（蔬菜学专业论文）马铃薯青枯病抗性相关基因的分离及其功能分析.pdf

摘要 马铃薯( s o l a r i u mt u b e r o s u ml ) 是继小麦、玉米、水稻之后的世界第四大作物，在世界的食 品安全体系中具有重要的作用。由青枯病菌r a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m 引起的马铃薯青枯病是仅次于 马铃薯晚疫病的世界性病害，目前尚没有行之有效的化学药剂防治办法，严重影响了马铃薯的生 产。培育抗病品种已成为防治马铃薯青枯病的根本手段。长期以来人们对马铃薯青枯病的研究和 探讨主要集中在病菌的病理学机制、分类学、流行病学等方面，而在马铃薯本身的抗病遗传特性、 马铃薯青枯病抗性相关基因的种类、数量及其表达调控途径等方面还不清楚。本研究旨在通过马 铃薯青枯病抗性相关基因的分离和分析，初步揭示参与青枯病抗性的基冈种类与数量，为进一步 深入开展青枯病的抗病机制研究及利用抗性资源进行抗病品种选育奠定基础。主要研究结果如 下： 1 建立了快速可靠的马铃薯抗青枯病鉴定新方法。并筛选出了1 3 份抗或高抗青枯病和高感 青桔病的二倍体材料。采用传统方法和改进方法对马铃薯二倍体c e 和e d 群体、番茄抗病和感 病品系进行了青枯病抗性鉴定和评价，建立了更加简便快速、经济和可重复的病菌鉴定新方法一 茎枝菌液共培养法，该方法对于茄科作物的种质资源抗病性评价和筛选，特别是对于病菌诱导产 生抗性的抗( 感) 病植株的快速鉴定及其幼苗的先期快速筛选具有重要意义。同时利用该方法筛 选出了6 份抗或高抗青枯病材料和7 份高感青枯病材料( 见表2 4 ) ，其中6 个材料( 如商抗青桔 病基因型e d l 3 、高感青枯病基因型e d 2 5 等) 已被用于亲本构建作图群体，为今后开展马铃薯 的抗病遗传研究奠定了基础。 2 建立了富集差异表达基因的s s h 文库并获得了4 4 个病菌侵染早期马铃薯抗青枯病相关基 因。以抗青枯病二倍体基因型e d l 3 为材料，青枯病菌小种3 号p 0 4 1 为供试菌株，利用抑制差减杂 交( s s h ) 和微阵列杂交筛选技术相结合，获得了1 2 3 个差异表达的非重复的早期抗病相关基因 e s t 片段，其中9 9 i ( 8 0 ) e s t 可找到与其具有较高同源性的序列( o e - 值 l o ”) ，s 个( 7 ) 无同源序列。这些无同源序列或具有较低同 源性的序列可能代表新基因。在1 2 3 个差异表达的e s t 中，除2 2 的功能未知或已知功能而朱分类 和8 的无同源序列外，其余7 0 的e s t 分属于初级代谢、能量代谢、细胞结构、调控、蛋白合成 膨饰，加工、转运相关、抗病防御、转录相关和信号转导等生命过程。 在获得的1 2 3 个差异表达e s t 中，至少有4 4 个( 约3 5 8 ) 参与了马铃薯的抗青枯病反应。这 些e s t 对应的基因涉及到信号识别、信号转导、转录调控、过敏( h r ) 反应、系统获得性抗性( s a r ) 、 细胞自救与抗病防御等抗病反应的基本过程。这些抗病相关基因中大部分与已知基因高度同源， 预示着这些基因较为保守，在不同植物种的抗病反应中可能具有重要的作用。 3 构建了一个富集青枯病抗性相关基因的s m a r te d n a 文库。以青枯病菌小种3 号( p 0 4 1 ) 诱导2 4h 1 1 4 8h 的马铃薯高抗青枯病二倍体基因型e d l 3 的叶片为材料，利用s m a r t 和l d p c r 技 术相结合构建了一个富集青枯病抗性相关基因的全长c d n a 文库，为进行重要基因全长c d n a 的克 隆奠定了基础。所建文库的原始文库和扩增文库滴度分别为4 4 x 1 0 6 和1 8 ) 1 0 ”p f u m l ，重组率为 9 6 ，插入片段大小分布在4 0 0 - 1 8 0 0b p ，平均大小为7 0 0 - 1 0 0 0b p 。 4 获得了三个基因的全长c d n a 、四个基因的r a c e 产物及它们的诱导表达模式。利用r a c e 与l d p c r 方法和c d n a 文库相结合，快速获得了三个具有完整开放阅读框架基因的全长c d n a ( 受用、s t p m e i 和s t d n a j ) 和四个抗病相关基因( z j j 、l 7 7 l 1 8 1 和耶6 2 ) c d n a 的5 和3 r a c e 的p c r 产物，同时研究了这些基因的诱导表达。具体为： s t p i 编码1 1 6 个氨基酸，与马铃薯蛋白酶抑制子i 前体c d n a 有较高的同源性( 核苷酸和 氨基酸序列的同源性分别为8 9 和7 4 ) 。该基因受青枯病菌的诱导和j a 的调节，均为上调。 推测s t p l 基因是马铃薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成员，在马铃薯的抗青枯病的反应中可能具 有重要作用。该基因已在g e n b a n k 注册，序列号为d q 8 2 2 9 9 4 。 s t p m e i 编码1 9 8 个氨基酸，与烟草果胶甲脂酶抑制子基因具有较高的同源性( 核苷酸和氨 基酸序列的同源性分别为8 5 和7 8 ) 。