（细胞生物学专业论文）应用rnai技术抑制哺乳动物乙酰化酶p300基因的表达.pdf

摘要 r n a 丁涉( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 指体外人工合成的或体内的双链r n a ( d s r n a ) 存细胞内特异性的将与之同源的m r n a 降解成2 i n t 2 3 m 的小片段，使相应的基因沉 默。由于r n a i 作用于r n a 水平，故又称转录后基因沉默( p t g s ) 。近年来，在从真 菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物等多种生物中都发现有r n a i 现象。由于r n a i 相 对于传统的基因敲除，具有操作简单、周期短、效果明显等优点，人们利用r n a i 技术 丌展了广泛的基冈功能的研究。随着r n a i 技术在哺乳动物中应用的突破，越来越多的 研究者开始关注r n a i 技术在功能基因组学的研究和基因治疗研究中的作用。 组蛋白乙酰转移酶( h a t s ) 在基因的转录调节中起着重要作用，这种酶通过对核心 组蛋白进行乙酰化修饰来调节组蛋白的乙酰化水平，从而调控转录的起始，并由此介导 基因的激活或沉默。p 3 0 0 是一种重要的组蛋白乙酰化酶，在基因转录调控中起着重要作 用，它参与了r f ：多基因的表达调控。组蛋白的高乙酰化通常与基因活化有关，而组蛋白 的低乙酰化往往与基因活性的抑制密切相关。 我们验证了p 3 0 0 能够提高i l - - 1 2 启动子的活性，并且能够与转录因子p 6 5 协同作 用，明显提高i l 一1 2p 4 0 启动子启动的荧光素酶活性，另一方面，这种协同作用可以由 多种去乙酰化酶( h d a c ) 所抑制。为进一步研究p 3 0 0 在基因转录调控中的作用，我 们针对p 3 0 0 进行了r n a i 实验。 首先，我们构建了两个不同的s i r n a 表达质粒，但在r n a 和蛋白两个水平检测后， 结果发现p 3 0 0 的表达并没有明显地被抑制。随后，我们针对p 3 0 0 基因的m r n a 设计 了两段d s d n a ，采用r n a s el i i 体外酶切方法获得s i r n a s ，转染至2 9 3 t 细胞中诱发 r n a i ，r t - - p c r 结果证明其中一段d s d n a 转录、酶切所获得的s i r n a s 对p 3 0 0 基因 的表达有明显的抑制效果，为进一步研究p 3 0 0 在转录调控中的作用奠定了基础。 关键词：r n a i ；s i r n a ； r n a s ei l l ；p 3 0 0 ；i l - 1 2 ；p 6 5 ；h d a c a b s t r a c t t h ed s r n a ss y n t h e s i z e di nv i t r oo rf o r m e di nv i v o t r i g g e rt h es e q u e n c e d - s p e c i f i c m r n ad e s t r u c t i o na n dt h es u p p r e s s i o no fc o r r e s p o n d i n gg e n e b e c a u s et h ee f f e c to f r n a ii s o nt h el e v e lo fm r n a r n a ii sah n do fp t g sf p o s t t r a n s c r i p t i o ng e n es i l e n c i n g ) i nr e c e n t y e a r s ，r n a i h a sb e e nf o t m di no r g a n i s m sf r o me p i p h y t e st op l a n t s ，a n df r o mi n v e r t e b r a t e st o m a m m a l i a na n i m a l s c o m p a r e dw i t hg e n ek n o c k o u t ，r n a ii s s i m p l e ，t i m es a v i n ga n d e f f e c t i v e ，r n a ih a sn o w b e e nw i d e l yu s e di ns t u d i e so f g e n ef u n c t i o n w i t ht h eb r e a k t h r o u g h o f r n a i t e c h n o l o g yi nm a m m a l i a nc e l l s ，m o r ea n d m o r er e s e a r c h e r sb e g i nt oa p p l yt h er n a i i nt h es t u d i e so f f u n c t i o