（细胞生物学专业论文）青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究.pdf

青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 摘要 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 弓 起的植物毁 灭性土传病害。作为最重要的植物病原微生物之一，青枯雷尔氏菌的不同菌株在 寄主范围、地理分布、为害特征、流行特征、种下分类等方面存在较大差异，现 有的种下分类体系仍不足以描述此差异。本论文对收集整理的4 0 个菌株进行了 研究，测定各菌株的生理小种、生化型和致病型；利用气相色谱技术检测菌株细 胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸的分布多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与 现有种下分类方法之间的关系；运用统计分析方法初步建立了脂肪酸型判别模 型。 研究结果表明：青枯雷尔氏菌在菌体形态、致病性、生理生化等方面都存在 较大的差异，呈现出明显的多态性。青枯雷尔氏菌生理小种l 的菌株在致病力上 存在着分化，可划分为不同的致病型；生化型与其致病型不存在相关性。在一定 范围内，青枯雷尔氏菌生理小种和生化型对于标记菌株特性具有一定的意义，但 其分析结果对致病力分化的分析作用，值得进一步探讨。 脂肪酸多态性研究结果表明，来源于同一寄主的枯雷尔氏菌和不同寄主分离 的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；4 0 个青枯雷尔氏菌菌株的 脂肪酸分布特征可以聚类成3 个类群，即脂肪酸i 型、脂肪酸型和脂肪酸 型；青枯雷尔氏菌生理小种l 存在着不同的脂肪酸型，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态 性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病型之间存在一定的相关性： 脂肪酸i 型为无致病性菌株，脂肪酸型为过渡性菌株，脂肪酸型为强致病 性菌株。 青枯雷尔氏菌脂肪酸型判别模型的建立：y l = - 1 6 3 3 5 3 + o 0 0 1 2 x 1 - i - 0 0 0 5 6 x 9 0 0 0 1 6 x 1 6 ，y 2 = 3 4 9 2 8 + 0 0 0 0 2 x l + 0 0 0 0 3 x 9 + 0 0 0 2 5 x 1 6 ，y 3 = 9 1 5 5 0 o 0 0 0 3 x 1 - 1 - 0 0 0 3 9 x 9 + 0 0 0 4 2 x 1 6 ，对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔 氏菌菌株，首先测定脂肪酸谱图，取出x i ( c 1 4 ：o ) 、x 9 ( c 1 7 ：0 ) 、x 1 6 ( c 1 8 ：0 ) ，代 入方程，计算y i ，当1 主y i - - 番茄 花生 烟草 茄子。青枯雷尔氏菌在不同侵染状 态植株体内的分布及致病力存在显著差异，以茄子、花生和生姜健康与病株分析 为例，仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌，而茄子和生姜健株 无青枯雷尔氏菌侵染。青枯雷尔氏菌在不同发病阶段植株体内的分布及致病力差 异显著，在茄子发病初期，植株下部茎青枯雷尔氏菌的含菌量均显著高于中上部 茎；当病程发展到中期时，植株体内不同部位青枯雷尔氏菌的含菌量均显著下降， 从发病中期到后期含菌量未发现显著性差异，但是，随着发病进程，青枯雷尔氏 菌弱化指数下降，致病性则大大增强【1 4 2 1 1 。 