（细胞生物学专业论文）拟南芥菜gfc1突变体的筛选及遗传、表型研究.pdf

兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 形，突变体的筛选及遗传、表型研究 摘要 本工作通过对拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) t d n a 插入突变体库的筛选，得到一 个对细胞分裂素反应异常，生长较快的突变体驴j ( g r o wf a s to ne y t o k i n i n ，驴) 。基因 克隆和序列分析结果表明该突变基因编码一种b a h d 基因家族的酰基转移酶。该家族 成员在许多植物次生代谢物合成途径中具有重要的作用。在许多植物中催化了植保素 合成的第一个反应。模式植物拟南芥中有7 0 多个该基因家族成员，然而目前这些基因 编码的酶的作用底物及产物尚不明确。 g f c l 等位突变体g f c 2 在含t d z0 1 m 鲈的m s 培养基上时，具有同g 形j 一致的表型， 而不同来源的两个t - d n a 插入失活突变体，在同一位点发生自然突变的几率几乎是 0 ，由基因和表型的连锁关系可以确定突变体的表型是由该基因引起的。 突变体驴j 为父本，野生型为母本杂交得到f 1 b c l ，杂交成功的幼苗为k a i n t ，进行 p c r 纯杂合验证均为杂合体。另取一部分f l a o 接种于含t d z0 1 m g l 的m s 培养基上， 发t l 冤g f c l 突变表型丧失而显示野生型表型，证明为隐性突变体。 表型分析显示，在m s 基本培养基上培养l o 天的突变体与野生型，g 孵c l 的根长长于 野生型，二者下胚轴长度相差不大，突变体略短些。转移到土壤中培养后，二者在营 养生长期生长状况没有明显区别。 在含细胞分裂素的m s 培养基上，咖，的根生长明显比野生型快，上部形态差异明 显，叶片较野生型生长快，而下胚轴相对略短。推测可能是咖j 中细胞分裂素信号转 导过程受到影响，使得g r c l 对细胞分裂素不敏感。而在含有生长素的m s 培养基上，突 变体与野生型表型相差不大，说明突变基因未影响内源生长素的信号途径。 h p l c 法测定内源激素水平的结果来看，经t d z 处理6 d , 时后，野生型和咖珀勺内 源i a a 的水平都有所下降，而野生型下降程度较驴j 更显著。推测可能是因为外源细 胞分裂素添加后，抑制了内源i a a 含量的下降。 半定量r t p c r 结果显示，g 面c l 在野生型拟南芥花序中表达量最高，按表达量递减 的顺序，依次为角果、幼嫩叶片、花序茎、成熟叶片、根以及衰老叶片。试验结果同 g e n e v e s t i g a t o r 网站公布的基因芯片测定结果总体上保持一致的。 以含t d z 的m s 培养基上的突变体及野生型拟南芥叶片为材料制作半薄切片，光 学显微镜下观察并以成像系统分析，野生型叶肉细胞排列较驴，紧密，且细胞略小， i v 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 后，突变体的筛选及遗传、表型研究 而突变体中叶肉细胞排列相对松散。 本实验已克隆到g 彤j 启动子序列，需进一步构建c d n a 颤c l - p b l l 2 1 、全长驴， p c a m b i a l 3 0 0 、启动子p 驴广p b l l 2 1 载体，完成分子互补，g u s 染色等实验。另外，作 为植保素合成途径的一个关键的酶，了解其生化活性等对于抵御病害具有特殊重要的 作用。 关键词：酰基转移酶、拟南芥、植保素、次生代谢物 v 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 彤j 突变体的筛选及遗传、表犁研究 a b s t r a c t s t a r t i n g 诚t l ls c r e e n i n go ft d n ai n s e r t i o na r a b i d o p s i st h a l i a n as t o c k s ，at d z i n s e n s i t i v em u t a n t ，矾l ，w h i c hg r o w sf a s t e rt h a nt h ew i l dt y p eo nm sm e d i u mc o n t a i n i n g t d z ，w a si s o l a t e d t h ec l o n eo ft h em u t a n tg e n ea n dt h ea n a l y s i so ff l a n k i n gs e q u e n c eb y i n v e r s e - p c rr e v e a l e dt h a tt h em u t a n tg e n ee n c o d e saa c y l t r a n s f e r a s eb e l o n gt ob a h d f a m i l y t h em e m b e r so ft h i sf a m i l yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o s y n t h e s i so fav a r i e t y o fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa n dc a t a l y s et h ef i r s tc o m m i t t e dr e a c t i o no fp h y t o a l e x i n b i o s y n t h e s i si nm a n yo t h e rp l a n t s t h e r ea r ea p p r o x i m a t e l y7 0b a h dg e n ef a m i l y m e m b e r si nt h em o d e lo r g a n i s ma r a b i d o p s i s ，a l t h o u g ht od a t e ，t h es u b s t r a t e sa n d p r o d u c t s ， o ft h ee n z y m e se n c o d e db yt h e s eg e n e sh a v en o tb e e nd e t e r m i n e d t h eh o m o z y g o t e 咖2 ，a l l e l i cm u t a n to fg f c l ，h a st h es a m ep h e n o t y p ew h e nc u l t u r e d o nt h em sm e d i u mc o n t a i n i n gt d z o 1 m g l 髂欢j w h i l et h ep r o b a b i l i t yo fs p o n t a n e o u s m u t a t i o na tt h es a m es i t ei nt w od i f f e r e n tm u t a n ti sa l m o s tz e r oe v e ni ft h e yh a v et h es a m e p h e