s t p m e i 基因的表达受青枯病菌侵染的抑制，可能与病 菌侵染早期促使果胶甲脂酶( p m e ) 表现活性，加固细胞壁有关；但该基因又受j a 的诱导可能 与病菌侵染后期细胞肇的扩展和新细胞壁的建立有关。该基因已在g e n b a n k 注册，序列号为 d q 8 2 2 9 9 3 。 s t d n a j f f i 码1 7 7 个氨基酸，与拟南芥d n a j d l k e 基因的部分核苷酸具有8 4 的一致性，与其编码 的氨基酸序列具有5 9 的一致性。该基因受青枯病菌的诱导，也受j a 的调节。但j a 诱导后其上调 表达明显比青桔病菌诱导提前，且其维持高表达水平的时间也明显缩短。该基因已在c , e a b a n k 注 册，序列号为d q 8 8 5 3 6 0 。 l s i ( m e t h y l - c p g - b i n d i n g d o m a i n - e n n t a i n i n g p r o t e i n ) 和l 7 7 ( p u t a t i v e l y e n c o d i n gr e c e p t o r - l i k e k i n a s er h g l ) 均受青枯病菌的诱导，但它们的受诱导速度不同。l 5 j 在6 - 1 2 d 、时内表达最即达到 最高；l 7 7 约需4 8 小时才可达到最高表达量。这两个基冈均不受j a 的调节。 l 1 8 1 ( p h o s p h a t a 2 c ) 同时存在于抗病基因璎和感病基因型中，在抗病基因型e d t 3 中受青 枯病菌的诱导下调表达，与此相反却受j a 的诱导上调表达；在感病基因型e d 2 5 中，该基因不受j a 调节。预示着对于l 1 8 1 而言，病菌处理和j a 刺激可能采用不同的调节途径，并且该基因在抗病材 料中因受诱导下调表达而参与抗病反应。 妇6 2 ( p r o t e i n k i n a s e p t i l ) 同时受青枯病菌的诱导和j a 的调节，其表达模式与s t d n a j 相似， 均为上调表达。在处理2 4 小时之前该基因的m r n a 积累晕即达到最高，并且l 3 6 2 在j a 诱导后 其上调表达明显比青枯病菌的诱导提前。p t i l 基因为p t o 基冈的下游基因，参与番茄的抗病反应， 推测1 3 6 2 也可能参与了马铃薯的抗青枯病反应。 总之本研究不仅为我们提供了一些有益的数据( e s t s ) ，还有助于提高我们对马铃薯与青枯 病菌互作本质的认识，并且有些e s t 将可能被转化为分子标记进行马铃薯抗青枯病的标记辅助育 种。 关键词：马铃薯青枯病，e d n a 文库，抗病相关基因，基因表达 a b s t r a c t p o t a t o ( s o l a n u m t u b e r o s u m l ) a s o o e o f t o p f o u r i m p o r t a n t c r o p s i n t h e w o r l da f t e r w h e a t , t o ma n d r i c e 。p l a y sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l e i nf o o ds e c u d t y b a c t e r i a lw i l tc a u s e db yr a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m ( j 妇) i so n eo fd e v a s t a t i n gd i s e a s e so fp o t a t o a sas o i l - b o r n ed i s e a s e , t h e r ea r en oa n y e f f i c i e n tc h e m i c a lm e t h o d st oc o n t r o li t p r o b a b l y ，t h em o s tp r o m i s i n gw a yi st od e v e i q ，r e s i s t a n t c u l t i v a r s d u r i n gt h ep a s ty e a r s ，r e s e a r c hm a i n l yf o c u s e do np a t h o l o g y ，t a x o n o m ya n de p i d e m i o l o g yo f t h ep a t h o g e n t h eg e n e t i c so fh o s t r e s i s t a n c ea n dt h em e c h a n i s mo fp o t a t o - r si n t e r a c t i o na l o n gw i t h r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o