1 2 3 形态特征多态性 不同作物上分离的青枯雷尔氏菌形态存在着多态性，同一作物的不同时阔、 不同地点病株上分离的青枯雷尔氏菌形态存在着多态性，同一病株分离的青枯 雷尔氏菌形态也存在着多态性，同一青枯雷尔氏菌分离产生的青枯雷尔氏菌形 态同样存在着多态性【2 1 1 。对青枯雷尔氏菌基本形态的描述有短杆状、椭圆形、 短椭圆形、长椭圆形等等，其大小也有近两三倍的差异【2 2 1 。青枯雷尔氏菌的大 小和形状与寄主植物、菌株同源性、菌落特性、致病性等无必然的联系。对青 枯雷尔氏菌不同条件下形态多态性的研究，提示了青枯雷尔氏菌的不同株系可 以同时存在，其多态性与特定的寄主、时间、空间等因素变化有关，不同的菌 系对外界条件的适应性不同，表现出竞争的差异性，形成了菌系的多态性。这 种多态性对于研究致病性变化具有重要意义。 1 2 4 遗传特性多态性 用r a d p 研究青枯雷尔氏菌遗传物质的异质性，能很好揭示其多态性。1 9 9 6 年日本学者从发生细菌性青枯病的茄子和番茄分离了1 8 株青枯雷尔氏菌，用 r a p d 方法进行分析，结果表明，不同寄主的青枯雷尔氏菌菌株存在着较高的遗 传多态性，不同地区的菌株遗传多态性差异显著。不同寄主青枯雷尔氏菌存在着 不同的菌系【2 3 】。何自福等从2 0 0 个随机引物中筛选出1 7 个引物用于上述3 1 个菌 株d n a 的r a p d 分析，共扩增出5 2 3 条带，其中4 6 8 条为多态性带，占8 9 5 。 聚类分析这3 1 个菌株，又可聚为4 个簇群：第1 簇群主要分离自推广种植多年 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 的丰顺、金丰等抗病番茄品种上；第1 i 簇群分离自抗病的番茄新品种新星、年 丰和石碣紫红茄上；第簇群主要分离自辣椒和茄子；而第1 i i 簇群来源包括番 茄、茄子和辣椒这3 种寄主植物。上述试验结果说明，广东茄科青枯菌的致病力 存在明显的分化现象，其d n a 存在较高的遗传多样性【2 4 】。 1 3 青枯雷尔氏菌的种下分类 1 3 1 生理小种 青枯雷尔氏菌的种下分类复杂，前人主要从生理小种( r a c e ) t 2 5 1 、生化型 ( b i o v a r ) t 2 6 1 、血清型( s e r o t ) ，p e ) 【2 7 1 、删( 1 y s o t y p e ) t 2 8 1 、致病型q a t h o g e i l i c i t y ) 【2 9 】、 基因型( g e n e t ) ，p e ) 3 0 】等方面对种下分类进行研究。 生理小种( r a c e ) 根据青枯雷尔氏菌对不同寄主致病性的表现进行划分。 b u d d e n h a g e n 等提出了青枯雷尔氏菌小种鉴定方法，将生理小种分为3 个类型， 选用茄子与香蕉作为鉴别寄主，采用排除法，即若不侵染香蕉则非生理小种2 ， 若可侵染茄子则非生理小种3 t 3 1 1 。国际上对青枯雷尔氏菌种下分类研究较多，卢 同( 1 9 9 8 ) 综述了国际上对青枯雷尔氏菌生理小种分类标准：能侵染烟草及多种茄 科植物，浸润于烟叶上能产生坏死枯斑反应，在含l 一酪氨酸的培养基上能产生 大量黑色素的为青枯雷尔氏菌生理小种l ；能侵染香蕉和海力康( h e l i c o n i a ) ，浸 润烟叶产生过敏反应，在l 一酪氨酸培养基上不产生黑色素的为生理小种2 ；侵染 马铃薯和番茄，对烟草弱侵染，在烟叶上形成黄化斑，在l 一酪氨基培养基上产 生少量黑色素的定为生理小种3 ；能侵染马铃薯和茄子、浸润烟叶产生过敏性反 应，酪氨酸酶活性中等的定为生理小种4 【3 2 1 。 我国植病学者对木麻黄、甘薯、马铃薯、花生、聚合草、油橄榄、姜、桑 等作物青枯雷尔氏菌的生理小种进行研究，结果表明：桑青枯雷尔氏菌属于生 理小种1 和4 ，马铃薯青枯雷尔氏菌属于生理小种1 和3 ，而木麻黄、花生、聚 合草、油橄榄、姜、番茄、甘薯等作物的青枯雷尔氏菌均属于生理小种l 【1 7 2 5 , 3 2 3 5 】。 1 3 2 生化型 生化型( b i o v a r i a t y ) 根据青枯雷尔氏菌对生化物质的利用进行划分。