（发育生物学专业论文）盐地碱蓬ssprx+q基因的克隆与功能鉴定.pdf

独创声明 x 5 9 8 8 6 a 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或 证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：喜予懈 球终 剥隧锄谬 签字日期：20 0 4 年年月谛日签字日期：200 4 年q - 月珊日 盐地碱蓬s s p r x0 基因的克隧与功能鉴定 盐地碱蓬s s p r xq 基因的克隆与功能鉴定 摘要 许多代谢反应像光合作用、光呼吸以及呼吸作用都可以产生活性氧，尤其是在极端 的环境中。活性氧不可避免的对生物大分子如脂质、蛋白质以及d n a 等造成氧化损伤， 但也可以作为信号分子调节基因的表达和酶活性并参与防御反应。因此活性氧必须被控 制在适当的水平以维持正常的细胞代谢。 生活在有氧条件下的生物形成了一系列抗氧化系统来保护细胞免受氧化损伤。一种 被称作过氧还蛋白( p r x ) 的不含血红素辅基的过氧化物酶家族最近引起人们的注意， 它广泛存在于所有的生物中，可以利用硫氧还蛋白( t r x ) 、谷氧还蛋白( g r x ) 以及 c y c l o p h i l i n a 等作为电子供体还原h 2 0 2 以及各种烷基过氧化物，生成水和相应的醇。大 量的研究表明p r x s 在光合，韧皮部代谢和环境胁迫中具有重要作用。植物中的过氧还蛋 白共分为四类：t - c y s p r x 、2 - c y sp r x 、t y p e i i p r x 以及p r xq 。其中p r xq 首先从佛甲草 ( s e d u m l i n e a r ) 中被克隆，与细菌铁蛋白共迁移蛋白( b c p ) 同源性很高。目前对p r x q 的许多研究主要集中在生化功能方面，而对它的生理功能、表达特点研究较少。 本实验通过e s t 随机挑取克隆测序的策略从盐地碱蓬叶片c d n a 文库分离得到4 个编码盐地碱蓬过氧还蛋白q ( s s p r xq ) 的部分c d n a 序列，通过5 - r a c e 的方法得 到5 端全长。由序列设计两端特异性引物，r t - p c r 扩增到s s p r xo 的全长c d n a 。序 列分析表明它与已经报道的其它物种中的s s p r x o 的蛋白序列具有较高的同源性。s s p r x q 基因全长1 0 0 3 u p ，含有一个编码2 1 4 个氨基酸的开放读码框，分子量约为2 4 k d a ， n 一末端有6 4 个氨基酸的叶绿体转运肽，定位于叶绿体中。s o u t h e r n 杂交表明s s p r xq 在 基因组中以单拷贝的方式存在。n o r t h e r n 分析表明盐地碱蓬s s p r xp 在盐、低温处理下 表达量明显高于对照；甘露醇、a b a 、h 2 0 2 、甲基紫精( m v ) 都能诱导s s p r xo 的大 量表达，表明s s p r xq 参与了对各种胁迫的反应。为了验证它的功能本实验构建了原核 表达载体( p g e x - 6 p - 1 + & p r xq ) 和植物过量表达载体( p r o k i i + s s p r xq ) 。在大肠杆 菌中过量表达g s t - s s p 玎【q 融合蛋白，为了进一步对p r x q 进行酶活分析，用p r e s c i s s i o n p r o t e a s e 酶切g s t 融合蛋白，得到大约2 4k d a 的蛋白。它可以保护质粒免受自由基的 破坏，并具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性，硫氧还蛋白可以作为它的电子供体。 利用花浸染法将农杆菌携带的双元表达载体p r o k i i + s s p r xq 转入拟南芥，通过多次筛 选已经获得了转基因拟南芥的纯合植株。p c r 和s o u t h e m 结果证明外源s s p r x 口已整合 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r xq 基因的克隆与功能鉴定 到拟南芥基因组中。n o r t h e r n 杂交结果表明插入拟南芥中的s s p r x q 基因已经正常转录。 对获得的转基因植株的表型分析发现，在低温以及1 0 0m m n a c l 处理下，转基因植株的 生长状况明显好于野生型，在一定程度上提高了其对胁迫的耐受能力。 关键词：盐地碱蓬，活性氧，s s p r x q 基因，过氧还蛋白，过量表达 分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 些丝壁兰苎! 