n a lg e n o m i c sa n d g e n et h e r a p y i ti sn o wc l e a rt h a tt h ea c e t y l a t i o nm o d i f i c a t i o no fc o r eh i s t o n et a i l si si n v o l v e di nt h e m o d u l a t i o no fc h r o m a t i ns t r u c t u r ea n df u n c t i o nt h a tl e a d st ot h ea c t i v a t i o n s u p p r e s s i o no f g e n ee x p r e s s i o n p 3 0 0i s a l l i m p o r t a n th a ta n dh a si m p l i c a t e di nt h er e g u l a t i o no fg e n e e x p r e s s i o n i n c l u d i n gm a n yc y t o k i n eg e n e s t h es t a t eo f h i s t o n ea c e u ，l a t i o ni sr e l a t e dw i t h g e n ee x p r e s s i o n t h i s s t u d yd e m o n s t r a t e st h a tp 3 0 0s t i m u l a t e d t h ea c t i v a t i o no f1 l 一1 2 p 4 0p r o m o t e r m o r e o v e r , p 3 0 0w a ss h o w nt ob ea b l et ow o r ks y n e r g i s t i c a l l yw i t l lt h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r p 6 5t oe n h a n c e t h ea c t i v a t i o no f p 4 0p r o m o t e ra n d t h i se f f e c tc o u l db ei m p a i r e db yh d a c s i no r d e rt of u r t h e ra n a l y s et h er o l e so f p 3 0 0i nt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ，w ea p p l yr n a i a s s a y f i r s t l y , w ec o n s t r u c t e dt w op l a s m i d so fs i r n a b u ti ts e e m e dt h a tn e i t h e rw a se f f e c t i v e t h e nw ed e s i g nt w os e q u e n c e so fd s d n a s a c c o r d i n gt ot h ep 3 0 0m r n a t h e d s d n a sw e r e t r a n s c r i b e db yt 7p o l y m e r a s ea n dd i g e s t e di n t os i r n a s b yr n a s e 1 1 1 t h e nt h es i r n a sw e r e t r a n s f e c t e di n t o2 9 3 tc e l l s t h er t - p c ra s s a y i m p l i e d t h a tt h e s u p p r e s s i o n o fp 3 0 0 e x p r e s s i o nt r i g g e r e db yo n eo ft h et w od s d n a si s o b v i o u s t h i sr e s u l tc o n t r i b u t e st ot h e r e s e a r c ho f p 3 0 0 sf u n c t i o ni nt h et r a n s c r i p t i o nc o n t r 0 1 k e y w o r d s ：r n a i ；s i r n a ； r n a s e i i i ；p 3 0 0 ；i l 一1 2 ；p 6 5 ；h d a c i i 独创性声明 本人卢明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 卅i 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：魏免 日期： 丝旦：圣! 