自6 0 年 代以来，国际上对不同寄主的青枯雷尔氏菌株的生化型进行了研究，澳大利亚的 h a y w a r d 根据青枯雷尔氏菌株对3 种双糖( 乳糖、麦芽糖、纤维二糖) 和3 种六碳 醇( 甘露醇、甜醇、山梨醇) 的利用情况，把青枯雷尔氏菌区分为4 个生化型【3 酬。 张广民等对山东省姜瘟病株进行了生化型研究，表明山东省姜瘟病菌存在和 4 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 i i i 两个生化型【3 7 1 。曾宪铭等分析了1 3 种作物上的青枯雷尔氏菌的生化型，发现 来自茄子的青枯雷尔氏菌属于生化型i i i 和，不同地点采集的青枯雷尔氏菌的 生化型存在着差异【2 6 】。林美琛等分析了浙江省番茄青枯雷尔氏菌的生化型，表明 属于生化型i i i 的占6 3 2 ，生化型i 的占3 5 ，生化型的占1 2 3 ，还有 2 1 1 为新型”，无法划入现有的生化型分类标准【3 8 】。同一菌株在无菌水中保存 一段时间后，其生化型会发生变异，这表明青枯雷尔氏菌的生化型并不是一个稳 定的分类特征，因此生化型的划分在分类学是否有意义值得进一步探讨。 1 3 3 血清型 血清型( s e r o t y p e ) 是根据青枯雷尔氏菌对血清的交互凝集反应进行划分。从 8 0 年代开始，我国研究青枯雷尔氏菌的学者，采用交互凝集反应法和琼脂双向 扩散法，对桑和木麻黄的血清型进行了研究，结果表明：桑和木麻黄青枯雷尔 氏菌分属于血清型i 、。以代表不同生化型的4 个青枯雷尔氏菌的膜 蛋白为免疫原制备了4 个相应的抗血清，对我国植物青枯雷尔氏菌的血清分型 进行了研究，琼脂双扩散试验结果表明：来自我国6 个省的1 9 种寄主植物的 2 1 2 个青枯雷尔氏菌株可分为8 个血清型，其中血清型i 为优势类群，包括茄科 主要植物等1 3 种寄主的1 4 7 个菌株，占全部供试菌株6 9 f 3 9 舯】。9 0 年代福建 省农科院采用酶联免疫吸附法( e l i s a ) ，应用单克隆抗体技术，用甘薯青枯雷尔 氏菌免疫的b a l b c 小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交融合，建立了4 株分泌抗 甘薯青枯雷尔氏菌的特异性、有鉴别力的杂交瘤细胞株：p s b 2 4 、p s b 2 8 、p s b 4 6 、 p s b 5 6 ，其中杂交瘤细胞株染色体数范围为9 8 1 0 4 。用e l i s a 法测定1 5 6 株甘 薯青枯雷尔氏菌的血清型，结果表明：甘薯青枯雷尔氏菌可分为7 型( i v i i ) t 2 7 】。 1 3 4 溶源型 溶源型( 1 y s o t y p e ) 是利用青枯雷尔氏菌对植物病原菌噬菌体的专化性反应进 行划分。采用单层平板法，用分离自桑青枯雷尔氏菌的噬菌体m w - 1 和m w - 2 测定1 9 个桑青枯雷尔氏菌株，结果表明：桑青枯雷尔氏菌噬菌体m w - 1 和m w - 2 只侵染桑青枯雷尔氏菌株而不侵染番茄、花生、木麻黄、马铃薯、辣椒、烟草、 姜和甘薯的青枯雷尔氏菌株，用两个噬菌体可将1 9 个桑青枯雷尔氏菌株区分为 6 个溶源型【2 引。由于溶源型分化检测方法的测定过程复杂，噬菌体的分离保存 难度大，目前很少应用于青枯雷尔氏菌种下分类的研究。 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 1 3 5 致病型 致病型( p a t h o g e n i c i t y ) 是根据青枯雷尔氏菌对寄主的致病性差异进行划分。 植病工作者根据青枯雷尔氏菌对寄主的致病性差异划分为不同致病型：分为强、 弱或强、中、弱或更多的致病类型。卢同等( 1 9 9 8 ) 对作物青枯雷尔氏菌致病型 的研究进行了综述【3 2 1 ，认为对作物青枯雷尔氏菌致病型的确定，关键在于鉴别 品种的选择。