nm s t i l lp o o r l yu n d e r s t o o d i nt h i ss m d y g e n ee x p r e s s i o no ft h e i n c o m p a t i b l ei n t e q a c t i e no fp o m t o - r aw a ss u r v e y e d t h em a i nr e s u l t so ft h i si n v e s t i g a t i o na r ea s f o o w s ： 1 af l e wi n o c u l a t i o nm e t h o d , n a m e d 雒 s t e mc u l t u r ei nb a c t e r i a ls o l u t i o nm e t h o d w a s e s t a b l i s h e d t w oc o n v e n t i o n a lm e t h o d sa n dt h en e wm e t h o dw e u s e dt oe v a l u a t et h er e s i s t a n c ea g a i n s t 西i nt w op o t a t op o p u l a t i o n s 勰w e l l 勰i ns e v e nt o m a t of i n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en e wm e t h o di s m o r ee c o n o m i ca n dr e p r o d u c i b l e ，s i m p l e ra n de a s i e rt oo p e r a t et h a nt h et w oc o n v e n t i o n a lm e t h o d s s i x r s - r e s i s t a n ta n ds e v e nr s s u s c e p t i b l ep o t a t og e n o t y p e sw e r eo b t a i n e d s i xg e n o t y p o s ( e g t h em o s t r e s i s t a n tc l o n ee d l 3a n ds u s c e p t i b l ec l o n ee d 2 5 ) h a v eb e e nu s e da sp a r e n t st oe n n s 仃i l c tm a p p i n g p o p u l a t i o n s w h i c ha r eu s e f u lt 0s t u d yt h ei n h e r i t a n c eo f r s - r e s i s t a n c ei nf u t u r e 2 as u b t t a c t i v ee d n al i b r a r yo fr s - r e s i s t a n tp o t a t oa t e a r l y s t a g ew a sc o n s t r u c t e du s i n g s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) a n dm a c r o a r r a y s t o t a l l y1 2 3d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d u n i - g e n ef r a g m e n t sw e r ei d e n t i f i e d n i n t y - n i n ee s t s ( 8 0 ) h a v eh i g hs i m i l a r i t yw i t hg e n e s ( f r a g m e n t s ) i nt h en c b id a t a b a s e ( o ( e - v a l u e 1 0 1 0 ) ，e i g h t ( 8 ) h a v en om a t c h t h eg e n e sw i t hl o wi d e n t i t ya n dn om a t c ht ok n o w ng e n e sm a yr e p r e s e n tn o v e lg e n e s s e v e n t yp e r c e n to f1 2 3e s t sw e r er e l a t e dt ot h ep r i m a r ym e t a b o l i s m , e n e r g y ，c e l ls h a e t o r e ，g e n e r e g u l a t i o n ，p r o t e i ns y n t h e s i s ，p r o t e i nm o d i f i c a t i o na n dp r o c e s