 细胞，若未融合，可将胚胎挑出进行再次 融合。 2 2 免疫荧光 2 2 1 材料： 抗体：r a b b i ta n t io c t - 4 ，p o l y c l o n a l ，i g g ( s a n t ac r u z , s c - 9 0 8 0 、m o u s ea n t ic d x 2 ， m o n o c l o n a l ，i g g ( z y m e d ，z m - 0 2 7 9 ) 、a l e x af l u o r5 6 8g o a ta n t i - m o u s e 似b a - 1 1 0 0 4 ) 、a l e x af l u o r5 6 8g o a ta n t i - r a b b i t ( m ea - 1 1 0 1 1 ) 、羊血清( g i b c o ， 1 6 2 1 0 - 0 6 4 ) 、多聚甲醛( s i g m a ，p 6 1 4 8 ) 、v e c t a s b i e l d ( v e c t o r l a b o r a t o r y ，h 1 0 0 0 ) 、 磷酸缓冲液p b s ( p h 7 4 ) 、t r i t o nx - 1 0 0 ( s i g m a ，x - 1 0 0 ) 、h o e c h s t3 3 3 4 2 ( m o l e c u l a r p r o b e s ，m 3 9 8 ) 2 2 2 方法： 中山堑硕士学位论文 r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究 吴超 将胚胎从培养液中取出，在预冷的p b s 缓冲液中洗2 3 次后置于多聚甲醛 中固定； 固定好的胚胎转入t r i t o nx - 1 0 0 中裂解1 小时后用羊血清封闭。一抗 中孵育过夜后于封闭液中洗3 次，转入二抗中孵育l 小时。二抗洗净后用h o e c h s t 3 3 3 4 2 对细胞核进行染色，最后将胚胎置于v e e t a s h i e l d 中封片保存。 2 3 反转录和荧光定量p c r ： 2 3 1 材料： r n a s e - f r e e n i b 龉( a x y g e n ，c a t # m c t - 5 0 - c ，m c t - 1 5 0 - o 、r n a s e - f r e et i p s ( a x y g e n ，c a t # t - 1 0 0 - w ，t - 2 0 0 - y ，t - 1 0 0 0 - b ) 、r n e a s ym i c r ok i tf q i a g e n e ， c a t # 7 4 0 0 4 ) 、f i r s ts t r a n de d n as y n t h e s i sk i t ( t o y o b o ，c a t # f s k q 0 0 ) 、r e a l t i m e p c rm a s t e rm i x ( t o y o b o ，c a t # q p k - 2 0 1 t ) 、p c rm i c r op l a t e ( a x y g e n ， c a t # p c r - 9 6 - a b c ) 、m i c r o a m po p t i c a la d h e s i v ef i l m ( a x y g ，c a t # 4 311 9 7 1 ) 2 3 2 仪器： g 即e a m p p c rs y s t e m2 7 0 0 、a b ip r i s m 7 9 0 0 h t 2 3 3 方法： 2 3 3 1r n a 提取：( 以下步骤均按照r n e a s ym i c r ok i t 的使用说明进行) 1 ) 将所收集的胚胎在r n a s e - f r e eh 2 0 做成的微滴中洗2 3 次，将培养液洗净。 2 ) 加入r l t 溶液7 5 p l ，涡旋1 分钟。 3 ) 加入c a r d e rr n a ( 4 n g i _ t 1 ) 6 1 t l ，混匀。 4 ) 加入7 0 乙醇7 5 i t l ，混匀。 5 ) 转入柱子， 8 ，0 0 0 9 离心1 5 秒，弃液。 6 ) r w l 溶液3 5 0 1 f l ， 8 ，0 0 0 9 离心1 5 秒，换新的2 m l 管子。 7 ) d n a s ei1 0 1 f l + 7 0 i _ dr d d 混匀，加到柱子中央的膜上，静置2 0 分钟。 8 ) r w l 溶液3 5 0 p l ， 8 ，0 0 0 9 离心1 5 秒，换新的2 m l 管子。 9 ) 加r p e5 0 0 1 1 1 ， 8 ，0 0 0 9 离心1 5 秒，弃液。 l o ) 加8 0 乙醇5 0 0 p l ， 8 ，0 0 0 9 离心2 分钟，弃液。 1 1 ) 换新的2 m l 管子，开盖，最大转速离心5 分钟，换新的1 5 m l 管子。 1 2 ) 换新的1 5 m l 管子，加1 5 u l r n a s e - f r e eh 2 0 至膜中央，盖盖子离心1 0 分钟。 1 3 ) 收集洗脱下来的r n a ，马上用于反转录或置于一8 0 可保存1 个月。 