竺皇茎里塑塞堕皇鲨堕苎塞 m o l e c u l a rc l o n i n ga n d f o u n c t i o nc h a r a c t e r i z a t i o no fs s p r xq g e n e i n s u a e d as a l s a a b s t r a e t m a n ym e t a b o l i cr e a c t i o n s ，s u c h a s p h o t o s y n t h e s i s ，p h o t o r e s p i r a t i o n ，a n dr e s p i r a t i o n i n v o l v et h ef o r m a t i o n o fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，p a r t i c u l a r l y u n d e re x t r e m e e n v i r o n m e n tc o n d i t i o n s r o sc a nc a u s es e r i o u sd a m a g et om a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n s ， i i p i d s ，o rn u c l e i ca c i d s ，e v e n t u a l l yl e a d i n gt op a t h o l o g i c a lp r o c e s s b u ti t a l s oc a na c ta s s i g n a l sm o d u l a t i n gg e n ee x p r e s s i o n ，e n z y m ea c t i v i t i e s o rd e f e n s er e a c t i o n s f o rt h i s ，t h e r e a c t i v i t yo fo x y g e n h a st ob ec o n t r o l l e dt om a i n t a i nt h ec e u u l a rm e t a b o l i s mi naf u n c t i o n a l s t a t e o r g a n i s m sl i v i n gu n d e r a e r o b i cc o n d i t i o n sh a v ed e v e l o p e da na r r a yo fa n t i o x i d a t i v e s y s t e m t o p r o t e c t t h ec e l l sf r o mo x i d a t i v ed a m a g e s a ne m e r g i n gf a m i l yo fn o n h e m e p e r o x i d a s e s ，c a l l e dp e r o x i r e d o x i n s ( p r x s ) ，h a s b e e nd e s c r i b e di na l lk i n g d o m s t h e s e e n z y m e s c a t a l y z et h er e d u c t i o no f e i t h e rh y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) o r v a r i o u sa l k y lh y d r o p e r o x i d e st o w a t e ra n dt h ec o r r e s p o n d i n ga l c o h o li nt h ep r e s e n c eo fa h y d r o g e nd o n o r s u c ha st h i o r e d o x i n ( t r x ) ，g l u t a r e d o x i n ( g r ) 【) ，c y c l o p h i l i na ，e c t i m p o r t a n tn e wi n f o r m a t i o no i lp r x si n d i c a t e s p l a n t - s p e c i f i c f u n c t i o n so fp r x ，f o r e x a m p l e ，i nt h ec o m e x to fp h o t o s y n t h e s i s ，p h l o e m m e t a b o l i s m ，a n de n v i r o n m e n t a ls t r e s s w i t h i nt h ep e r o x i r e d o x i n s ，f o u rc l u s t e r so fr e l a t e d p r o t e i n s a r e d i s t i n g u i s h e d ：1 - c y sp r x ，2 - c y sp r x ，t y p ei ip r xa n d p r x q p r xq ，a s r e p r e s e n t a t i v eo f t h ef o u r t hs u b g r o u p ，w a si d e n t i f i e di n i t i a l l yi ns e d u ml i n e a ra sa h o m o l o g u e o fe s c h e r i c h i sc o l ib a c t e r i o f e r r i t