n o t y p e a c c o r d i n gt ot h el i n k a g er e l a t i o n s h i pb e t w e e ng e n ea n dp h e n o t y p e ，w e c o n f i r m e dt h a tt h em u t a n tw a si n d u c e db yt h en o v e lg e n ed i s c o v e r e d b yc h o o s i n gt h eh o m o z y g o u s 咖la sam a l ep a r e n tc r o s s e dt ow i l dt y p e ，f la c l p r o g e n ys h o w e dk a mr e s i s t a n c ea n dc o n f i r m e dt ob eh e t e r o z y g o u sb yp c r i n c u b a t e do n m sm e d i u mc o n t a i n i n gt d zo 1m g l ，t h em u t a n tp h e n o t y p ew a se l i m i n a t e da n df1b o e x h i b i t e dt h ew i l d - t y p ep h e n o t y p e ，w h i c hd e m o n s t r a t e st h a tt h em u t a t i o ni sr e c e s s i v e i n c u b a t e do nm sb a s a lm e d i u mf o r10d a y s ，t h er o o t so f 咖1w e r el o n g e rt h a nw i l d t y p e ，a n dt h ed i f f e r e n c eo fh y p o c o t y l sb e t w e e nm u t a n ta n dt h ew i l dt y p ew a ss l i g h t a f t e r t r a n s f e r r e di n t os o i l ，l i t t l ed i f f e r e n c eo ft h e mw a sf o u n dd u r i n gt h ev e g e t a t i v eg r o w t h i n c u b a t e do nm sm e d i u mc o n t a i n i n gc y t o k i n i n , 心1d e v e l o p e dm u c hl o n g e rr o o tt h a n t h a to fw i l dt y p e ，b u ts h o r t e rh y p o c o t y l i ti m p l i e st h a t 矾lm i g h tb ei n s e n s i t i v e t o c y t o k i n i nb yi n t e r r u p t i n gt h ec y t o k i n i ns i g n a lt r a n s d u c t i o n t h ed i f f e r e n c eo fp h e n o t y p e w a si n s i g n i f i c a n tb e t w e e nm u t a n ta n dw i l dt y p eg r o w no nm sm e d i u mc o n t a i n i n gi a a i t i n d i c a t e st h a tt h em u t a t i o nd o e s n ta f f e c tt h em e t a b o l i s mo fe n d o g e n o u si a a t h ed e t e c t i o no fe n d o g e n o u si a ac o n c e n t r a t i o nb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d v i 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜f i e l 突变体的筛选及遗传、表型研究 c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) r e v e a l e dt h a tl 蛆c o n c e n t r a t i o ni nw i l dt y p ea n dm u t a n ta f t e r t r e a t e d 谢t 1 1t d zf o r6h o u r sw e r ed e c r e a s e d ，w h i l et h eq u a n t i t yo fi a ai nw i l dt y p e d r o p p e dm u c hf a s t e rt h a ni n 咖1 i tm i g h tr e s u l t sf r o mi n h i b i t i o no ft h ed e c r e a s eo f e n d o g e n o u si a ab ye x o g e n o u sc y t o k i n i ni nm u t a n t r n a e x p r e s s i o no fg f c 1i ni n f l o r e s c e n c er e v e a l e db ys e m i - - q u a n t i t yr t - p c ri sm u c h h i g h e rt h a ni no t h e ro r g a n sa n df o l l o w e dt h eo r d e rs i l i q u e j u v e n i l el e a f i n f l o r e s c e n c e s t e m a d u l tl e a f r o o t s s e n e s c e n tl e a f t h er e s u l tw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ed a t af r o mt h e g e n ec h i p sp u b l i s h e do ng e n e v e s t i g a t o rw e b s i t e t h es e m i t h i ns e c t i o n so fa r a b i d o p s i sl e a v e si n c u b a t e d0 1 1m sm e d i u mc o n t a i n i n g t d zw e r eo b s e r v e du n d e rl i g h tm i c r o s c o p e ，a n dt h e na n a l y z e db ym e a n so fc o m p u t e r i m a g ea n a l y s i ss y s t e m c o m