（纺织工程专业论文）家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究.pdf

。 f ll 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属在 年一月解密后适用本规定。 非涉密论文口 、i 论文作者签名： 堑益缝 日 期：圭翌! 咝塑丝日 导师签名： 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究中文摘要 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 中文摘要 丝素蛋白具有良好的生物相容性，可制成具有一定力学性能的三维多孔材料，这 些优点使得丝素蛋白材料作为组织再生支架拥有更广阔的前景。无论是在体外还是体 内完成组织的再生，材料还需具备的一个重要条件是：降解速率与组织的再生速率相 匹配。但是迄今为止，国内外对丝素蛋白材料生物降解速率的影响因素及调控方法尚 缺少研究。本文在体外模拟体内环境的条件下，用胶原蛋白酶认催化水解丝素蛋白 多孔材料，着重研究丝素蛋白材料的二级结构( 尤其是p 折叠结构所占比例) 及孔结构 与降解速率之间的关系，并借助扫描电镜( s e m ) 、x 埘线衍射( x r d ) 、红外吸收光谱 ( f t i r ) 等手段对降解前后丝素蛋白的微观形貌、多孔结构及二级结构进行研究，以此 希望能够找出丝素蛋白材料的二级结构及孔结构对生物降解速率的影响规律。本文还 探索了丝素蛋白多孔材料植入动物真皮缺损部位后的降解情况。 采用冷冻干燥法制备家蚕丝素蛋白多孔材料。通过调节冷冻温度和采用不同的后 处理方法，制得了不同二级结构的家蚕丝素多孔材料。用x 射线衍射( x r d ) 和红外吸 收光谱( f t m ) 进行定性和定量分析，得到各组材料中不同类型的二级结构所占比例。 将不同二级结构的家蚕丝素多孔材料放入胶原酶认的缓冲溶液c p i - i7 4 ，3 7 ) 进行 体外降解实验，结果表明，随着p 靳叠结构含量的增多，材料的降解速率减慢。在酶 降解过程中，丝素蛋白中规整性较差的非结晶区域首先被破坏而溶解，从而导致降解 残留物的凝聚态结构规整性有了一定程度的提高，结晶度有所提高。 通过调节不同丝素溶液浓度和冷冻温度，制得了不同孔结构的家蚕丝素多孔材 料。用电镜( s e m ) 和排液法测得各组材料的孔结构参数。将不同孔结构的家蚕丝素多 孑l 材料放入胶原酶认的缓冲溶液c p h7 4 ，3 7 ) 进行体外降解实验，结果表明，随 着孔径和孔隙率的增大，材料的比表面积增大，酶分子可接触的面积增大，材料的降 解速率加快；随着材料密度的增大，孔壁增厚，酶分子很难进入孔内部进行降解，其 降解速率减慢。 丝素蛋白多孔材料植入s d 大鼠背部真皮缺损部位的体内实验结果表明，第5 5 天，新生组织形态接近正常真皮组织，材料降解了9 6 3 7 。 中文摘要 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 通过以上研究表明，丝素蛋白材料内部1 3 - j 扩f 叠结构含量的多少以及不同的孔结构 参数能够影响丝素蛋白降解速率。所以，提高丝素蛋白材料内部p 哳叠结构的含量可 以有效地减缓材料的降解速度；通过减小材料的孔径和孔隙率或增大材料的密度，从 而减小材料的比表面积或增大孔壁厚度，也可以减缓其降解速率。这些方法为制备可 调控生物降解速率的丝素蛋白生物材料提供了可行性。 关键词：家蚕；丝素；多孔材料；结构；生物降解性能 作者：张琴 指导老师：李明忠 t h eb i o d e g r a d a t i o nb e h a v i o ro fp o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i nm a t e r i a l s a b s t r a c t t h e b i o d e g r a d a t i o nb e h a v i o ro f p o r o u sb o m b y xm o r i 骺 s i l kf i b r o i nm a t e r i a l s a b s t r a c t s i l kf i b r o i nw a san a t u r a lp r o t e i np r o c e e db yb o m b y xm o r i i te x h i b i t e dau n i q u ea n d u s e f u lc o m b i n a t i o no fp r o p e r t i e ss u c ha sg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , t h r e e - d i m e n s i o n a lp o r o u s m a t e r i a l sw i t he x c e l l e n tm e c h a n i c a l t h e s ef e a t u r