核酸染色剂.doc

_电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：1. 溴化乙锭（ethidiumbromide,EB） 最常用的核酸荧光染料，这种扁平分子可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/LMgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。 在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5g/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5g/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4避光保存。2. 吖啶橙（acridineorange,AO）： 吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1g和0.05g。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4脱色过夜或22脱色12小时。3. 银（Ag+）试剂： Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高1001000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。4. 亚甲蓝（methyleneblue）： 可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/LTris-Ac（pH8.3），4放置12h，用净水洗5-8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。5. Gold View 型核酸染色剂与溴化乙锭：Gold View是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA燃料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA成红色荧光。通过小鼠皮下注射实验，尚未发现Gold View有致癌作用，而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Gold View代替EB不失为一种明智的选择。 实验操作步骤：100mL溶胶液在微波炉中融化，冷却至60左右（不烫手）后加入10vL Gold View，轻轻摇匀后倒胶，待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫外灯下观察。注意事项：1) 胶厚度不要超过0.5cm,胶太厚会影响检测灵敏度2) 加入Gold View的琼脂样凝胶反复融化可能会对DNA检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。3) Gold View在pH 3.6-7.0之间能更好的与核酸结合，因此电泳时最好使用新鲜的电泳缓冲液。4) 由于Gold View产生绿色荧光，因此不适合于用一般单色胶卷拍照，可以使用凝胶成像系统保存图像。5) 含有Gold View的凝胶不适合于进行凝胶回收试验。要进行回收试验，请使用EB胶或supper Green型核酸染色剂。6) Gold View特别适合于大片段DNA的检测（大于1kb的片段，检测灵敏度与EB相当）；当DNA片段小于1kb时，检测灵敏度低于EB，特别是低于500bp的片段，Gold View型可能亮度很弱或者检测不到，如要检测小片段的DNA，请选用supper Green型核酸染色剂，该染色剂适合检测所有片段大小的DNA片段。7) 虽然尚未发