在研究中，对鉴别寄主的选择上，有的学者是选择对青枯雷尔氏 菌抗感反应敏感的，鉴别性能稳定的，室内抗感反应与大田实际鉴别结果相一 致的代表性品种作为鉴别寄主【4 1 1 。有的学者是把青枯雷尔氏菌的数百个菌株与 同一作物的数百个品种致病反应结果进行聚类分析，用相关系数作为聚类的相 似性指标，用类平均法进行系统聚类分析，把经过聚类分析选定的品种作为鉴 别寄主【4 2 1 。黄福新等1 9 9 8 年对广西2 1 个产烟县收集的6 5 个菌株进行了分析， 以烟草、马铃薯、番茄、茄子、辣椒、花生、香蕉为鉴别品种，表明强致病性 菌株占7 3 3 ，不同地方存在很大差异【2 9 1 。王国平等( 1 9 9 6 ) 以烟草k 3 2 6 为鉴别 品种，分析分离自湖南省烟草上的菌株，结果表明强致病性菌株占4 6 4 。采 用不同的鉴别品种，对青枯雷尔氏菌致病力类型划分有很大的影响【4 3 1 。 1 3 6 基因型 对基因型( g e n e t y p e ) 的研究报道，目前多见于国外。s e a l 等( 1 9 9 2 ) 设计了两对 不同的引物，利用聚合酶链式反应( p c r ) 检测青枯雷尔氏菌，引物p s 9 6 h 和p s 9 6 i 是通过底物杂交试验得到的，对青枯雷尔氏茵具有高度特异性；另一对引物 y 2 o l l l 扩增1 6 sr r n a 区域，引物y 2 是依据多种细菌中的1 6 sr r n a 保守序列设 计的，对青枯雷尔氏菌是非特异性的【3 0 舯】。h a r t u n g 等( 1 9 9 9 ) 采用特异性引物 p s 9 6 h 和p s 9 6 i 和修正过的p c r 方法对1 7 株不同的青枯雷尔氏菌进行检测【4 5 】；所 用引物p s 9 6 h 和p s 9 6 i 扩增出序列是9 4 个碱基的片段，在不同的菌株组之间显示 该片段存在许多点突变。 1 4 脂肪酸甲酯( f a m e ) 谱图分析方法的研究现状 1 4 1 原理 脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之 一，在细胞中绝大部分脂肪酸以结合形式存在，构成具有重要生理功能的脂类， 它是构成生物膜的重要物质；是有机体代谢所需燃料的贮存形式；作为细胞表面 物质与细胞识别、种族特异性和细胞免疫等密切相关【4 6 4 7 】；具有结构多样性和高 6 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 的生物学特异性，是特别有效的生物标记物【4 8 1 。目前脂肪酸作为一类重要的生物 活性物质，已经引起了国内外同行的相当重视。 脂肪酸甲酉匕( f a t t ya c i dm e t h y le s t e r ，f a m e ) 谱图分析方法是鉴于脂肪酸可 作为生物标记物而发展起来的分析技术，是在细胞组分水平上研究微生物的重要 技术，通过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸( p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d ，p l f a ) 拘组 分来鉴定微生物的种属、分析微生物多样性，是一种简便、可靠的分析方法。 f a m e 谱图分析方法的原理是不同微生物往往具有不同的磷脂脂肪酸组成 和含量水平，其含量和结构具有种属特征或与其分类位置密切相关，因而磷脂脂 肪酸能够标志某一类或某种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记物 4 9 , 5 0 , 5 。古生菌不能使用f a m e 谱图进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是 酯键的形式出现【5 2 】。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，一旦生物细胞死亡， 其中的磷脂化合物就会马上消失，因此，磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中“存 活”的那部分群体【5 3 】。