e sp r o v i d e de a r l yc l u e st ot h eu t i l i t yo f r e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i na sas c a f f o l d m a t r i xb i o m a t e r i a lf o rt i s s u ee n g i n e e r i n g t h es i l k f i b r o i ns c a f f o l du s e df o rt i s s u ee n g i n e e r i n gs h o u l dd e g r a d ei nar a t et om a t c ht h ef o r m a t i o n s p e e do fan e wt i s s u eo ro r g a n t h e r e f o r e ，t w ob a s i cf a c t o r s ，c o n f o r m a t i o na n dp o r es i z e ， w e r es t u d i e di nt h i ss t u d yt oc o n t r o lt h ed e g r a d a t i o nb e h a v i o ro fs i l kf i b r o i ns c a f f o l d s ，w i t h t h em e t h o d so fx r d ，f t i r ，s e ma n ds oo n ? h e r e ，t h ec o l l a g e n a s ei aw a su s e da st h e p r o t e o l y t i ce n z y m et od e g r a d ep o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i nm a t e r i a l si nv i t r of o r s i m u l a t i n gv i v oc o n d i t i o n t h ep r e s e n ts t u d yw a sa l s oc o n d u c t e d t oi n v e s t i g a t et h e b e h a v i o ro ft h ep o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i ni nv i v o ( u pt o5 5d a y s ) i ns dr a t s t h ep o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i nm a t e r i a l sw i t hd i f f e r e n tc o n f o r m a t i o nw e r e p r e p a r e db yc o n t r o l l i n gt h ef r e e z i n gt e m p e r a t u r ea n dt h et r e a t m e n to fe d c n h s m e so r a l c o h 0 1 t h r o u g hq u a n t i t a t i v ea n a l y s i si nx r d a n df t i r ，t h eq u a n t i t a t i v ep r o p o r t i o n so f e a c hc o n f o r m a t i o nw e r eo b t a i n e d t h e ne a c hg r o u p sw a sd e g r a d e di nv i t r ow i t h c o l l a g e n a s ei af o r 18d a y s t h er e s u l t ss h o w e dt h a th i g hc o n t e n to f 3 - s h e e ts t r u c t u r e l e a d e dt ol o wd e g r a d a t i o nr a t e t h er a n d o mc o i lr e g i o ni nt h ep o r o u sb o m b y xm o r is i l k f i b r o i nm a t e r i a l sd e g r a d e d ，w h i l et h ec r y s t a lr e g i o nk e p ts t a b l ea n dt h ec r y s t a l l i n i t y i n c r e a s e dd u r i n gi n c u b a t i o n t h ep o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i nm a t e r i