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 一、文献综述 第一章、前言 ( 一)r n a 干涉研究进展 l 。1r n a 丁涉的发现 r n a 干涉( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 指体外人工合成的或体内的双链r n a ( d s r n a ) 在细胞内特异性的将与之同源的m r n a 降解成2 i n t 2 3 m 的小片段，使相应的基因沉 默“! ”。由于r n a i 作用于r n a 水平，故又称转录后基因沉默( p t g s ) 。 1 9 9 5 f ，康奈尔大学的s ug o u 博士”i 利用反义r n a 技术试图阻断秀丽新小杆线虫 巾控制胚胎对称性的p a r - - l 基因表达，在与之对照的注射相应的正义链实验中发现p a r 一1 基凶表达同样被特异性地抑制。1 9 9 8 年，华盛顿卡耐基研究院的a n d r e wf i r e 和马 萨诸塞大学医学院的c r a i gm e l l o ”+ ”对这一现象做了解释：难义链对基因表达的抑制是 由于体外转录制备的单链r n a ( s e n c eo ra n t i s e n s er n a ) 中混有少量的双链r n a ，若 将制得的单髓r n a 电泳纯化去除d s r n a ，再将正义或反义r n a 单链注射入线虫体内， 则不产生r n a i ，如果将正义，反义r i g a 链混合，退火，复性得到双链r n a ，再注射 到线虫体内，则可产生明显的r n a i 。由此可见，r n a i 是由双链r n a 引起的。髓后， 在真茼( 粗糙脉孢霉) ，植物( 拟南芥) ，无脊椎动物( 线虫，锥虫，涡虫，水螅等) 及 小鼠胚胎干细胞，卵母细胞及早期胚胎中也均发现存在r n a i 现象“。目前已知r n a i 广泛存在于从真菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。 1 2 r n a 干涉的机制 f 1 前，遗传学和生物化学的研究成果向我们揭示了r n a i 的机制，但其具体细节仍 需进一步研究。根据对线虫、果蝇和拟南芥的研究结果，提出了一种模型 8 , 9 , 1 0 1 ( 图1 1 ) ： 由r n a 病毒入侵，转座子转录，基因组中反向重复序列转录等所产生的d s r n a 分子在 细胞内被特定的的蛋白复合物识别，启动相关蛋白结合到d s r n a 分子上，其中 r d r p ( r n ad e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ) ) q qd s r n a 进行复制，产生足够数量的d s r n a ， 随后或同时，d i c e r i ”】核酸酶( r n a s ei i i 核糖核酸酶家族成员) 或d i c e r 核酸酶同源物将 d s r n a 剪切成2 l 2 3 ms i r n a ，3 端带有2 个碱基突出的粘性术端，57 为磷酸基团， 这结构对丁s i r n a 行使其功能是至关重要的。剪切位点是特异性，一般在u 处。然后， r n a i 特异性的核酸外切酶，核酸内切酶( r n a s ei l i | 亓j 源物) ，解旋酶，辅助识别同源 序列蛋白和其它一些蛋白与s i r n a 结合成r n a 诱导沉默复合体一一r i s c ( r n a i n d u c i n gs i l e n c ec o m p l e x ) 识别目标m r n a ，其中的反义链与目标m r n a 结合， 1 i f 义链则被置换出来。继而，r i s c 复合物中的r n a s e l i l ( 可能是d i c e r ) 在目标m r n a 与s i r n a 结合区域的中间将之切断。这样的过程多次发生后，个完整的m r n a 就被 降解成多个2 l 2 3 n t 的小片段，从而导致相应的基因表达沉默。在这1 过程中的多个步 骤都需要a t p ：kj s c 复合体的形成，s j r n a 与目标m r n a 的配对，目标m r n a 的切割。 另外在d s r n a 复制过程中，两条链的分离可能也需要一个依赖a t p 的r n a 解旋酶。 人工合成的s i r n a 在果蝇、线虫和哺乳动物细胞中也可诱导特异的基因沉默。这表 明d s r n a 的加工过程和随后目的m r n a 降解过程是可以分离的。s i r n a3 端各有两 个2 n t 碱基突出的黏性末端( 这一结构特征也证明了s i r n a 是由r n a s ei i i 产生的) ， 这种结构对于s i r n a 的引发是必需的。体外、体内实验均表明平端的s i r n a 使r n a i 作用人为减弱。这可能是由于黏性术端存在时，单链结合蛋白与之结合，避免了加工 d s r n a 的因子与之结合。 5 忑3 q 磁。