由于用于f a m e 谱图分析的脂肪酸多为磷脂脂肪酸，所以 该方法又称为p l f a 谱图分析方法。 ， 1 4 2 方法 进行f a m e 谱图分析首先要提取出磷脂脂肪酸，利用有机溶剂将样品中的脂 肪酸浸提出来进行分离纯化，将磷脂脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯，最后利用 标记脂肪酸，通过气相色谱等仪器分析，得到样品的磷脂脂肪酸组成图谱，进而 得到不同脂肪酸的含量和种类，即所谓的f a m e 谱图( 图1 ) 。根据谱图中脂肪酸甲 图1f a m e 谱图分析的一般流程 f i g 1t h eg e n e r a lp r o c e d u r e so ff a m ef i n g e r p r i n ta n a l y s i s 酯的多样性，利用相关的数据库和相关的计算机分析软件，便可鉴定出样品中微 生物的种类或得到样品中微生物群落结构组成多样性、比例以及微生物生物量等 方面的信息。该研究主要是通过气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y , g c ) ，以及气相色 谱质谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r u m ，g c - m s ) 联用实现的，由于脂肪酸本 身挥发性较小，所以要将脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯以增加脂肪酸的挥发 7 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 性，供g c 或g c m s 分析利用。 1 4 3 应用 1 4 3 1f a m e 谱图分析方法在微生物鉴定中的应用 脂类是最常见的生物标志物，现代微生物学研究表明：各种微生物具有其特 征性的细胞脂肪酸指纹图谱，它和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等有极为密切 的关系，它的种类和含量是细胞化分类法的重要信据之一【5 4 1 。脂类作为标志物用 于细菌鉴定早在6 0 年代就开始了【4 8 1 。利用g c 或g c m s 分析微生物细胞的脂肪酸 分布，是从细胞组分水平上鉴定微生物的重要内容，开辟了一个微生物检测和鉴 定的新途径。不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异，它和微生物的遗 传变异、耐药性等有极为密切的关系。大多数革兰氏阳性菌( 中支链c 1 5 ：0 j 旨 肪酸丰度很高，而在大多数革兰氏阴性菌( g - ) 菌q b c l 6 ：0 丰度较耐5 5 】。一些细菌 如考克斯氏属、土拉弗朗西丝菌属【5 6 1 、假单胞菌属和结核分枝杆菌属细菌网有 其特殊的脂类，可经磷脂脂肪酸分析实现鉴定。短链脂肪酸已经用于陆源厌氧细 菌的鉴定。t o s h ik 成功的测定了分枝杆菌属4 株菌的脂肪酸，确定其主要由1 6 种 脂肪酸组成，并分析了它们之间的差异【5 8 1 。张文君等报道海洋细菌不同属的脂肪 酸甲脂链的长短、双键位置及取代长度会各有差异，这意味着甲脂化可以作为海 洋细菌的分类和鉴定的一种方法【5 9 1 。张国赏等用气相色谱质谱法检测细胞脂肪 酸，成功地鉴定了7 个属的1 2 株斟矧。 根据微生物细胞脂肪酸的组成，一般可通过单次实验比较准确的将微生物 鉴定到种，但是脂肪酸是一种可随着培养条件变化而发生改变的细胞组分，并 且气相色谱、质谱等是高精密度的分析仪器，因此，分析过程的条件选择和质 量控制则显得非常重要，必须对培养基成分、微生物培养条件、微生物纯化、 菌龄、色谱条件等实验条件进行标准化，否则会严重影响方法的准确度和重复 性。