a l sw i t hd i f f e r e n tp o r es i z ew e r ep r e p a r e d b yc o n t r o l l i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fs i l k f i b r o i ns o l u t i o na n dt h ef r e e z i n gt e m p e r a t u r e t h r o u g hq u a n t i t a t i v ea n a l y s i si ns e m a n df l u i d - d i s c h a r g et h e r a p y , t h eq u a n t i t a t i v er e s u l t s o fp o r ep a r a m e t e rw e r eo b t a i n e d t h e ne a c hg r o u p sw a sd e g r a d e di nv i t r ow i t hc o l l a g e n a s e i af o r1 8d a y s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t b i gp o r es i z ea n dp o r o s i t yl e a d e d t of a s t d e g r a d a t i o nr a t ea st h ee n z y m ec o u l de a s i l yc o n t a c tt h ec l e a v a g es i t e ，a n dt h eb i gd e n s i t y l e a d e dt ol o wd e g r a d a t i o nr a t ea st h et h i c k n e s se f f e c t so f p o r ew a l l s i nv i v od e g r a d a t i o nr e s u l ts h o w e dt h a tt h ef o r mo fc a m b i u mw a sc l o s e l ys i m i l a rw i t h i g a b s t r a c t t h eb i o d e g r a d a t i o nb e h a v i o ro fp o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i n m a t e r i a l s t h en o r m a ls 协l c t u r ea f t e r5 5d a y s ，a n dt h ep o r o u sb o m b y xm o r is i l kf i b r o i nm a t e r i a l s d e g r a d e da p p r o x i m a t e l y 9 6 3 7 t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e x lt h a tt h r o u g hc o n t r o l l i n gt h ep a r a m e t e r ss u c ha s1 3 - s h e e t s t r u c t u r ec o n t e n ta n dp o r es i z ep a r a m e t e r , i ti sp o s s i b l et oc o n t r o lt h eb i o d e g r a d a t i o no ft h e p o r o u ss i l kf i b r o i ns h e e t s k e y w o r d s ：b o m b y xm o r i ；s i l kf i b r o i n ；p o r o u sm a t e r i a l s ；s t m c t i 】i e ；b i o d e g r a d a t i o n i v w r i t t e n b y ：q i nz h a n g s u p e r v i s e db y ：m i n g z h o n gl i 目录 第一章引言1 1 1 家蚕丝素蛋白1 1 2 家蚕丝素蛋白在生物医学领域的应用5 1 3 家蚕丝素蛋白材料生物降解性能的研究概况7 1 4 胶原蛋白酶i a 9 1 5 本文的研究目的和主要内容1 0 第二章家蚕丝素多孔材料的二级结构与酶降解性能的关系1 1 2 1 材料与方法1 1 2 2 结果与讨论1 6 2 2 1 不同制备条件下得到的家蚕丝素多孔材料的结构分析1 6 2 2 2 不同二级结构韵家蚕丝素多孔材料在酶降解过程中的结构变化2 1 2 2 3 不同二级结构的家蚕丝素多孔材料在酶降解过程中的形态变化4 3 2 2 4 家蚕丝素多孔材料降解产物的氨基酸含量分析4 7 2 2 5 不同二级结构的家蚕丝素多孔材料在酶降解过程中的质量变化4 9 2 3 小结。