i nc o m i g r a t o r yp r o t e i nf b c p ) a l t h o u g ht h em o l e c u l a ra n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no fp r x sg e n e si np l a n t si sa d v a n c i n g r a p i d l y , i m p o r t a n tq u e s t i o n s n e e dt ob ea d d r e s s e di nt h ef u t u r e ，p a r t i c u l a r l y , c o n c e r n i n g p h y s i o l o g i c a lr o l e sa n dr e g u l a t i o n b yl a r g e s c a l ep a r t i a ls e q u e n c i n g o f r a n d o m l y s e l e c t e de d n ac l o n e sf r o ma n a c l - t r e a t e de d n al i b r a r yo fss a l s a ，w eo b t a i n e dt h ep a r t i a lf r a g m e n to fp r xq ( g e n e b a n k a c c e s s i o nn o a w 9 8 2 1 3 2 ) w eo b t a i n e dt h ef r a g m e n to f5 e n d sb y u s i n g5 - r a c e m e t h o d t w o g e n e ss p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e d ，a n ds s p r xq e d n a f r a g m e n tw a sa m p l i f i e dw i t h r t - p c r ia f t e rc l o n i n ga n ds e q u e n c i n ga n a l y s i s ，w ef o u n dt h a ti th a dh i g hh o m o l o g yw i t h o t h e r p e r o x i r e d o x i nq s s p r xqc o n t a i n s a n o p e nr e a d i n gf r a m e o f6 4 5 b p ，w i t h a 3 山东师范大学硕士学位论文 垫丝壁苎竺竺望苎里竺堡垦兰堡! ! 苎壅 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o no f10 0b p ，a n da3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o no f2 5 8b p t h ep r e d i c a t e d m o l e c u l a rm a s so ft h ep r o t e i ni s2 3 6k d t h en t e r m i m t s6 4a m i n oa c i d sc o n s t i t u t e t h e c h l o r o p l a s tt r a n s i tp e p t i d e s o u t h e r na n a l y s i si n d i c a t e s t h a tt h es s p r xqi sa u n i q u eg e n ei n 且 s a l s ag e n o m e a n a l y s i so fm r n al e v e l sb yn o r t h e mb l o t t i n gi n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n l e v e lo f s s p r xqi n 矗s a l s al e a v e sw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da f t e rt r e a t e dw i t hn a c la n dl o w t e m p e r a t u r e i na d d i t i o n ，s s p r xqg e n ee x p r e s s i o nw a su p r e g u l a t e db ym a n n i t o l ，h 2 0 2 ， m e t h y lv i o l o g e n ，a n d a b a t h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h i sg e n ei sas t r e s sr e s p o n s eg e n eo rh a v e a ni m p o r t a n tr o l ei ns t r e s st o l e r