s i n g ，t r a n s p o r t e r s ，d i s e a s ed e f e n c e , t r a n s c r i p t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n e t c w h i l et h er e m a i n i n g3 0 w e f u n c t i o nu n k n o w no r u n c l a s s i f i e d f o u r t y - f o u re s t so u to ft h e 1 2 3 d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e df r a g m e n t s w c l ec o n s i d e r e d r s - r e s i s t a n c er e l a t e de s t sa n dw e r ec l a s s i f i e di n t os i xg r o u p s ，w h i c ha r ci n v o l v e di nb a s a ld i s e a s e r e s i s t a n c ep r o c e s s ，i n c l u d i n gs i g n a lr e c o g n a t i o n ，s i g n a lt r a n s u d a t i o n ，h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，s y s t e m i c a c q u i r e dr e s i s t a n c e 。c e l lr e v u ea n dp r o t e c t i o n ，a n dr e s i s t a n c eo rd e f e n s e ，c l c m o s to ft h e s ee s t ss h a r e d h i g hs i m i l a r i t yw i t hk n o w ng e n e s i n d i c a t i n gt h a tt h e s eg e n e sm a yb ec o n s e r v a t i v ei nf u c t i o na n dp l a y i m p o r t a n tr o l e si nd i s e a s er e s i s t a n c ei nd i f f e r e n tp l a n ts p e c i e s 3 af u l l - l e n g t he d n al i b r a r yo fr s - r e s i s t a n tp o t a t ow a sc o n s t r u c t e db a s e do ns m a r t ( s w i t c h i n g i n c h a n i s ma t5 。e n do fr n at r a n s c r i p t ) a n dl d - p c r ( 1 0 n gd i s t a n c ep c r ) t e c h n i q u e s 。t h et i t e r so f u n a m p l i f i e d a n da m p l i f i e d e d n a l i b r a r y w e r e 4 4 x 1 0 6 p f u m l a n d1 8 x 1 0 1 0 p f a t r a lr e s p e c t i v e l y t h er a t e o fr e c o m b i n a t i o nw a s9 6 t h el e n g t ho fi n s e r t e df r a g m e n t sw a s4 0 0 - 1 8 0 0b pa n dt h ea v e m g es i z ew a s 7 0 0 - 1 0 0 0b p 4 t h r e ef u l l l e n g t hc d n a s ( s t p ls t p m e ia n ds t d n a j ) w i t hc o m p l e t e do p e nr e a d i n gf r a m e ( o r d w e l ec l o n e df r o mr s - r e s i s t a mp o t a t ol e a v e su s i n gr a c em e t h o dc o m b i n e dw i t hl d p e ra n de d n a l i b r a r y 觞w e l l f o u ro t h e rg e n e s r a c ep c rp 删u c t s e x p r e s s i o np a t t e r n so ft h e s eg e n e sw e r ea l s o c o n f w m e du s i n