5 6 第三章家蚕丝素多子l 材料的孔结构与酶降解性能的关系5 7 3 1 材料与方法5 7 3 2 结果与讨论6 1 3 2 1 不同制备条件下得到的家蚕丝素多孔材料孔结构的分析6 1 3 2 2 不同孔结构的家蚕丝素多孔材料在酶降解过程中的形态变化6 7 3 2 3 不同孔结构的家蚕丝素多孔材料在酶降解过程中的质量变化7 0 3 3 小结7 7 第四章家蚕丝素多孔材料体内降解性能的初步研究7 8 4 1 材料与方法7 8 4 2 结果与讨论8 0 4 2 1 丝素多孔材料和p v a 海绵的孔结构8 0 4 2 2 肉眼观察8 0 4 2 3 体内降解程度( h e 染色图) 8 2 4 3 小结8 3 第五章结语8 4 5 1 全文结论8 4 5 2 本文的主要研究成果8 4 5 3 今后进一步的研究计划。8 5 参考文献8 6 附录i 图2 1x r d 的分峰拟合图9 3 附录图2 _ 4 酰胺i 区f t i r 的分峰拟合图9 4 附录图2 - 6x r d 的分峰拟合图。9 5 附录图2 - 9x r d 的分峰拟合图9 6 附录v 图2 1 2x r d 的分峰拟合图9 7 附录图2 1 5x r d 的分峰拟合图9 8 附录v i i 图2 1 9 酰胺i 区f t i r 的分峰拟合图9 9 附录v i i i 图2 - 2 3 酰胺i 区f t i r 的分峰拟合图1 0 0 附录图2 - 2 7 酰胺i 区f t i r 的分峰拟合图一1 0 1 附录x 图2 - 3 1 酰胺i 区f t i r 的分峰拟合图1 0 2 攻读硕士学位期间发表的论文1 0 3 致谢1 0 4 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 第一章引言 1 1 家蚕丝素蛋白 第一章引言 帚一早jl百 家( 桑) 蚕丝蛋白由家蚕( b o m b y xm o r i ) 绢丝腺内壁上的内皮细胞合成、分泌。蚕 吐丝时，后部绢丝腺合成和分泌的液状丝素，流入中部绢丝腺时被液状丝胶包围，靠 腺腔内的压力，绢丝液被送往前部丝腺，经过一系列生物化学、物理过程后完成纤维 化，从吐丝口“吐”出后形成扁平椭圆型的蚕丝。其中，丝素蛋白占总重量7 0 左右， 而丝胶约占2 5 ，其余5 为杂质【1 1 。丝胶蛋白可溶于热水，力学性能差，通常人们 可通过脱胶过程将其与丝素蛋白分离。 1 1 1 丝素蛋白的组成 。 表l - 1 丝素蛋白的氨基酸组成1 2 1 | n a t i v eb m o r r e g e n e r a t e db m o r a m i n oa c l d f i b r o i n ( )f i b r o i n ( ) a s p a s n 2 41 5 t h r1 60 8 s e r1 2 31 0 8 g i u g l n1 2 o 9 p r o 0 70 5 g l v4 3 54 6 2 a l a2 8 02 9 7 c y s 0 1 一 v a l 2 o2 1 m e t 0 1o 1 e0 6 0 6 l e u 0 50 4 t y r 5 0 4 9 p h e0 7 0 6 h i s 0 2 0 2 l y s 0 5 0 3 a r g 0 60 4 家蚕丝素是一种纤维状蛋白，氨基酸组成见表1 1 。其中，甘氨酸( g l y ) 含量大概 占4 6 ，丙氨酸( a l a ) 约占2 9 ，丝氨酸( s e t ) 约为1 2 ，这些侧基较小的氨基酸主要 第一章引言 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 位于丝素蛋白的结晶区，而侧基较大的氨基酸如苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t 妯和色氨 酸( t 印) 等则主要位于非晶区【3 叫。 丝素蛋白的分子量约为2 2 8 6k d a ，它是由重链( h 链，分子量3 5 0k d a ) 、轻链 ( l 链，分子量2 5 8k d a ) 及糖蛋白p 2 5 ( 分子量2 8k d a ) 组成，三者比例为 h ：l ：p 2 5 = 6 ：6 ：1 ，重链和轻链由各自c - 末端的二硫键相互连接形成复合体，p 2 5 糖蛋白 以非共价相互作用加入复合体中，有助于形成稳定的轻重链复合【5 】。 h 链【6 - 7 1 是丝素中的主要部分，由5 2 6 3 个氨基酸残基组成。丝素h 链包括结晶区 和无定形区，结晶区由约含7 0 个残基的亚域组成，亚域氨基酸序列一般以g a g a g s 重复开始，以g a a s 终止，其中g a g a g s 重复最多达1 5 次。结晶区占肽链总长的 9 4 ，亚域内g l y - x 进行高度规律地交替排列，其中x 为：a l a 约6 5 ，s e r 约2 3 ， t y r 约9 ，v e r 约3 。