忑蕊、9 q 邕殓一 蕊：勰八八 夕、nm c t 州e ot 删 h r n ah 图1 1r n a 干涉机制 1 3 r n a 干涉的特点 1 特异性抑制目的基冈。只有相对于某一基因的外显子的d s r n a j 能诱导该基因 的沉默，而相对于启动子或内含予序列的d s r n a 则无干涉效应。r n a i 只特异性 降解同源m r n a ，无关m r n a 的表达不受影响，染色体d n a 序列也末发现有异 常。 2 高效性。少量d s r n a 就可诱导大量的同源m r n a 降解，而且表趔可达到缺失突 变体的程度。表明存在信号放大机制”。 3 目标m r n a 切割位点的确定性。在r i s c 作用下，同源m r n a 被切割，切割位 2 点相差2 12 3 n t ，并且均分布在m r n a5 端与s i r n a 互补序列的第1 0 - - ll 位 之间。 4 具传播性。一个细胞发生r n a i ，其效忠可穿过细胞界线，引起临近细胞或整个 牛物体特异性r n a i 的发生。在线虫中，这种效应甚至可传递剑子代中”。目前 研究表明，序列特异性信号很可能是s i r n a ，因为2 1 2 3 n t 这样的长度足够产 生序列特异性，又小到非常容易在细胞间传递。 5 需要a t p 的参与。r n a i 效应是一个a t p 依赖的过程，d i c e r 将d s r n a 剪切成 2 1 2 3 n ts i r n a 过程和s i r n a 依赖的r i s c 复合物形成的过程都需要a t p 的参 与。 1 4r n a 干涉的生物学意义 r n a i 是生物普遍存在的r n a 水平上调控基因表达的机制，其最核心的生物学意义 在十监控异常的或者外源的遗传物质在机体内的水平，是一种原始的基因组对抗外来基 因表达的保护机制m n ”l ，i n h , tr n a i 也具有调控基因的表达的作用。r n a i 的生物学 意义具体体现侄以下方面： 1 防御病毒感染：d s r n a 是很多病毒的遗传物，即使是以单链r n a 作为遗传物质， 在其生命周期中也会出现特异性的d s r n a 。当病毒入侵后，诱发r n a i 效应， 封闭病毒复制和繁殖的必需基因。 2 维持基因组中转座子的稳定：多种模式生物研究表明，剔除了r n a i 相关基因则 导致异常的转座子活动，说明r n a i 具有防止转座了在基因组中异常转位的功 能。 3 清除片常的r n a ：r n a i 可以清除来自细胞核和细胞质中异常的或者无功能的 r n a ，从而发挥监视m r n a 的功能。 4 参与基因表达调控：拟南芥中，敲除d i c e r 相关基因可抑制胚胎的发育，推迟开 花时间，造成花的分生组织细胞分裂的无序调节。线虫中的e g o l 既参与 d s r n a 介导的r n a i 作用，又为线虫生殖细胞发育所必需。这些都表明r n a i 住生物发育中起基因调控的作用。 1 5r n a - t - 涉的应用 r n a i 提供了一种特异性抑制功能基因的简便方法，与传统的基因敲除技术相比， 其以下优l l ：( 1 ) 可以实现多基因突变。r n a i 可以利用同一基因家族的多个基因具有 段同源性很高保守序列这一特性，设计针对这一区段的d s r n a 。注射一种d s r n a 即 可产牛多个基因同时剔除的表型；也可以同时注射多种d s r n a 而将多个序列不相关的 基凼同时剔除。( 2 ) 通过对d s r n a 剂量的人为控制，可以实现基因功能1 i 剐程度地被 剔除。( 3 ) 通过导入带可诱导控制元件的d n a 质粒可以实现在发育的任意阶段抑制基因 的表达。( 4 ) r n a i 技术简单易行，成本低。由于线虫和果蝇的基因组全序列都已测定 完毕，而且线虫中已知基因的3 6 与人类的有明显的配对，其中包括许多与人类疾病有 3 关的基因。所以，目前在这两种牛物中r n a i 技术应用较为广泛。在线虫中，通过注射 体外合成的d s r n a ( 生殖腺注射、体腔注射、肠细胞胞内注射等) ，喂食”。能转录d s r n a 的大肠杆菌( 效应弱且可逆) ，甚至将线虫浸泡“于含d s r n a 的溶液中，都能达到r n a i 效果。a h r i n g e r 小组对线虫6 条染色体中的i 号染色体上2 7 6 9 个已知基因中的2 4 l6 个 进行了r n a i 研究，观测到3 3 9 个r n a i 表型，而h y m e n 小组对1 1 1 号染色体上2 3 1 5 个已知基因中的2 1 7 4 个进行了研究，观测到2 8 1 个r a i a i 表型。在果蝇的研究中，向 合胞体巾注射d s r n a ，在体外培养的细胞系s 2 的培养基中加入适量的d s r n a 以及转 入通过诱导可表达发卡结构的d s r n a 的质粒对果蝇中相关基因功能进行研究。在拟南 芥中，手要通过构建d s r n a 载体，利用农杆菌转染植物，研究拟南芥发育和生长中的 相关基因功能。 在r n a i 应用的初期，研究人员一直无法在哺乳动物细胞中获得特异性的r n a 干 涉效果。