gn o r t h e r nb l o ta n ds e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r s t p ig e n ee n c o d e sap r o t e i no f11 6a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 9 i d e n t i t yw i t hp o t a t op r o t e i n a s e i n h i b i t o rip r e c n r g o ri nn u c l e o t i d ea n d7 4 i na n l i n oa c i d s t p ig e n ew a si n d u c e db y 船a n da l s o r e g u l a t e db yj a s t p ig e n ei so n eo ft h em e m b e r si np o t a t op m t e i n a s oi n h i b i t o rg e n ef a m i l y ，a n dm a y p 王a ya ni m p o r t a n tr o l ei np o t a t o sr e s i s t a n c et or s t h i sg e n eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng a n b a a ka n dt h e a c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 2 2 9 9 4 s t p m e ig e n ee n c o d e sap r o t e i no f1 9 8a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 5 i d e n t i t yw i t ht o b a c c o i n v e r t a s e p e e t i nm e t h y l e s t e r a s ei n h i b i t o ri nn u c l e n t i d ea n d7 8 i na m i n oa c i d t h ee x p r e s s i o no f s t p m e lw a si n h i b i t e db yr s ，w h i c hm i g h tr e s u l ti ni m p r o v i n gt h ea c t i v i t yo fp e c t i nm e t h y l e s t e r a s e f p m e ) a n ds t i f f e n i n gt h ec e l lw a l li ne a r l ys t a g ep o s tr s - i n v a s i o n w h e r e a ss t p m e ig e n ew a s u p - r e g u l a t e db yj a ，w h i c hm a yh er e l a t e dt oc e l lw a l le x t e n s i o na n db u i l d i n gu pi nl a t e rs t a g e t h i sg e n e h a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 2 2 9 9 3 s t d n a jg e n ee n c o d e sap r o t e i no f1 7 7a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 4 i d e n t i t yw i t hd n a j 1 i k e2 0o f a r a b i d o p s i st h a l i a n ai nn u c l e o t i d ea n d5 9 i na m i n oa c i d s t d n a jg e n ew a si n d u c e db yr sa n da l s o r e g u l a t e db yj a 。t h i sg e n ew a si n d u c e de a r l i e ra n di t sh i g he x p r e s s i o nl e v e lp e r s i s t i n gt i m ew a s o b v i o u s l ys h o r t e rt r e a t e dw i t hj at h a nt h a ti n f e c t e db yr s s t d n a jg e n eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k a n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 