a n c e i no r d e rt oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no ft h eg e n e ，f i r s t ，w e e x p r e s s e da n dp u r i f i e dt h e r e c o m b i n a n ts s p r xqp r o t e i ni ne c o l i t of u r t h e ra n a l y z et h e e n z y m a t i ca c t i v i t yo ft h ee x p r e s s e dp r xq ，p r e s c i s s i o np r o t e a s ew a su s e dt od i g e s tg s t f u s i o np r o t e i n t h ep u r i f i e ds s p r xq p r o t e i ns h o w e d ab a n dw i t ham o l e c u l a rm a s so fa b o u t 2 4 k d i nv i t r o a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nc o u l dp r o t e c td n a i n t e g r i t ya g a i n s t o x i d a t i v ed a m a g ea n da l s oe x h i b i t e dat h i o r e d o x i n - d e p e n d e n tp e r o x i d a s ea c t i v i t y s e c o n d l y , t h e & 尸肛qg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp r o ki i ，t h e nt h ev e c t o rw a s i n t r o d u c e di n t oa r a b i d o p s i st h a l i a n ab yf l o r a ld i p p i n gm e t h o d t r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e d w i t ht h em e d i ac o n t a i n i n gk a n a m y e i n p c ra n ds o u t h e r na n a l y s i s s u g g e s t e dt h a ti t h a d i n t e g r a t e di n t ot h ea r a b i d o p s i sg e n o m e n o r t h e r nb l o t t i n gs h o w e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n t s h a dd i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e l s f i n a l l y , w ef o u n dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n t sg r e wb e t t e rt h a n t h ew i l d t y p ep l a n t su n d e r t h es a l ta n dl o w t e m p e r a t u r et r e a t m e n t t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t s s p r xq m a yp l a y a n i m p o r t a n t r o l ei np r o t e c t i n gp l a n t sf r o me n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s k e y w o r d s ：s u a e d a s a l s a ，s s p r xq ，p e r o x i r e d o x i n ，o v e r e x p r e s s i o n c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r xq 基因的克隆与功能鉴定 第一部分文献综述 环境胁迫如干早、低温或高温2 ，3 1 、高盐h5 1 、营养缺陷【7 】、臭氧8 埽口紫外照射 1 9 1 等，都可以引起活性氧( r o s ) 产生的加剧，破坏植物体内活性氧产生和活性氧清除之 间的平衡，最终超出植物活性氧清除的能力，不可避免地造成氧化损伤 1 0r “j 。脂质过氧 化、蛋白质的交联和失活以及d n a 的突变是活性氧造成的氧化损伤的典型效应1 3 , 1 4 。 然而，在复杂的有机分子的生物合成、木质素的多聚化、病原菌防御反应和生物或化学 农药的清除中，活性氧又是必不可少的参与者。