究其原因，是由于长琏d s r n a ( 超过3 0 b p ) 一方面激活d s r n a 依赖性蛋白激 酶p k r ，使通用翻译起始因予e l f 2 c c 磷酸化而失活，致使所有的m r n a 不能表达；另 一方面，长链d s r n a 激活2 ，5 腺苷台成酶r n a s el 途径，活化的r n a s el 非特异 性降解细胞内各种m r n a ，造成细胞凋亡。 随着对r n a i 机制研究的深入，发现r n a i 过程中关键性的成分是2 1 - - 2 3 b p 的 s i r n a ”l ，而非长的d s r n a 。因此，研究者尝试直接将s i r n a 引入到哺乳动物细胞中， 结果成功地引发的r n a 干涉 1 8 , 1 9 1 。这是由于长度为2 1 2 3 n t 的s i r n a 一方面足够引起 特异性的基因沉默，另一方面又不致造成细胞凋亡。 r n a i 已经应用于多种体外培养的哺乳动物细胞，研究相应基因的功能。在哺乳动 物中应用的核心是制备s i r n a ，围绕如何制备s i r n a ，目前主要有五种方法：分别是化 学合成s i r n a ；体外转录s i r n a ；体外r n a s ei i l 降解d s r n a 方法；构建s i r n a 表达 载体；p c r 获得s e c s 表达框。 化学合成s i r n a 方法对于研究者来说是省时省力的方法，可靠性也很好，但价格相 对昂贵。该方法根据目的基因的m r y a j 芋歹r j 筛选合适的s i r n a 序列，确定了模板序列后， 应用2 邻三异丙基甲硅烷基氧合甲基的化学法分别合成正义和反义链，再将两条链退 火形成双链s i r n a ”1 ：或者用快速r n a 亚磷酰胺和胸苷酸亚磷酰胺的方法合成s i r n a ， 然后进行去保护和凝胶纯化 6 。用此方法合成的s i r n a 在线虫、人和小鼠细魈系中 都成功诱发出特异性同源基因抑制，且未引起非特异性干扰素反应。 体外转录s i r n a ) 5 法”( 图1 2 ) 应用简便，相对化学合成所需费用低，并且抑制作用 稳定，目前已较广泛地应用于r n a i 实验，但对于大规模实验而占仍是比较费时的方法。 首先选择好靶序列，再针对每个s i r n a 合成的3 8 3 9 n t 的d n a 模板序列，其中前18 个核 岢酸互补于t 7 启动子序列，后2 0 2 1 个核苷酸对应于s i r n a 靶序列，之后将每个模板分 别和1 8 n t 的t 7 启动子寡核苷酸等量混合，退火，再加入t 7r n a 聚合酶及相应转录试 剂进行体外转录，即可得到丁f 链和反链r n a ，进行纯化后将二者等量混合退火获得 s i r n a 序歹0 。 4 璺 曼翟：东螬瞧稳n a ：一主竺篓兰! 兰釜= 。兰兰塑。d n a 垡一竺2 ：；罂竺竺兰童一r n a 。r 7p r o m d r i 工王兰j 鲤窖錾5d n a l a t r n da n n 脚e a 蟠l i n 。 。一一! 熙塞壁2 1 ； 舌葛 w - s i r n a 1 l r 鼍嚣纛鬈黧美意翟 一喜萝 c 点p 霹互墨裔裔互墨墨霹叁参一a a a a r i s “_ c “：。 图1 2 体外转录s i r n a 无论是化学合成方法，还是体外转录s i r n a 方法，都要求同时设计多个s i r n a 靶序 列口驯进行试错实验，无形中提高了实验的工作量。而r n a s e1 1 1 酶切d s r n a 的方法 2 4 , 2 5 1 ( 图1 f 3 ) 可以同时获得几十个各异的s i r n a ，大大提高了r n a i 实验的成功率。首先选 择一段目的基冈的靶序列，长度可以是几百b p 至上千b p ，以5 端带有t 7 启动子的引物 p c r 扩增获得该序列，随后体外转录获得d s r n a ，利用改造过的r n a s ei l i ( 如a m b i o n 公司开发i s h o r t c u t r n a s e i i i ) 将d s r n a 酶切成2 1 2 3 b p 的s i r n a 混和物) ，用于转染细 胞。该方法提高了r n a i 的成功率，但无法获女h r n a i 是由哪个s i r n a 诱发的，因此不适 用于长期稳定地进行r n a i 研究。 $ 外 采 卜” 2 0 0 一l o i ) o b pd s r n a f t 外蜉 刀 = 皇一= = 喾嚣一 一一2 0 b ps r n a 一 图1 3r n a s e l 1 酶切d s r n a 获得s i r n a s 构建表达s i r n a 载体的方法1 2 6 , 2 7 , 2 扪町以获得相对长期稳定的r n a i 效应。目前应用质 粒和病毒作为s i r n a 的载体都成功地在哺乳动物细胞中获得r n a i 。使用质粒作为载体， 通常用r n a 聚合酶i i i 的启动子启动编码s i r n a 序列，这是因为r n a 聚合酶i i i 启动子本身 在体内就是启动小r n a 的转录，而且r n a 聚合酶的转录易于被特定的序列所终止 2 9 3 0 1 。