无定形区包括n - 末端2 1 个氨基酸残基的信号肽和1 3 0 个非 重复的氨基酸残基、c _ 末端的5 0 个氨基酸残基、以及将结晶区分隔为1 2 个亚域的非 重复的4 2 - 4 3 个氨基酸残基的间隔区，间隔区的主要序列比较稳定，包含下列氨基酸 残基：g a g a g a g a g a g t g s s g f g p y va n g g y s g y e y a w s s e s d f g t g s 。结晶区 每个亚域内还有g a g a g y ( g a g a g v g y ) 六肽或八肽重复形成的半结晶域。 l 链中含有3 个半胱氨酸残基，其中2 个半胱氨酸形成分子内二硫键，第三个胱 氨酸残基位于c - 末端较亲水区域内，与丝素蛋白h 链第5 2 4 4 号氨基酸形成链间二硫 键，组装成丝素蛋白【8 】。在丝素蛋白的分子链中，l 链的氨基酸残基排列没有重复性。 从侧链的疏水性来看，丝素蛋白的h 链和l 链的氨基酸疏水侧链和亲水侧链均非常 规整地相间排列。疏水嵌段由4 1 0 个丙氨酸残基通过单个丝氨酸残基连接构成，疏 水程度较小的嵌段含有高度集中的甘氨酸残基，长度较疏水嵌段长一些，而且在长度 和成分上更易变化，是结晶和半结晶区的主要成分。 p 2 5 蛋白是一种糖蛋白，由p 2 5 链和3 个寡糖链组成。p 2 5 链基因由2 2 0 个氨基 酸残基组成，前1 7 个氨基酸是信号肽。p 2 5 链中含有8 个半胱氨酸，形成4 个分子 内二硫键。主要控制丝素蛋白的折叠，透过疏水作用、氢键诱导丝素蛋白进行p 哳叠， 形成规整的结构，可能与蚕液晶纺丝机理有关1 9 】。 上述的h 链既通过结晶区又通过非结晶区，而l 链只存在于非结晶区。h 链( 包 括处于结晶区和非结晶区中的h 链) 及l 链的氨基酸组成如表1 - 2 所示。 2 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究第一章引言 表l - 2 h 链和l 链的氨基酸组成( t 0 0 1 ) 氨基酸 结晶区h 蒹结晶区( 只存在鬈结 乙氨酸g l y 4 6 8 丙氨酸a l a3 5 0 丝氨酸s e r1 5 3 酪氨酸t y r 1 7 2 缬氨酸v a l 0 3 9 天门冬氨酸a s p 0 1 0 谷氨酸g l u 0 1 2 苏氨酸t h r0 2 5 苯丙氨酸p h e0 1 9 蛋氨酸m e t0 异亮氨酸e 0 0 6 亮氨酸l e u 0 脯氨酸p r o 0 精氨酸a r g 0 组氨酸h i s 0 1 1 2 丝素蛋白的二级结构 蛋白质的构象主要可分为a 螺旋( a - h e l i x ) 、p 哳叠( 3 - s h e e t ) 、p - 转角及无规卷曲结 构等。其中，p 哳叠构象有平行p 哳叠和反平行1 3 - - 折叠两种。反平行b 折叠构象因其 分子链段间的组装( 氢键相互作用) 良好，能量处于最低状态，因此也最稳定。而丝素 蛋白分子链中存在许多无侧基或者侧基很小的氨基酸重复多肽片段( g i y - x - ) ，这些片 段结构规整，通过氢键作用能够很好地紧密堆积形成稳定的反平行1 3 - 1 5 吁叠构象( 图 卜1 ) t 1 0 1 。 家蚕丝素纤维中包含结晶区和非结晶区，两者交互排列，h 链交替穿过结晶区和 非结晶区。对于家蚕丝素的结晶形态，清水正德首先发现家蚕丝素的两种结晶形态： 型和p 型。在其后，k r a t k y 证明了两种结晶形态的存在，并指出丝素q 型的分子结 构并非一般蛋白质中的a 螺旋结构。为避免混淆，通常把丝素的q 型和b 型称为s i l k i 和s i l ki i 。s i l ki 的晶体结构模型由b l o t s 1 1 1 提出，另外平林洁、小西孝等【12 】也对 其进行过研究，其立体构象呈曲柄型，是介于a 螺旋和p 哳叠之间的一种中间形态。 s i l k i i 的晶体结构模型由m a r s h 1 3 1 根据x 射线衍射结果提出，是反平行p 哳叠层结构， 3 5 7 5 0 5 9 7 3 2 4 2 5 5 3 3 殳h&屯丘m&王cri m z z 乱z舛n田酪他记汐稻n铉凹钞：2 4 1 7 8 3 l 1 l 0 0 0 0 0 o 0 第一章引言家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 属斜方晶系，由肽链构成折叠层，再由折叠层形成整个s i l kl i 晶体。高桥等对s i l ku 的晶体结构模型进行了修正。r e g i n a 等人1 1 4 】在丝素溶液与空气界面上中发现了新的 丝素结晶形态，称之为s i l kh i ，其晶体结构和聚甘氨酸相似，属于六方晶系，肽 链的构象为b 折叠螺旋。 在结晶结构的丝素尤其是d 晰叠结构中，肽链链段的排列较整齐，相邻链段之间 的氢键和分子间引力使它们结合得相当紧密，抵抗外力拉伸的能力强，柔软度低，在 水中难以溶解，对酸、碱、盐、酶及热的抵抗力较强。在非结晶区丝素中链段的排列 不整齐，链段之间的结合力较弱，在水中易溶胀，柔软度高，抵抗力拉伸的能力弱， 吸湿性强，对酸、碱、盐、酶和热的抵抗力较弱。 丝素蛋白材料结构的变化与很多因素相关。