目前已有一种商业化的微生物f a m e 气相色谱分析系统，即s h e r l o c km i s 微生物鉴定系统( 美国m i d i 公司开发) ，s h e r l o c km i s 微生物鉴定系统从微生物 的培养、菌落的收集、微生物细胞皂化释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲 酯的萃取和洗涤，到最后的鉴定、结果的判断都有一套完整的标准化程序，可 以避免上述不利条件的影响。微生物在标准的培养条件下培养和收获，经过氢 氧化钠和甲醇试剂皂化和甲基化，通过正己烷和叔丁基乙醚的萃取，再经氢氧 化钠洗涤后，注入g c 系统中分析。系统根据各脂肪酸组分保留时间计算等链 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 长( e c l ) 值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量， 再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度( s i m i l a r i t yi n d e x ，s i ) ， 从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高s i 的菌种名称作为鉴定 结果，但当其报告的几个菌种的s i 比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长 特性进行综合判断。s h e r l o c km i s 微生物鉴定系统分析的脂肪酸碳原子数是 9 - 2 0 之间，碳原子数小于9 或者大于2 0 的脂肪酸不被该系统分析。s h e r l o c km i s 微生物鉴定系统具有分析周期短、操作简单、准确度高等优点，目前国内外已 有将s h e r l o c km i s 应用于微生物鉴定的文献报道【6 0 , 6 1 】。 1 4 3 2f a m e 谱图分析方法在微生物多样性研究中的应用 生物多样性是当今国际上共同关注的问题，它也因此日益成为学术界的热点 研究领域之一。土壤微生物群落多样性一直是微生物生态学研究的重要内容。总 f a m e 谱图中某些特征脂肪酸可以分别表征细菌、真菌和放线菌，且大多数情况 下磷脂脂肪酸的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势【6 2 , 6 3 】，至今，函经 积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据。一般来说，生物细胞膜中所含 的p l f a 有以下规律：真菌大多含有多个不饱和键，c 1 8 ：2 w 6 ，9 及c 1 8 ：3 w 6 可作为 真菌生物量的指标( f a m ef u n g i ) ；细菌往往不含有多个不饱和键的脂肪酸，它含 有的主要是链长为奇数的、带支链的、主链上含有环丙基或羟基的脂肪酸， i c l 5 ：0 、c 1 5 ：0 7i c l 6 ：0 、c 1 6 ：1 w 7 t 、c 1 7 ：o 、c y c l 7 ：0 、c y c l 9 ：0 、c 1 8 ：1 w 7 1 拘含量 可作为细菌生物量的指标( f a m eb a c t e r i a ) ；1 0 m e c l 8 ：0 代表放线菌指标；g + 含有 较大比例的带支链的脂肪酸；g 含有较大比例的羟基脂肪酸。 f a m e 谱图分析方法除广泛用于土壤微生物多样性的分析外，还应用于沉积 物、地下水，以及与水处理相关的生物膜和菌胶团等微生物群落结构和功能的研 究中【6 4 6 5 1 。r o b e r th f i n d l a y 等人于1 9 8 9 年用f a m e 谱图分析方法测定了深海沉积 物中的微生物生物量，为人们提供了一种分析沉积物样品生物多样性的简便方法 惭】。