研究表明活性氧是植物对生物和非生物 胁迫应答的重要信号分子，在细胞死亡以及生长发育中发挥作用 1 5 o 因而，植物所面临 的难题不仅仅是清除活性氧，还包括控制和“管理”活性氧的产生。 植物细胞内存在复杂的活性氧清除系统，它们既相互补充，又各自独立。植物体内 有效清除活性氧的保护机制可以分为酶促和非酶促两类，其中酶促反应系统主要包括超 氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽转移 酶( g s t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( q e o x ) 【1 “，非酶促反应系统包括抗坏血酸、谷胱甘 肽、生育酚、类黄酮等叭1 8 】。过氧还蛋白是一类新的过氧化物酶，它可以催化h 2 0 2 还 原为水，或在供氢体的存在下，催化各种烷基过氧化物还原为水和相应的醇，而供氢体 则转换为其氧化形式( r o o h + r ( s h h - 9h 2 0 + r s s ) 。据信过氧还蛋白与过氧化氢酶 或其它过氧化物酶共同通过调节细胞内的i - 1 2 0 2 浓度参与信号转导，h 2 0 2 可以依次控制 基因表达和细胞信号传导( 通过磷酸化级联反应) 1 1 9 2 0 1 。 过氧化蛋白f p r x s ) 存在于所有的生物中，它与其它的过氧化物酶不同【2 1 1 ，因为它缺 少催化反应通常所需的含金属离子的辅基，而具有1 2 个保守的半胱氨酸( c y s ) 可以 替代金属离子辅基的功能，参与体内各种过氧化物的清除反应f 矧。第一个被鉴定的过氧 还蛋白称为巯基特异性的抗氧化物( t s a ) ，在酵母和哺乳动物中可以保护谷氨酰胺合 成酶的活性和d n a 的完整性，使其免受氧化系统的损伤【2 3 ，2 4 1 。烷基过氧化物还原酶 a h p c 随后从s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 和e s c h e r i c h i ac o l i 中被鉴定。在e , c o l i 中敲除 a h p c 基因导致细胞对过氧化物( c m - o o h ) 的过度敏感，1 9 9 4 年，发现硫氧还蛋白可 以作为t s a 的电子供体，因此又被命名为硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶阢2 ”。以上所 有的p r x s 属于2 - c y sp r x 一族。另外，哺乳动物还包括1 - c y sp r x 和t y p ei ip r x 两类【28 1 。 第四类p r x q 存在于细菌【2 9 】和植物中，但不存在于动物中。人类包含六个j d 掰基因：四 个2 - c y sp r x ，一个l c y sp r x 和一个t y p e i i p r x 。目前的研究主要集中在其催化机制， 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r xg 基因的克隆与功能鉴定 底物特异性和生物功能等方面【2 ”。大量的研究表明p r x s 在光合，韧皮部代谢和环境胁 迫中具有重要作用。以下综述概括了植物中过氧还蛋自的研究进展并提出了许多有待于 解决的问题。 一、植物中的过氧还蛋白家族 拟南芥过氧还蛋白家族共分为四类，包含十个开放读码框( o r f ) ，至少有8 个表 达( 表1 ) 【3 0 ，3 ”。植物中所有的p r x s 都由核基因组编码。系统进化分析显示2 - c v sp r x 和p r xq 与蓝细菌的同源物具有很高的相似性，表明2 - c y sp r x 3 2 】和p r xq 的可能的内共 生起源。在p o r p h y r a 中2 - c y sp r x 仍然位于原质体系里。下面我们分别讨论植物中的四 类p r x s 的特征。 g e n e b a n k 登录号长度( a w t p )分子量等电点 c y s 的位置亚细胞定位 i - c y sp r xa t i 9 4 8 1 3 0 2 i 62 4l6 4 14 6 细胞核 2 - c y sp r x a a 1 3 9 1 1 6 3 0 2 6 6 ，8 32 9 1 4 9 1 3 6 ，1 5 8 叶绿体 b a t 5 9 0 6 2 9 0 2 7 1 8 82 96 47 1 +3 6 ，1 5 8叶绿体 l y p e j ip r x a a t l 9 6 5 9 9 0 5 5 36 276 0 4 5 1 ，7 6假基因( ? ) b a t l 9 6 5 9 8 0 1 6 21 7 451 7 5 1 ，7 6 细胞质 c a t l 9 6 5 9 7 0 1 6 21 7 45 3 35 1 7 6 细胞质 d a t l 9 6 0 7 4 0 1 7 41 9 2 6 15 1 ，7 6 细胞质 e a t 3 9 5 2 9 6 0 2 3 4 7 02 47 50 3 +5 1 ，7 6叶绿体 f a t 3 9 0 6 0 5 0 1 9 9 2 82 19 6 2 9 + 5 9 ，8 4 线粒体 塑! 里垒望壁! ! ! ! ! 竺! ：丝：! j ：翌：墅：! ! 生星堡 表l 3 1 1 拟南芥基因组中的过氧还蛋白。