例如，在用冷冻干燥法制备丝素多孔 支架时，丝素溶液的冷冻温度分别控制在低于和高于- 2 0 ，可以分别得到基本是无 定形结构和g t 型结构的多孔支架；高于- 2 0 预冻后再反复的解冻拎冻工艺可以调节 a 型结构的含量，从而可以调节丝素多孔支架的结晶度。基本是无定形结构的多孔支 架经过热处理或乙醇、甲醇处理后，可以得到d 折叠结构含量较高的多孔支架【1 5 1 。 图1 1 丝素蛋白的反平行p 哳叠构象 1 1 3 丝素蛋白多孔材料 目前，制备三维丝素支架材料的方法很多，有冷冻干燥法，盐析法【1 6 - 1 8 ，气体发 泡法，乳液冻干法、静电纺丝法等。 m i n g z h o n gl i 1 5 1 等采用冷冻干燥法制备丝素多孔支架，通过调节丝素溶液浓度、 冷冻温度及反复冻撒次数，可以调节支架的孔隙率和孔径等孔结构参数。多孔丝素 4 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究第一章引言 材料的孔是其中的冰升华所留下的孔隙。在丝素溶液冷冻过程中，当丝素溶液中的水 的温度低于冰点而过冷却时，由于热交换而产生了微小的冰核，只要过冷却的程度足 以使不稳定相( 丝素溶液相) 中水的化学势比冰核高，冰核便可以成长为较大的冰粒 子。而周围的丝素溶液则相应地被浓缩，使处于无规卷曲结构的丝素分子间距离缩短， 不同线团上的链段相互贯穿，形成了连续的丝素相。由于处于玻璃态的丝素将阻碍水 分子的运动，故这一过程持续到丝素的玻璃化温度为止。其后将分散在丝素相中的冰 升华后，便形成了多孔丝素材料。从上述多孔丝素膜孔的形成过程不难看出，多孔丝 素膜的孔密度与单位体积内冰核的数量成正比，即冷冻时所产生的冰核数量越多，则 经真空干燥后所得到的多孔丝素膜的孔密度越大；孔径则取决于冰粒子的大小，即冷 冻时所产生的冰粒子越大，则经真空干燥后所得到的多孔丝素膜的孔径越大。 k i mu j t l 7 】等通过调整丝素水溶液的浓度和选用不同尺寸的n a c l 颗粒，制备结构 和性质可控的支架。制备支架时，丝素蛋白由无规卷曲向p 折叠结构转变。盐使水分 子脱离丝素内的疏水区域，促进链链间的疏水性相互作用，形成b 一折叠结构。随后 将不同浓度和不同孔径的三维丝素支架材料进行体外酶降解实验，结果表明，孔径的 大小与降解速度无关，与丝素溶液的最初浓度和蛋白酶浓度有关。丝素溶液的最初浓 度越大，降解越慢；蛋白酶浓度越大，降解越快。 y o n g z h o n gw a n g t l 9 】等通过调节丝素浓度和孔径大小，制备了不同形态结构的三 维丝素支架材料，在体内进行了2 到6 个月的降解实验，结果表明，丝素支架材料在 体内的降解与其形态结构有密切相关的联系，浓度越大，孔越小的丝素支架材料难以 被降解。 1 2 家蚕丝素蛋白在生物医学领域的应用 生物医用材料是一类与生命系统相作用，用以诊断、治疗、修复和替代人体病变或 损伤的组织、器官，或增进其功能的材料。当今的前沿研究领域是组织工程材料和组织 诱导材料，其特征是在分子水平上模拟特定细胞和基因特异性反应，使材料具有主动诱 导、激发人体组织和器官的再生修复能力，能参与人体物质交换并产生相互结合。 理想的组织工程或组织诱导支架材料至少应具备以下几个条件：( 1 ) 有良好的生 物相容性，其本身及降解产物对细胞和机体无毒性，不会或较少引起炎症和免疫排斥 反应；( 2 ) 良好的表面相容性，即材料表面具有足够的细胞吸附能力，有利于细胞的 s 第一章引言家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 粘附、分化和增殖；( 3 ) - - 维多孔结构，孔的尺寸应能允许细胞的生存，且孔与孔之 间相互贯通以利于细胞营养物质和代谢产物的输送；( 4 ) 有一定的力学强度，以支持 新生组织的生长，并能被生物降解。此外，制作支架的原料来源充足，易于加工成型 并重复制作1 2 0 - 2 1 1 。 以往国内外已对家蚕丝素材料的生物性能进行了较全面的研究，家蚕丝素蛋白是 性能优良的生物材料，湿态下具备很好的力学性能、抵抗酶解能力。再生的家蚕丝素 材料具备良好的透氧性【2 2 1 、无毒性、无刺激性，良好的生物相容性。国内外许多研究 已经从生物整体、细胞、分子生物学三个水平上证明了丝素蛋白的这些特性。家蚕丝 素纤维已临床用作手术缝合线达数十年。家蚕丝素材料现在还用作药物释放材料、抗 凝血材料、功能性细胞培养基质、生物传感器、人工韧带、人工肌腱、隐形眼镜、人 工皮肤、人工角膜及人工骨等【2 3 之引。 i l a r i a 等【2 9 】在鼠的皮下植入家蚕丝素多孔材料，六个月后发现，丝素多孔材料不 仅具有良好的生物相容性，而且还能诱导网状结缔组织血管物质的再生。 k u n i y o 等例研究了哺乳动物细胞在丝素蛋白涂层、胶原蛋白涂层和亲水基涂层 的聚苯乙烯上的反应。研究结果表明细胞在丝素蛋白涂层和胶原蛋白涂层上粘附、分 化和增殖的情况几乎一样，分别比在亲水基涂层的聚苯丙乙烯上高3 0 和5 0 。丝 素蛋白和胶原蛋白都能促进细胞的生长，并且丝素蛋白完全可以替代胶原蛋白作为细 胞培养的基质材料。 