早期应用r n a 聚合酶1 1 1 分别转录出s i r n a 的j 下义链和反义链，在细胞内退火形成 有功能的s i p , x n i a 2 6 - 2 7 1 。j 吾来发现将目的基因的4 5 5 0 m e t 的发夹结构r n a 转染到细咆， 并在细胞内被加工成有活性的s i r n a l 2 1 1 。病毒载体也可用于s i r n a 表达，如腺病毒 ( a d e n o v i r u s ，2 1 、腺病毒相关病毒 3 3 l ( a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s ) 、逆转录病毒( r e t r o v i m s ) 3 4 、 慢病毒l e n t i v i r u s ) 1 3 5 1 等。相对于质粒载体，病毒载体可以直接高效率的感染细胞，避免 由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。 p c r 获得s e c s ( s i r n ae x p r e s s i o nc a s s e t t e s ) 框架方法l 是通过p c r 获得s i r n a 表达 模板，并直接将模板转入细胞的制备s i r n a 的方法。s e c 中包括r n a 聚合酶i i i 启动子、 发卡结构d s r n a 和转录终止信号等元件。该方法无需片段克隆和测序。 卜述五种方法各有优缺点( 见表1 1 ) ，研究者应根据实际情况选择适合的方法。 州 吣 o 卜 召l 品懈 表1 1 五种制各s i r n a 方法的比较 r n a s e i l l 降解s i r n a 表达 比较项目化学合戍体外转录p c r 表达框 d s d n a载体 2 1 一m e r2 9 一m e r 转录模板 5 5 6 0 m e r 5 0 一m e t 材料需求 r n a o l i g o sd n ao l i g o s( 2 0 0 1 0 0 0 b p ，两 d n a o l i g o s d n a o l i g o s ( 一对)( 一对)侧带t 7 启动子)( 一时)( 一对) 全部制备 2 4 小时+ 1 天+ 转录模板 5 天以上+ 6 小时+ ? 合执所4 天一2 周d n a o l i g o 制备时间 d n a o l i g o d n a o l i g o 合 成时间 需时间合成时间合成时间 个人操作几乎不需 中等中等多中等 所需时问要 是否需要 验证和寻 需要需要不需要需要需要 找最有效 的s i r n a 能否标记 能能能不能不能 s i r n a 转染相对 好好好 差差 难以程度 可筛选性 不可以不可以不可以可以不可以 能否用于 不可以不可以不可以 可以 不可以 长效抑制 能否大规 模制备 可以有限 有限 可以 有限 检测总体 转染效率 不可以不可以不可以可以不可以 相对费用高中等 低 中等中等 1 6r n a 干涉研究的前景 1 6 1 r n a i 将成为研究基因功能的新工具 r n a i 为后基因组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的应用平台，用于 缔构基因的功能研究的应用【1 7 1or n a i 技术在线虫、果蝇、真菌、植物等生物基因组功 能的研究中已经比较成熟，在较高级的哺乳动物和人类基冈的功能研究中，利用r n a i 技术得到的基因功能表型与以往使用基因敲除法获得的信息是一致的。r n a i 还可用于 细胞周期调控、代谢、信号传导、膜转运以及d n a 损伤反应、转录、甲基化等多种方 面的基因功能研究。 1 6 2 r n a i 将成为基因治疗的有效手段 作为基因治疗的工具，r n a i 既高效特异，又简便易行。l e e 和c o b u m 等分别报道 了使用原病毒d n a 和s i r n a 的表达载体共转染被h i v 2 1 感染的细胞株，结果有效阻止 7 h i v 2 1r e v 或t a t 基因的转录【3 7 】，提示r n a i 可能成为防止h i v 2 1 感染的一种有效手段。 存肿瘤治疗方面，l i n s 1 等对前列腺癌的研究以及m i l n e r 教授对宫颈癌的研究均表明 r n a i 技术能侄哺乳动物巾的成功应用。 从2 0 0 0 年起，s c i e n c e 杂志已经连续3 年将r n a 方面的研究进展列入当年世界十 大科技突破。r n a i 技术体系的建立，为人类基因功能研究和疾病基因治疗丌辟了一个 革命性的新领域。相信该技术在在未来将会具有更加广阔的发展前景。 ( 二)乙酰化酶p 3 0 0 研究进展 2 1 p 3 0 0 的结构 p 3 0 0 最初是由于它可与腺病毒e 1 a 结合蛋白( c r e b ) 结合而被发现的”“。p 3 0 0 的基冈在多细胞生物中是高度保守的，在n d i ：t l 动物中同样是高度保守。