f a m e 谱图分析可以用来指示地下水微生物在各种环境压力下的生理状况 【6 7 】。d a v i dc w h i t e 和r o b e r th f i n d l a y 用磷脂脂肪酸甲酯方法和其他方法相结 合，分析生物膜上捕食( p r e d a t i o n ) 效应对微生物生物量、群落结构、营养状况、 新陈代谢活动的影响【4 9 】。 1 5 本论文的研究内容、目的及意义 细菌性细菌性青枯病是危害严重的植物病害，其分布范围之广，为害作物种 9 青枯雷尔氏菌脂肪陵多态性研究 类之多，引起了各国植病工作者的关注。1 9 7 6 年，在美国举行了第一届国际细 菌性青枯病学术研讨会【6 8 】；1 9 8 5 年，在菲律宾又举行了亚太地区细菌性青枯病 学术研讨会；1 9 9 2 年在中国台湾举行了亚洲细菌性青枯病学术研讨会【6 9 1 ；1 9 9 4 年在中国武汉召开了花生细菌性枯萎病害研讨会【7 0 】；1 9 9 7 年，在法国举行了第 二届国际细菌性青枯病学术研讨会；2 0 0 2 年初，在南非又举行了第三届国际细 菌性青枯病学术研讨会，各国植病工作者都极为关注细菌性青枯病的研究，以期 能在世界范围内控制细菌性青枯病害。 对于细菌性青枯病的防治，前人已做了大量的工作，提出了多种防治措施。 农业轮作防治方法是防治细菌性青枯病的有效措施【7 1 , 7 2 】，但是由于我国人多地 少，耕地有限，此措施运用受到极大的限制，所以轮作措施也只是在局部地区起 到部分防治作用【7 3 1 。从理论上讲，细菌性青枯病防治最根本的防治办法是培育抗 病品种【7 4 】，国外已有这方面报道，采用培育抗病品种的方法，培育了8 0 种抗细 菌性青枯病的品种【7 0 1 。但是，青枯雷尔氏菌为土传病害，其腐生性较强，存在着 许多不同的生理小种，抗病育种工作就显得更为复杂和艰巨【7 5 1 。在化学防治上， 虽然室内的毒力测定筛选出不少对青枯雷尔氏菌有较好抑制作用的药剂【_ 7 6 1 ，由于 病原细菌从土地表层到深层均有分布，由根部侵入植株移到导管而引起细菌性青 枯病【7 7 】，所以田间防治效果不稳定，难以控制病害【7 8 】，迄今为止还没有一种化 学农药可以有效地控制细菌性青枯病的发生，青枯雷尔氏菌对化学农药产生抗药 性，大量使用化学农药造成环境污染和生产成本的上升，所以化防也不是经济合 理的措施【3 2 】。 近年来，细菌性青枯病的生物防治越来越引起国内外的重视【_ 7 9 】。用于细菌性 青枯病生物防治的因子主要集中于a b p s 、链霉菌、假单胞杆菌、芽孢杆菌、菌 根真菌等。目前已发现对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的微生物主要有：多粘芽孢杆 菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 、荧光假单胞杆菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) f f t l 其它的芽孢杆 菌方面的拮抗菌，国内外有不少研究用这些拮抗菌防治细菌性青枯病，取得不同 程度成功的例子，如弱毒力青枯雷尔氏菌的利用8 0 1 、荧光假单胞杆菌【8 l 】等。尽 管如此，青枯雷尔氏菌的生物防治还不能适应生产需要，细菌性青枯病生防菌仍 处于研究阶段，防治效果不稳定，青枯雷尔氏菌的生物防治仍然存在许多困难。 而通过土壤添加剂改造土壤中微生态环境，使之向不利于细菌性青枯病的转化， 能起到防治细菌性青枯病的目的【8 2 】。 l o 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态件研究 大量的研究资料表明，青枯雷尔氏菌是一个种下分类复杂、易发生变异的作 物病原菌，呈现出明显的多态性分布。种种证据表明，目前青枯雷尔氏菌存在着 各种防治手段难以完全奏效的问题，与该菌复杂的异源性及组成类型复杂有关。 青枯雷尔氏菌致病性有明显的强弱之分，强