b r u c e 3 1 1 将r a w2 6 4 7 鼠的巨噬细胞接种到家蚕丝素纤维材料上，结构显示不论 是长期还是短期培养，巨噬细胞都表现出免疫惰性。 k a p l a n 等 3 2 - 3 3 1 对丝素蛋白支架材料用于骨组织工程方面进行了研究，研究结果 指出，丝素蛋白材料支持h m s c s ( 人骨髓间充质细胞) 的生长和分化，有利于骨的 生成。他们还把种植了h m s c s 的丝素蛋白支架材料用于体内和体外培养，实验证明 经过体外培养的h m s c s 丝素蛋白复合支架材料具有良好的成骨能力，能够治愈临界 尺寸的骨缺损。 n o r i h i k om i n o u r a 3 4 1 等人报道接种在家蚕丝素基质上的成纤维细胞l 9 2 9 的粘附 和生长状况与胶原基质上的一样；而柞蚕丝素基质比家蚕丝素基质有更高的细胞粘率 附和生长率。 m a s u h i r ot s u k a d a t 3 5 1 表明其它哺乳动物细胞在家蚕丝素膜上也具有很好的黏附。 6 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 第一章引言 d a v i dlk a p l a n 3 6 1 评价了人的主动脉内皮细胞和冠动脉平滑肌细胞在家蚕丝素无 纺网上的细胞应答。第四天人的主动脉内皮细胞在支架上形成短带状结构，第七天形 成带腔的毛细血管网络，而人的冠动脉平滑肌细胞在支架上可以保持细胞表型并形成 细胞外基质，证明血管细胞和丝素网间具有良好的相互作用，可应用于血管组织工程。 x i a o s o n gg u t 3 7 1 将老鼠的背根神经节移植在丝素纤维支架，4 天后发现细胞沿着纤 维定向生长并有神经炎生长；把神经鞘细胞培养在纤维浸出液中，其形态与活力与在 普通培养基无明显差别，表明丝素纤维与背根神经节的相容性较好，丝素纤维对神经 鞘细胞无细胞毒性。在此研究基础上，他们把丝素纤维均匀分布到丝素溶液后，然后 冷冻干燥，得到的丝素神经引导管用来填补老鼠1 0m m 长的坐骨神经缺损，动物实验 结果表明丝素导管可以促进周围神经的再生修复【2 1 1 。 d a ip r a 等将家蚕丝素无纺网移植于皮下，发现丝素蛋白无纺网具有良好的生 物相容性，同时观察到新血管的形成，6 个月时观察到无纺网与皮下组织融合较好， 未见明显的降解。 l m e i n e l 等【3 9 1 将蚕丝丝素支架材料与已在体外诱导分化为成骨细胞系的人源间 充质细胞复合后植入裸鼠的临界尺寸股骨缺损部位，8 周后的新生骨生成，能基本连 接缺损，表明该材料能诱导新骨生成。 d a v i dlk a p l a n 4 0 】制得的家蚕丝素膜可以促进人和兔角膜细胞的增殖以及增加角 膜细胞外基质的表达，表明丝素膜符合作为角膜间质组织的替代物的要求。 吴徵宇等【4 l 】研制成功丝素创面保护膜，临床试验结果表明，该保护膜不但能防止 细菌感染，而且与创面粘合性好，对皮肤刺激性小。 1 3 家蚕丝素蛋白材料生物降解性能的研究概况 早在上世界6 0 年代，k o n i s h i 和t s u k a d a 等人h 2 - 4 4 为了研究丝素的结晶结构，就 曾用a 胰凝乳蛋白酶处理家蚕丝素纤维，水解去除其中的无定形区，获得高结晶度的 丝素蛋白，从而证明了无定形结构的丝素蛋白可以被蛋白酶降解。c h e n l 4 孓4 刀和 h i r a b a y a s h i 等人为了将丝素水解后用于食品添加剂和化妆品，曾用糜蛋白酶、羧化酶 等降解丝素纤维。m i n o t l r a 4 8 1 等人的研究指出，放线菌蛋白酶e 对丝素膜有降解作用。 a i r m a n l 4 9 】的报道中引用的商业数据指出，蚕丝手术缝合线植入体内1 年后基本失去了 强度，2 年后找不到具体位置。可见，上述对丝素蛋白降解性能的早期研究的目的虽 7 第一章引言家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 然各不相同，但已经基本说明丝素可以被生物降解，其降解机制是酶催化水解。 最近几年出现了几篇从生物医用支架材料的角度研究丝素蛋白材料生物降解性 能的论文。a r a i 等【5 0 1 用叶胰凝乳蛋白酶、胶原酶i a 和放线菌蛋白酶x x i 进行了家蚕 丝素纤维和丝素膜的体外降解实验，研究表明，浸渍在酶溶液中1 7 天内，丝素纤维 无明显的重量损失，但拉伸断裂强度和断裂伸长率显著下降；而丝素膜的重量损失和 力学性能下降都显著。 r e b e c c a 等【5 l 】用放线菌蛋白酶x i v 体外降解家蚕丝素纤维，持续观察了1 2 周， 随着降解时间的延长，丝素纤维的直径有所减小、力学性能有所下降。 a m o m t h e pk o j t h u n g 等人研究发现，丫射线辐照后，丝素纤维在酶溶液中降解沉 淀物随辐照剂量加大而增多。也有学者研究了丝素壳聚糖共混多孔材料的体外酶降 解，两周后质量损失1 3 1 8 ，四周后，质量损失1 6 6 5 。 t a d d e i 掣5 2 1 对柞蚕丝素膜的体外降解研究结果说明，放线菌蛋白酶x x i 能够攻 击柞蚕丝素蛋白中的无定形区，而螺旋区则对酶的抵抗能力强。