p r xa 可能为假基因。第三栏a a r p 分别表示蛋白质前体以 及转运肽的氨基酸长度。第六栏表示成熟蛋白质中保守的c y s 残基的位置。i e p ( 等电点) 是不含转运 肽的序列计算出来的。 t a b l e1p e r o x i r e d o x i n si nt h eg e n o m e o f a r a b i d o p s 担it h a l i a n a p r xam a y n o tb ee x p r e s s e d t h et h i r d c o l u m ng i v e st h ea i t l e n g t ho ft h ep r e p r o t e i na n dt h ep r e d i c t e dt a r g e t i n ga d d r e s s ，r e s p e c t i v e l y ；t h es i x t h c o l u m ng i v e st h ep o s i t i o no ft h ec o n s e r v e d c y s r e s i d u e si nt h em a t u r ep r o t e i n i e pc a l c u l a t e dw i t h o u t t r a n s i ts e q u e n c e 1 1 - c y s p r x 植物中首先被鉴定的p m 是来自大麦中的1 - c y sp r x i s 引。1 - c y s p h 在发育的种子的 胚和糊粉层中特异性表达【3 4 】。休眠种子吸涨后，1 - c y sp r x 的转录产物水平降低，在水 6 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r xq 基因的克隆与功能鉴定 稻种子萌发2 0 天后就检测不；n t ”i 。过量表达水稻o s 一，一c y sj p 麒的转基因烟草萌发效率 没有改变，但是过量表达1 - c y sp r x 的转基因烟草的叶对过氧化氢中介的氧化损伤不敏 感，蛋白质羰基化水平降低1 3 5 】，因此1 - c y sp r x 可能在种子发育和脱水过程中保护胚和 糊粉层细胞免受氧化损伤，而不会维持种子休眠。l - c y sp r x 定位于细胞核表明它在 保护d n a 以及核转录机制中发挥作用。在酵母体外实验中，p r x 可以保护d n a 在m c o 氧化系统中( 0 2 ，f e 和d t t ) 不产生切口【3 6 】。植物的p r x ，包括大麦1 c y sp r x 和2 - c v s p r x 也具有d n a 保护活性。 2 2 - c y s p r x 在筛选大麦叶生长区中特异表达的基因的过程中，第一个2 - c y sp r x 的序列b a s l 被 克隆，它与细菌的a h p c 以及人类和酵母中的硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶t p x 具有很 高的序列相似性阳。另外许多试验证明了2 - c y sp r x 定位于叶绿体中，例如免疫细胞化 学定位【3 8 】，假定的转运肽和绿色荧光蛋白组成的嵌合基因的瞬时表达【3 2 1 ，类囊体蛋白质 组的分析3 9 1 ，以及无细胞体系合成的蛋白质前体的翻译后进入叶绿体【4 0 1 。 拟南芥a t 一2 一c y sp r x 前体蛋白质分别由2 6 6 和2 7 1 个氨基酸组成，包含8 3 和8 8 个 氨基酸长度的转运肽。成熟蛋白质由6 个外显子和转运肽序列编码，比非植物中的2 一c v s p r x 多出第一个外显子1 3 2 】3 2 。3 6 和1 5 8 位有两个催化的半胱氨酸c y s 残基。2 - c y sp r x 通 过首尾排列形成同源二聚体起作用，一个亚基的3 6 位的c y s 与另外一亚基的1 5 8 位的 c y s 形成催化中心。研究表明大麦2 - c y sp r x 可以互补大肠杆菌a h p c 的缺陷【3 2 1 。异源 表达的2 - c y sp r x 可以清除h 2 0 2 、c m - o o h 、t b o o h 、亚油酸过氧化物和磷脂酰胆碱形 成的过氧化物p 8 ，4 ”。长链和复杂的脂质过氧化物还原速率比h 2 0 2 和t b o o h 低。从以上 数据可以推断植物2 - c y sp m 与细菌和锥虫中的p r x 相似具有广泛的底物特异性( 4 2 4 3 1 。 另外活体内氧化条件可以抑制2 - c y sp r x 的活性，改变它的四级结构并结合到类囊体膜 上，表明2 - c y sp r x 除了具有抗氧化功能外，它的结构还可能作为叶绿体中的氧化还原 “感受器”1 4 l l 。 3 t y p e p r x t y p e i ip r x 几乎同时从酵母和b r a s s i c ac a m p e s t r i s 中被鉴定 4 4 ，4 5 1 ，后者是在对花 特异的c d n a 克隆的随机测序的过程中克隆。b c p r xt y p ei i 编码分子量为1 7 5k d a 的 小蛋白，5 1 位和7 6 位有两个c y s 。