8 5 3 6 0 l 5 1 ( m e t h y l - c p g b i n d i n gd o m a i n - c o n t a i n i n gp r o t e i n ) a n dl 7 7 ( e n c o d i n gr e c e p t o r - l i k ek i n a s e r h g i ) h a v ed i f f e r e n tr s - i n d u c e de x p r e s s i o np a t t e r n s l 5 1r e a c h e dt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e li n6 - 1 2 h p i w h i l el 7 7d i dg oi n4 8 hp i t h e s et w og e n e sw e r en o tr e g u l a t e db yj a l 1 8 1 ( p h o s p h a t a 2 c ) e x i s t sb o t h i nr e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l eg e n o t y p e s t h i sg e a ew a s d o w n - r e g u l a t e db yr si nr e s i s t a n tg e n o t y p e ，w h e r e a su p - r e g u l a t e db yj a ，b u tw 鹞n o tr e g u l a t e db ，i ai n s u s c e p t i b l eg e n o t y p e ，i n d i c a t i n gt h a tr si n v a s i o nm a yh a v ed i f f e r e n ts i g n a lt r a n s d u e t i o np a t h w a yw i t h j a - t r e a t m a n tf o rt h i sg e n ea n dt h i sg e n es h o wi t sf u n c t i o nd u et os l r e s si n d u c t i o n 1 2 1 6 2 ( p r o t e i nk i n a s ep t i l ) w a su p - r e g u l a t e db yr sa n dj a ，a n di t se x p r e s s i o np a t t e r nw a ss i m i l a rt o t h a to fs t d n a 2 t h em r n aa c c u m u l a t i o no fl 3 6 2r e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e lb e f o r e2 4 hp o s tt r e a t e db y r sa n dj a a l s ot h i sg e n ew a si n d u c e de a r l i e rt r e a t e dw i t hj at h a nt h a ti n f e c t e db yr s p t i lg e n ei s i v l o c a t e dd o w n s t r e a mo f p r oa n di n v o l v e di nd i s e a s er e s i s t a n c ei nt o m a t o s u g g e s t i n gt h a tl ；6 2m a ya l s o p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr s - r e s i s t n c er e a c t i o ni np o t a t o t h i si n v e s t i g a t i o n ，a l t h o u g l if a rf r o mb e i n ge x h a u s t i v e ，h a sp r o v i d e dl l e wm o l e c u l a ri n s i g h t si n t o t h en a t l l r eo f f i c ep o t a t o - r si n t e r a c t i o ni np o t a t ol e a v e s t h ee s t sr e p o r t e dh e r em a yp r o v i d eu s e f u ld a t a f o ri m p r o v i n go u rk n o w l e d g eo fp o t a t or e s i s t a n c et op a t h o g e n s ，a n dm a ya l s ob eu s e da sc a n d i