p 3 0 0 的同源物 在果蝇和线虫中存在，最近发现，拟南芥菜中亦有p 3 0 0 的类似物。然而，在原核生物 和酵母中还没有发现p 3 0 0 的同源物。人类p 3 0 0 有2 4 1 4 个氨基酸，其结构如图1 4 i - ji j1 。_ j i ，。，- r x f ji h t ?crlut 叫v r rr ，r 一11 小x t i a rn b o r o l o 心m n i ? m v r qs v ij l i t - i p hfls h 【。r p p 1 。_ j i b p i ，0 a d a 2i l o t t l o l o a y l _ jl j t 1 嚣阳c 一1 尊v | l jt “i 口计 n a p 。 e 2 r 一1 】l 、。_ j t b p j u n t f l f j，j y r 一1 l j m y 图1 4p 0 的结构。 l at h a n g u ep 3 0 0 c b pp r o t e i n s ：h a t sf o rt r a n s c r i p t i o n a lb r i d g e sa n ds c a f f o l d sjc c l ls c i 2 0 0 1 ，j1 4 ：2 3 6 3 2 3 7 3 p 3 0 0 土要有四个保守区( 1 ) 澳区，普遍存在于哺乳动物的h a t 内；( 2 ) 三个c y s h i s 区( c h i ，2 和3 ) ：( 3 ) 一个k i x 区；( 4 ) 一个a d a 2 同源区，与酵母转录辅激活物 a d a 2 p 高度相似。 2 2p 3 0 0 的功能 p 3 0 0 是遍在表达的全_ 荀转录辅激活子，在细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多 一 黼燃一鼍主 种生理过程中起重要作用。p 3 0 0 作为组蛋白己酰转移酶( h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e h a t ) ， 能催化乙酰辅酶a 中的乙酰基转移到组蛋白n 二端赖氨酸残基的e 一氨基上，从而削弱了 d n a 与组蛋白之间以及核小体之间的相互作用，使转录因子易于与d n a 结合，并有助 于染色质改构以及r n a 聚合酶通过核小体序列，从而促进转录。 目前为止发现p 3 0 0 可参与大量的信号介导途径，从这点来说，它们是作用广泛 的转录调节子。 2 3p 3 0 0 的作用机制 现在p 3 0 0 蛋白足作用比较广泛的通用转录整合子。目前认为它们可通过许多机制发 挥作用。主要有转录机器桥梁作用、组织多蛋白复合物的支架作用和依赖于乙酰化的转 录调节作用( 图1 5 ) aab r i d g e 图1 5p 3 0 0 作用机制模型 l at h a n g u ep 3 0 0 c b pp r o t e i n s ；h a t sf o rt r a n s c r i p t i o n a lb r i d g e sa n ds c a f f o l d s jc e l ls c i2 0 0 11 4 ：2 3 6 3 - 2 3 7 3 ( 1 ) 转录机器桥梁作用 r n a 聚合酶l i 转录起始既需要序列特异性的启动子增强子结合的转录因子，也需要 基本转录机器。除非二者问能直接相互作用，不然就需要一个桥梁来将转录因了和基本 转录机器联系起来。现已知p 3 0 0 可与许多转录因子和基本转录机器中的成分相作用，包 括t b p 、t f i i b 、t f i i e 、t f i i f ”“。，因此，p 3 0 0 p 7 能作为一个桥梁发挥作用。 ( 2 ) 组织多蛋白复合物的支架作用 9 p 3 0 0 蛋臼可能将不同的辅凶予蛋白组装进一个多成分的辅激活子复合物中“”4 。通 过为转录辅囚子组装提供骨架，p 3 0 0 可能使这些因子在局部的转录环境下浓度相对升 高，这样方便了蛋闩质一蛋白质问利蛋白质一d n a 间的相巨作用“1 。 ( 3 ) 依赖于乙酰化的转录调节作用 核心组蛋白尾部的多个乙酰化位点与转录活性有关，低乙酰化通常与转录抑制相 芙，而高乙酰化与转录激活相关”。“。乙酰化可能具有如下作用：( 1 ) 由于中和了赖氨酸 的i 卜电荷，这样促进了转录因子与d n a 的接近“。“1 ；( 2 ) 降低了核小体间的相互作用， 使染色质高级结构变得不稳定“”1 ；( 3 ) 促进r n a 聚合酶对于核小体串珠的接近”“6 。 生化和遗传实验证明组蛋白尾部是乙酰化的主要作用靶，它在转录调控中起重要作用 8 ) m ) 二、论文的研究目的与意义 p 3 0 0 足一种具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录辅因子，可将乙酰基转移到赖氨酸的 c n 盯上，参与许多生理过程，包括发育、分化和凋亡等。 但由于p 3 0 0 在生物发育过程中的重要作用，很难利用基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) 方 法研究p 3 0 0 的生物功能。