b e p r x t y p ei i 可以保护谷氨酰胺合成酶免受氧化失 活，利用酵母硫氧还蛋白作为电子供体还原过氧化氢h 卯。a t p r ) ( t y p e i i c 也具有h 2 0 2 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s x p r x 口基因的克隆与功能鉴定 还原活性p 1 。从p o p u l u st r i c h o c a r p a 的木质部和韧皮部中分离的p r xt y p e i i 在筛管中特 异的表达3 。杨树p t p r x i i 咀单体形式迁移。在体外实验中，p t p r xt y p e 1 i 可以还原 h 2 0 2 、c m o o h 和t b o o h ，硫氧还蛋白h 和谷氧还蛋白以相似的效率促进p t - p r x t y p e i i 的再生。有趣的是，在某些原核生物像f i b r i oc h o l e r a e 中发现p r x 和谷氧还蛋白( g r x ) 基元融合的天然产物i l 。 在拟南芥基因组中，有六个基因与t y p e i ip r x 相似，其中4 个在叶中表达 3 0 】。p r x i id 的表达目前没有检测到。p r xi ib 和p r xi ic 没有明显的定位序列，可能位于细胞 质中。p r x l ie 定位与叶绿体中，p r x i if 定位与线粒体中 4 6 , 3 1 】。p r x l if 的线粒体定位 是通过质谱的方法被证b j t a 7 】。 4 p r xq p r xq 属于p r x 的第四类，最近才从植物中被克隆“。从佛甲草( s e d u ml i n e a r e ) 分 离出来了1 7 k d a 的蛋白质，n 一端测序表明该蛋白与大肠杆菌细菌铁蛋白共迁移蛋白 ( b c p ) 具有很高的同源性，命名为s 1 p r xq 。拟南芥基因组中存在一个p r xo 基因“。 植物p r xq 编码一个具有n 一端延伸的蛋白质，为叶绿体定位的特异序列。活化状态的 p r xq 为单体形式，可以还原h 2 0 2 、c m - o o h 和t b o o h ，氧化后的p r xq 可由硫氧还 蛋白再生。缺失b w 基因的大肠杆菌对c m - o o h 和t b o o h 高度敏感，突变体表型可以 被异源表达的s 1 - p r xq 蛋白所逆转，证明在体内p r xq 可以作为抗氧化物起作用 4 s o 叶 绿体中有两类硫氧还蛋白异构物t r xm 和t r xf 。菠菜p r xq 可以与缺少一个催化的c y s 残基的突变的t r xn l 相互作用，i hm 可以再生氧化状态的p r xq 5 0 】。2 0 0 4 年关于杨树 ( p o p u i u st r e m u l a x p o p u l u st r e m u i o i d e s ) p r xq 的研究对p r xq 作用的分子机制，底 物和电子供体的特异性，体外功能以及细胞定位等方面进一步作了补充【5 ”。体外实验表 明硫氧还蛋白可以作为p r xq 有效的电子供体，而谷氧还蛋白则不能。它可以还原各种 烷基过氧化物，但对h 2 0 2 、c m o o h 和t b o o h 有较高的催化效率。免疫化学定位以及 绿色荧光融合蛋白的表达把p r xq 定位于叶肉细胞以及保卫细胞的叶绿体中。 二、p r x 中介的过氧化物清除的反应机制 反应机制分三步进行：氧化，延伸以及基态的再生【2 ”。p r x s 含有一个或两个保守 的c y s 残基，形成单体或二聚体起作用。定点诱变和晶体结构分析认为一个c y s 残基与 过氧化物反应作为初级催化中心，被氧化成次磺酸 2 1 , 5 2 , 5 3 】。半胱氮酸的次磺酸衍生物高 效的与其它巯基反应形成二硫键。在2 - c y s p r x ，p r xq 以及p r x t y p ei i 型的过氧还蛋白 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s p r x0 基因的克隆与功能鉴定 中，第二个巯基进攻次磺酸基团形成二硫键，释放水【5 。晶体结构分析分别证明了2 - c y s p r x 和人类p r xt y p ei i 中分子间以及分子内二硫键的形成【”5 3 5 2 】。2 - c y sp r x 中第二个巯 基位于功能二聚体的另外一个亚基上。非还原性s d s - p a g e 中可以分离到氧化后形成的 共价连接的二聚体陋3 引。在t y p e i ip r x 和p r xq 中，两个c y s 残基都位于同一个多肽 分子内，c y s 残基分别间隔2 5 个和5 个氨基酸。二硫键可以通过与硫氧还蛋白f 5 6 】，谷 氧还蛋白以及c y c l o p h i l i n 的巯基相互作用再生【5 7 ，53 1 。实验结果表明t y d ei ip r x 和谷氧 还蛋白，2 - c y sp r x 和硫氧还蛋白，以及2 - c y sp r x 和c d s p 3 2 ( 一种干早诱导的硫氧还 蛋白) 之间可以形成二硫键【5 8 5 0 , 5 9 1 。被认为是植物细胞质和基质中h 2 0 2 脱毒的关键酶 一抗坏血酸过氧化物酶对氧化失活高度敏感【6 0 】，它的活性在干旱胁迫中丢失 6 t 】。