酶降解1 7 天后， 柞蚕丝素膜重量降低7 0 。 w a n gw 等人研究了完全水处理法( 盐沥取法) 和有机溶剂处理( h f i p ) 制得的 丝素多孔材料的降解，发现水处理的多孔材料，s f 浓度4 时，在1t r i m 的放线菌 蛋白酶中1 0 天后，质量降解为原来的2 ，s f 浓度8 时降解到原来质量的2 0 ， 而六氟异丙醇( h f i p ) 处理的多孔材料降解则较慢。可见不同的处理方法，不同的 s f 溶液浓度对降解速率都有影响。w a n g ”】等分别在家蚕丝素的水溶液和六氟异丙醇 溶液中添加足量的食盐颗粒，使丝素析出，分别制得丝素蛋白多孔支架，植入大鼠皮 下观察1 年，所有动物的免疫反应都轻微，大多数丝素支架在2 - 6 个月内被完全降解， 从丝素的六氟异丙醇溶液制得的支架的降解速率较慢。 y u m i ny a n g 5 3 1 等人将丝素纤维和冷冻干燥法制成的丝素神经导管植入兔的皮下。 丝素神经导管在植入8 周后，质量损失2 5 ，1 2 周后质量损失6 5 4 ，2 4 周后，材 料基本完全消失。而丝素纤维在植入1 2 周后，质量损失1 0 ，2 4 周后质量降解到初 始质量的6 5 7 。 这些近年的研究结果进一步证明：丝素蛋白材料能够被降解、吸收，且其降解速 率与丝素蛋白的结构密切相关。 8 家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究第一章引言 1 4 胶原蛋白酶认 胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶( c o l l a g e n a s e ) ，它能在生理p h 和温度条件下 特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的 化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、p h 和导致蛋白质变性的各种因素均非常 敏感，极易受至u j b 界条件的影响而改变其本身的构象和性质。 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内 源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、 椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不 可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的 发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂，如本实验中 购买自s i g m a 公司的胶原酶队( 又称胶原酶i 型) 。 不同型号的胶原酶，其适用范围也不同。胶原酶i 可用于上皮、肺，脂肪和肾上 腺组织细胞的分离；胶原酶i i 适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的 分离：胶原酶i i i 用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动物组织细 胞解离；胶原酶i v 包含至少7 中蛋白酶成分，分子量从6 8 1 3 0k d 不等。它能消化 多种组织；胶原酶v 包含至少7 中蛋白酶成分，分子量从6 8 1 3 0k d 不等，它可用 于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 消化法中常使用的酶有3 种：胰蛋白酶、胶原酶i 或i i 以及透明质酸酶。透明质 酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用；胰蛋白酶作用较强，容易造成平滑肌细胞损坏； 胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，以胶 原i 为主。 胶原酶i a 能分解氨基酸残基结合部位如图1 2 所示 5 4 - 5 5 】；可以分解脯氨酸匮乏 的链段区域，如肽链氨基酸残基结合部位g l y _ l e u _ 和g l y q l e _ ；还可以消化水解亮 氨酸l e u 残基瞪6 - 6 0 。 某p 嘴l y - p 隆r - c l e a v a g es 摊e 图1 2 胶原酶i a 作用于蛋白质的切割位点 x 中性氨基酸 9 章引言家蚕丝素多孔材料生物降解行为的研究 本文的研究目的和主要内容 组织再生支架材料是当前生命科学和材料科学共同的前沿研究热点之一。组织工 程及原位组织再生支架材料起着细胞定位、引导组织再生、规范组织结构等作用。无 论在体外还是体内完成组织的再生，材料应能使细胞粘附并生长，不会引起炎症等不 良反应，能加工成三维结构且有较大的孔隙率，可被机体降解、吸收。除了这些要求 外，还需具备的重要条件是：降解速率与组织的再生速率相匹配【6 1 羽】。 因此，如何有效地调节丝素蛋白材料的生物降解速率是许多研究者共同关心的