2 3 3 2 反转录： 体系：5 0u l r n 瓣f r e eh 2 0 ：1 5 5 p l 中山大学硕士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小曩着床前胚胎中的表达研究吴超 5 x r t b u f f e r ：1 0 0 m dn t p m i x t u r e ：5 0 1 1 1 r n a s e i n h i b i t o r 2 5 扯l o l i g od r ：2 a 叫 r n a ：1 2 o u l r e v e rt r aa c e ：2 5 u l 程序： 3 0 ，l o 分钟 4 2 ，2 0 分钟 9 9 ，5 分钟 4 0 ，5 分钟 囝反应结束后将产物取出，- - 2 0 长期保存 2 3 3 3 荧光定量p c r ： 体系：2 5 ，m s y b rg r e e nr e a l t i m ep c rm a s t e rm i x ( 2 均：1 2 5 p l p r i m e r ( m i x ，1 0 肛m ) ：1 o 肛l d d h 2 0 ：1 0 5 u l c d n a ：1 o u l o 程序： 9 4 ，5 分钟 9 4 ，3 0 秒i 5 6 ( 2 ，3 0 秒卜4 0 个循环 7 2 ，3 0 秒一j 国反应结束后将产物取出，2 0 长期保存；4 短期保存。 荧光定量p c r 所使用的引物信息 - 9 中山大学硕士学位论文r b 和其它胎盘发育相关基因在小鼠着床前胚胎中的表达研究 吴超 2 3 4 数据分析： 在进行荧光定量p c r 中最普遍采用的数据分析方法有两种：绝对定量 ( a b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o n ) 和相对定量( r e l a t i v eq u a n t i f i c a t i o n ) 。绝对定量通过将 p c r 反应信号与标准曲线的绘制相结合，以计算待测基因的拷贝数。相对定量 则是通过将基因在待测组中的反应信号与对照组中的反应信号相比以确定待测 组中该基因相对于对照组中的相对表达量。2 “虻方法是分析基因相对表达量的 简便方法。该方法假设每增加一个循环( c t 值增加1 ) ，产物数量增加一倍。在 p c r 的指数期得到的c t 值可反映起始模板的量。一个循环( c t _ 1 ) 的差异即相 当于起始模板2 倍的差异。但是内源参照物和待测基因的扩增效率基本一致是这 一方法的重要前提，因此内源参照物的选择和引物的设计非常关键。结合我们实 验材料的特殊性和实验要求，我们采用2 “吣方法对结果进行分析，并采用b a c t i n 作为内源参照物。具体计算方法说明如下： ac t = c t * 聪目一c t l b - a c t l n ( 2 - 1 ) c t = c t 符嚣组( p a t t r ) 一a c t 正常受精组 ( 2 - 2 ) 一a c t = a c t 正常受精组一c t 特测组( p a 囊t r ) ( 2 3 ) rq(相对表达量)=2“6q(2-4) 2 3 5 显著性差异统计： 显著性差异统计采用s t a tv i e w 统计软件进行统计学分析。在提取3 个不同 批次的样品进行实验后，对所得的数据进行相对表达量( r q ) 计算。将每组每 个基因在3 次实验中的r q 值输入到e x c e l4 0 表格中。打开s t a tv i e w 软件在 “o p e n ”中打开包含所需统计数据的e x c e l4 0 表格。在“a n a l y z e ”中选“n 哪 v i e w ”，在“c r e a t ea n a l y s i s ”中选“a n o v a ”，将“a l p h av a l u e ”设为5 ，即当 p 0 0 5 时具有显著性差异。点击“a n o v at a b l e ”，“m e a n st a b l e ”和“p o s th o e t e s t s ”，将分别生成3 个表，其中包括：各组中每个基因的r q 的平均值，标准 差，标准误和p 值。 3 结果 3 1 不同组胚胎2 一细胞率、9 6 小时囊胚率、孵出率比较： 三次重复实验( 实验一、实验二、实验三) 共统计了正常受精卵3 9 0 个， 其中8 4 3 6 在培养2 4 小时后到达2 一细胞期，7 4 4 1 在培养9 6 小时后到达囊 胚期，7 6 1 9 在培养1 2 0 小时时孵出；在3 4 7 个m i i 期卵子中，共8 9 3 3 在培 养2 4 小时后到达2 一细胞期，7 0 9 7 在培养9 6 小时时到达囊胚期，7 3 2 2 在 中山人学硕i ：学位论文r b 和j 它胎盘发育相关基闪缸孙鼠若床前胚胎中的表达研究吴超 培养1 2 0 小时时孵出；在电融合的3 2 3 个正常受精的2 一细胞期胚胎中，电击后 观察融合成功的共有3 0 9 ，电融合成功率达到9 5 7 ，其中6 2 3 7 到达囊胚， 6 2 7 9 在培养1 2 0 小时后孵出( 表2 4 ) 。四倍体胚胎的9 6 小时囊胚率和1 2 0 小时孵出率低于正常受精胚胎和孤雌发育胚胎。 表2 1 正常受精胚胎2 - 细胞率、9 6 小时囊胚率、1 2 0 小时孵出率 表2 2 孤雌生殖胚胎2 细胞率、9 6 小时囊胚率、1 2 0 小时孵出率 表2 - 3 四倍体胚胎2 细胞率、9 6 小时囊胚率、1 2 0