d a t e g e n e sf o rd e v e l o p i n gm o l e c u l a rm a x 蛔 8t oa s s i s tp o t a t og e n e t i cb r e e d i n gi nf u t u r e k e yw o r d s ：p o t a t ob a c t c r i a lw i l t , e d n al i b r a r y ，r e s i s t a n c e - r e l a t e dg e n e ，g e n ee x p r e s s i o n v 缩略语 v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 李于梧 时间： 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：垂7 稻 名：尾舌办 时间：步一歹年矿月l o 日 时间：渺6 年d 月1 3 ：日 第一章前言 1 1 课题的提出 马铃薯主要起源于南美洲安第斯山区，散见于中美洲加勒比地区、墨西哥及美国南部地区， 目前发现的野生种和栽培种超过2 2 0 个，新“种”的发掘和鉴定工作还在继续进行中( h a w k e s ， 1 9 9 0 ) 。用于生产的仅8 个种，除普通栽培种( & t u b e r o s u ms s p t u b e r o s u r a ) 在世界各地广泛种植 外，其他种限于安第斯山区( h u a m m 。1 9 8 6 ) ，栽培马铃薯1 7 世纪引入中国( 佟屏诬等，1 9 9 1 ) 。 马铃薯以其适应性强、产量高、营养全面、适于加工等特点，在世界各地迅速推广种植，已 成为继小麦、玉米、水稻之后的世界第四大作物，种植面积达到1 8 6 5 2 4 万公顷，年总产量为 3 2 1 9 7 4 2 万吨，平均单产为1 7 2 6 吨，公顷( f 舳，2 0 0 5 ) 。中国马铃薯栽培面积最大达4 4 0 1 5 万公 顷，占世界的2 3 6 年总产量为7 3 7 7 6 5 万吨，为世界的2 2 9 1 ；平均单产为1 6 7 6 吨，公顷( f a o 。 2 0 0 5 ) 。自1 9 6 1 年至今，马铃薯在发达国家的栽培面积总体呈下降趋势，觚1 9 6 1 年的1 8 7 9 9 3 万 公顷减少到了2 0 0 5 年的9 1 4 9 2 万公顷；而在发展中国家却呈增长趋势，从1 9 6 1 年的3 3 4 8 7 万 公顷增加到了2 0 0 5 年的9 5 0 3 2 万公顷，平均年增长1 3 6 8 万公顷；但由于生产水平的提高，世 界马铃薯总产量仍然呈逐渐上升趋势。据国际马铃薯中心( c 口) 和国际粮食政策研究所( i f p r i ) 预测，1 9 9 3 至2 0 2 0 年，全球马铃薯产量的平均年增长率为2 7 ，远高于水稻、玉米、小麦等作 物，世界人口达到高峰时，马铃薯和其他块根、块茎类作物将成为世界粮食安全保障体系中的重 要作物( g r e g o r y , e ta 1 2 0 0 0 ) 。 尽管目前我国的马铃薯种植面积和产量均居世界首位，但单产与世界发达国家相比( 如单产 最高的英国为4 5 0 0 吨公顷( e a o ，2 0 0 5 ) ) 还有相当大的差距，并且我国各地区的生产水平也 很不均衡，发展潜力巨大，同时马铃薯品质也有待进一步提高。专家预测，中国将成为哑太地区 最重要的生产中心( 屈冬玉等，2 0 0 1 ) ，是2 1 世纪全球最大的马铃薯快餐食品消费市场，由此可 见马铃薯加工领域的巨大潜力也不容忽视。 由青枯病痛原菌( r a l a t o n i as o l a n a c e a r u m 饵f s m i t h ) c o m b n o v ，原名为p s e u d o m o n a s a o l a n a c e a r u m ，以下简称为青枯病菌) 引起的马铃薯青枯病( b a c t e r i a lw n ) 是世界性的细菌性 病害( y a b u u c h i ，e t a l 1 9 9 5 ) ，其危害程度仅次于马铃薯晚疫病，可通过土壤，灌溉、植株、种薯 等进行传播。该病菌寄主范围，“，可侵染5 0 个科的数百种植物，尤其是茄科植物，如马铃薯、 番茄等( m a r t i n ，e t a l 1 9 8 5 ) ，防治非常困难，特别是在温暖潮湿的环境中，发病率更高，严重者 可使马铃薯减产8 0 ，甚至绝产( h e ，1 9 8 7 ) ，严重威胁着我国乃至世界的马铃薯生产。 此病目前尚没有行之有效的化学药荆防治办法，尽管与其他作物轮作、间套作及调整播种时 期等综合防治措施在一时间可较有效的防治该病的发生和蔓延，但防治马铃薯青枯病的根本手段 还是培育抗病品种。长期以来，国内外科技工作者对马铃薯青枯病的研究和探讨主要集中在该病 的病理学机制、分类学及流行病学、品种资源评价及杂交筛选等方面，但在抗性遗传机制方面却 知之不多，控制马铃薯对青枯病的抗性基因种类和数量以及它们的表达调控机制还不清楚。