而相反， p r x 的反应很活跃，不依赖于敏感性的辅因子，可以清除广泛的过氧化物。仅在很高的 非生理过氧化物浓度下，催化的c y s 可以被氧化成次磺酸，p r x 不可逆失活f 3 8 】。 o s h r 。h ，r o _ 。h s h s h 、 飞 睁s - 8 一 h s i 曩 s l i _ _ | 图l s 3 1 过氧还蛋白清除过氧化物的反应机制以及p n 【的再生。 s 注：p ：p r x 蛋白。x ：含有c y s 的蛋白质，可能与p r x 位于同一多肽链，也可能位于另一多肽链中。 下：可以再生p r x 的双巯基蛋白质。 f i g - 1 g e n e r a l i z e dr e a c t i o n m e c h a n i s mo fp e r o x i r e d o x i n m e d i a t e d p e r o x i d e d e t o x i f i c a t i o na n d 9 山东师范大学礤士学位论文 盐地碱蓬s 铲麒q 基因的克隆与功能鉴定 r e g e n e r a t i o n o ff u n c t i o n a lp r x p ：p r xp r o t e i ne n v i r o n m e n to ft h ep r i m a r yr e a c t i v ec y sr e s i d u e x ： e n v i r o n m e n to f t h es e c o n dc y sr e s i d u ew h i c hm a yb ep r e s e n ti nt h es a m ep o l y p e p t i d ec h a i n i tm a ya l s ob e l o c a t e di na n o t h e rp o l y p e p t i d e t ：d i t h i o lp r o t e i nf o rr e d u e t i v er e g e n e r a t i o no f p r x 图1 右手分支 5 3 1 概括了一般的p r x 中介的过氧化物清除的催化反应。但是，对于 1 - c y sp r x ，t y p e i i p r x 和2 - c y sp r x 的突变形式反应机制需要修改。 1 人类i - c y sp r x 的晶体结构仅含有一个保守的c y s 残基，与过氧化物反应形成 次磺酸【纠。氧化状态的1 - c y sp r x 在体外可以被还原剂d t t 再生，但是体内还原剂仍待 进一步鉴定。它可能是还原酶或是其它一些含有巯基的物质，其c y s 残基可与次磺酸残 基反应释放水。然后，第二个c y s 残基进攻分子间二硫键生成分子内二硫键，结果p r x 的功能c y s 残基再生。 2 体外实验中2 - c y sp r x 利用d t t 作为还原剂可能存在相似的机制。而且，缺少 个c y s 残基的2 - c y sp r x 和t y p e i i p r x 失去硫氧还蛋白依赖的活性，仅在d t t 依赖 的过氧化物还原中保持活性【2 8 】。 3 p t - p r x 接受来自硫氧还蛋自和谷氧还蛋白的电子【59 1 。羧基端7 6 位c y s 的突 变导致p t p r x i i 硫氧还蛋白依赖的活性的丢失，但并不影响谷氧还蛋白依赖的过氧化 物的还原。 图l 左手分支口3 】描述了修改以后可能的反应机制。 三、植物和藻类中p r x s 的表达 环境胁迫通常可以调节或诱导抗氧化物的表达。到目前为止，仅有少数研究报道了 p 肼基因的表达模式，揭示了每一类户膳基因都有其独特的调节模式。 1 p r x 的亚细胞定位以及组织特异性的表达 拟南芥叶绿体中的四个p r x ，例如p r xi i e 、2 - c y sp r x a 和b ，p r xq ，它们在绿色 组织中表达而不在根中表达【3 i l 。拟南芥在低光下，叶绿体p 聒的m r n a 水平降低【3 0 1 。 c h l a m y d o m o n a sr h e i n h a r d t i i 在黑暗中检测不到2 - c y sp r x 的转录产物 6 3 1 。拟南芥p r xi i e 存在于叶绿体内但可被细胞质中p r xi ic 的抗体识别，不同的杨树p r xi i 的抗体之间 可以发生交叉反应【鳓。迄今为止，线粒体和细胞质中的p r x 在所有的组织中表达，但仍 需进一步分析。 2 p r x 表达的环境调节 p r x 可以参与体内正常的抗氧化物代谢，并与氧化胁迫相关。例如，r o s 和过氧化 0 山束师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬曲p 憎q 基因的克隆与功眈鉴定 物在正常的细胞代谢中( 呼吸作用和光合作用) 合成，在胁迫环境像盐，干旱和重金属 的情况下，它的产量增加。拟南芥过氧还蛋白家族受光，抗坏血酸，以及氧化胁迫的调 节，表明它具有持家和胁迫相关的功能。虽然叶绿体的p r x 基因在正常的生长条件下表 达量很高，但它仍然受氧化胁迫如高光和h 2 0 2 正调节口“。将拟南芥叶片暴露于盐溶液 中导致叶绿体p h 的转录水平降低畔】。t b o o h 和肼使胁q 的