r n a i 技术的出现很好的克服了基因敲除的这一缺陷，r n a i 呵以在生物发育的任何阶段抑制目的基因的表达，用来研究目的基因的功能。 本文拟在课题组现有工作的基础上进一步研究p 3 0 0 、转录因子p 6 5 与i l 一1 2 基因表 达的关系，并进而确定去乙酰化酶在i i 。一1 2 基因表达中的作用。 鉴于目前没有关于p 3 0 0 的有效的s i r n a 序列的报道，我们拟针对p 3 0 0 利用r n a s e j i i 酶切方法进行了r n a i 实验，为我们进一步研究p 3 0 0 乙酰基转移酶在基因转录调控 中的作用奠定了基础。同时也为我们进一步筛选有效的s i r n a 序列缩小了范围。 第二章、实验材料与方法 一、实验材料： ( 一) 细胞培养及其培养试剂 1 2 9 3 t 细胞，人胚l 肾细胞，购自上海细胞研究所细胞库 2i m d m 培养基，购自g i b c o 公司 3f b s ，天津濒洋生物制品公司 4 胰蛋九酶，购自a m e r e s c o 公司 ( 二) 原始质粒 1 野生型p 3 0 0 ( p 3 0 0 w t ) 载体，由c h e o n g h e e 馈赠( u n i v e r s i t yo fm i c h i g a nm e d i c a l s c h o o l ，a n na r b o r ) ， 2 p 6 5 表达载体，由r i c h a r dm p o p e ( n o r t h w e s t e r nu n i v e r s i t ym e d i c a ls c h o o l 。c h i c a g o ) 馈赠。 3 去乙酰化酶h d a c l 6 表达载体，由g r e e n ew c ( u n i v e r s i t yo fc a l i f o m i a s a n f r a n c i s c o ) 馈赠。 4i l 1 2p 4 0 - p r e p 4 报告基因质粒，实验室保存 ( 三) 细胞转染及体外r n a 转录试剂 1 l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ，购自l n v i t r o g e n 公司 2t 7r n a p l o y m e r a s e ，购白b i o l a b s 公司 3s h o r t c u tr n a s ei i i ，购自b i o l a b s 公司 4 r c t er a tp ，r u t p ，r g t p ，购自p r o m e g a 公司 5 p v r 1 0 1 2 p 3 0 0 质粒：含p 3 0 0c d n a 全长序列，本实验室保存 ( 四) r t - p c r 相关试剂 1 r n a 提取试剂盒，购自p r o m e g a 公司 2 r t - p c r 试剂盒，购自p r o m e g a 公司 ( 五) 实验设备及仪器 实验中所捌辛要仪器有超净工作台( a i rt e c h ，苏州净化仪器厂) 、台式高速冷冻离 心机( h e t t i c h 一1 6 r ) 、电泳仪及电转移装置( b i o 胁d ) 、倒置显微镜( o l y m p u s ) 、c 0 2 培养 箱( t h e r m of o m a a 3 1 1 1 ) 、图像处理仪、p c r 仪、t u r n e r d e s i g n s t d 2 0 2 0 光度计。 二、实验方法 ( 一) 质粒的大量制各 1 1 试剂 1 l b 培养基1 0 0 0 m l t y p e t o n e 1o g y e a s te x t r a c t 5 9 n a c i 5 9 1 2 l 2 0 m i n 2 s o l u t i o ni1 0 0 0m l 2 5m m t r i s - c 1 ( p h8 0 ) 1 0 m m e d t a ( p h8 0 ) 3 s o l u t i o ni i5 0 0m l 0 2m n a o h 4 9 n a o h l s d s 5 9 s d s 2 5m l1 。0m t r i s c 1 ( p h8 0 ) 2 0 m l 0 5 m e d t a ( p h8 0 ) 1 0 s d s 储液2 n n a o h 储液现用现配 4 s o l u t i o nl i i5 0 0 m l p h 4 8 5 0 5 m k a c3 0 0 m l 冰醋酸5 7 5 m 1 无菌水1 4 2 5 m l 5 5 ml i c i5 0 0 m l 1 0 6 9l i c i 6 5 mk a c 5 0 0 m l 2 4 5 3 5 9k a c 7 1 3 p e g 8 0 0 0 含1 6 mn a c i 1 0 0m l p e g 8 0 0 0 1 3 9 n a c