同时 由于可供利j ；i 的抗病育种材料有限，普通四倍体葳培品种遗传背景复杂，又缺乏优良酌抗病基因 源，严重影响了抗病育种工作的进程。因此深入研究马铃薯的抗青桔病机制和进行抗病相关基因 的分离将有助于了解和揭示复杂的抗病防御反应机理。对确定更有效的抗病育种途径，培育高抗 青枯病的马铃薯新品系( 品种) 具有重要的理论与实践意义。 1 2 青枯病研究进展 1 2 1 青枯病菌的研究概况 1 2 1 1 病菌的分类 青枯病菌具有明显的生理分化或菌系多样性。不同地区或寄主植物来源的分离物在寄主范围 上、致病力强弱上或细菌学特性上并不完全相同。目前国际上公认的主要有两个亚分类系统。一 是美国的b u d d e n h a g e n 、s e q u e i m 和k e l m a n 于1 9 6 2 年根据不同来源菌株对不同植物种类的致病 性差异，将青枯病菌划分为三个生理小种( r a c c ) ：可高度侵染茄科植物( 包括马铃薯、番茄、 茄子、辣椒和烟草等) 和其它植物，寄主范围较广的为小种l 号；只侵染香蕉、大蕉和海里康 ( h e l i c o n i a ) 的为小种2 号；只侵染马铃薯和偶尔侵染番茄、茄子的为小种3 号。另一个亚分类 系统是澳大利亚h a y w a r d 根据不同菌株对3 种双糖和3 种己醇氧化产酸能力的差异，将青枯病菌 划分为四个生化变种( b i o v a r ，原先称生化型b i o t y p e ) ，即：生化变种l 一不能氧化3 种双糖和3 种己醇；生化变种2 一只能氧化3 种双糖，不能氧化3 种己醇；生化变种3 一能氧化3 种双糖和3 种己醇；生化变种4 一只能氧化3 种己醇，不能氧化3 种双塘。后来又发现两个生理小种4 、5 和一个生化变种5 。生理小种和生化变种之间的对应关系如图1 2 。 卧鼍扣 图1 2 生理小种和生化变种之间的对应关系 n g 1 , 2c o r r e s p o n d i n gr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt w oc l a s s i f i e ds y s t e m ( r a c ea n db l o v a ro f r a h t o n as o l a n a c e a r u m ) 两种分类之间无一一对应关系，如小种1 号包括三个生化变种l 、3 和4 ，而这三个生化变种 又分属于三种生理小种1 、2 、4 ，为进行青枯病抗病研究和国际间的信息交流带来了困难，并且 这两种分类方法都不符合通用的细菌命名法( c o d e o f n o m e n c l a t u r e o f b a c t e r i a ) 。因此统一和系统 分类青枯病菌及弄清所研究病菌分属于哪个生理小种和生化变种是必要的，未来青枯病菌的分类 可能会分为2 个或更多的哑类( h a y w a r d ，1 9 9 1 ) 。目前为害我国马铃薯的优势菌( 系) 是生化变 种2 ，它是一个低温型菌系，在低温下生化变种2 ( 小种3 ) 比生化变种3 和4 更具有侵染力( c i a m p i 。 甜a 1 9 8 0 ) ，严重威胁着马铃薯生产。 1 2 1 2 病菌的检测 随着青枯病菌的寄主越来越“泛及其本身的高变异性，诊断技术对于青枯病的鉴定、栽培材 2 料的带菌检测和控制病害蔓延传播等具有重要作用。近年来国内外的专家学者对其进行了大量的 研究和探讨，并建立了多种方法用于土壤、水、杂草等的青枯病菌检测。2 0 世纪9 0 年代，随着 在西欧和北欧陆续发现青枯病菌小种3 号( 生化变种2 号) ，w u l l i n g s 等( 1 9 9 8 ) 建立了一种基 于f i s h 的检测马铃薯青枯病菌的新方法：用特异探针r s o l a 和r s o l b 可有效检测污染地区 的土壤、水及杂草寄主根组织中的青枯病菌。为提高病菌检测的灵敏度，p o u s s i e r 等( 2 0 0 2 ) 优 化了病菌提取程序，采用简单的p c r 方法可有效检测来源不同的低含量的青枯病菌。同年，c a r u s o 等利用特异单克隆抗体8 b 一l a 可与1 6 8 个典型的青枯病菌系发生反应，而与1 7 4 个其他病原 或源自马铃薯的未知病原不发生反应的特性，建立了富集双抗体夹心间接e l i s a 法。该方法引入 了一个病菌富集过程，灵敏度可达l 一1 0c f u m l ( 马铃薯块茎提取物) ，可有效检测马铃薯块茎中 的病菌。2 0 0 3 年，s c h o n f c l d 等在p o u s s i e r 等报道的p c r 检测方法基础上，进一步发展了r s o l - f l i c p c r 系统，该方法不仅可快速检测低含量的青枯病菌，而且对于不同地理起源的青枯病菌的检 测同样有效。同年c a r u s o 等也对p c r 方法检测青枯病菌的灵敏度和检测方法简单化方面进行了 卓有成效的改进：根据1 6 sr r n a 序列设计3 个p c r 引物，利用c o - p c r ( 在同一个反应体系中 进行多对引物的p c r 扩增) 法可在一个反应中同时对水中青枯病菌生化变种1 、2 和4 号进行特 异检测分析，灵敏度可达l c f u