p a r e d 、 d t l lt h em u t a n t m e s o p h y uc e l l sf r o mw i l dt y p ea r r a n g e d m o r ed e n s e l ya n dt h es i z ew a ss m a l l e r t 1 1 ea r r a n g e m e n to fm e s o p h y l lc e l l si ng 拆c lw a s l o o s e r r n l es e q u e n c eo fp r o m o t e rh a sb e e nc l o n e di nt h i se x p e r i m e n t n e v e r t h e l e s s ，t h r e e v e c t o r s ( c d n a 驴i - p b l l 2 1 ，f u l ll e n g 1 驴t - p c a m b i a l 3 0 0 ，p w c r p b l l 2 1 ) n e e d t ob e c o n s t r u c t e da n df u r t h e rv e r i f i c a t i o nw i l lb en l a d e ，s u c ha sc o m p l e m e n t a t i o nt e s t ，g u ss t a i n a n ds oo n i na d d i t i o n , a st h ec r u c i a le n z y m ed u r i n gt h e b i o s y n t h e s i sp a t h w a y o f p h y t o a l e x i ni no t h e rp l a n t s ，t h es t u d yo nb i o c h e m i c a la c t i v i t yo fb e n z o y l t r a n s f e r a s eh a s i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rp l a n td e f e n s er e s p o n s e k e yw o r d s ：a c y l t r a n s f e r a s e ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，p h y t o a l e x i n 、s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s v l i 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 归，突变体的筛选及遗传、表型研究 a b a a o x b e b t b h t c c c m v d s r n a h m 咿 h p l c h r j a l r r l z n b s n o s p a l p c d p e p p k r i s c r l k r o s s a s a r s i r n a t c v t d z t i r t m v t 缩略词表 a b s c i s i ca c i d a l t e r n a t i v eo x i d a s e b e n z o y l - c o a ：b e n z y la l c o h o lb e n z o y lt r a n s f e r a s e b u t y l h y d r o x y t o l u e n e c o i l e d - c o i l c u c u m b e rm o s a i e v i r u s d o u b l e s t r a n d e dr n a h e x o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e j a s m o n i ca c i d l e u c i n e r i c hr e p e a t l e u c i n ez i p p e r n u c l e o t i d e b l i n d i n gs i t e n i t r i co x i d es y n t h a s e p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p h o s p h o e n o l p y r u v a t e p r o t e i nk i n a s ed o m a i n r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x r e c e p t o r l i k ek i n a s e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s a l i c y l i ca c i d s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e s h o r ti n t e r f e r i n gr n a t u r n i pc r i n k l ev i r u s t h i d i a z u r o n t h em a m m a l i a ni n t e r l e u k i n - 1r e c e p t o r t r a n s m e m b r a n ed o m a i n v i r u l e n c et a r g e t i i i 脱落酸 线粒体交替氧化酶 苯甲酰转移酶 抗氧化荆 螺旋卷曲 黄瓜花叶病毒 双链i i n a 磷酸戊糖途径 高效液相色谱 超敏反应 茉莉酸 富亮氨酸重复受体蛋白 亮氨酸拉链结构 核苷酸结合位点 一氧化氮合酶 苯丙氨酸解氨酶 细胞的程序性死亡 磷酸烯醇丙酮酸 蛋白激酶结构域 r n a 诱导的沉默复合体 受体类似激酶 活性氧 水杨酸 系统获得性抗性 小干扰r n a 芜菁皱缩病毒 噻二唑苯基脲 白细胞介素一1 受体 跨膜区 毒性靶标 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独 立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引 用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均己在文中 以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：璺翊 日期：互监签：y 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：埤导师签名： 兰州大学硕士学位论文拟南芥菜驴j 突变体的筛选及遗传、表型研究 第一部分前言 长期以来，植物病害一直是农业生产中的一个主要限制。植物器官表面，不论地 上还是地下部分都受到来自各种病原菌包括细菌、真菌、病毒等在内的威胁。据估计， 大约有2 5 0 ，0 0 0 种高等植物，但却存在6 倍( 约l ，5 0 0 ，0 0 0 ) 的真菌。植物不能像动物 一样随意迁移以躲避不利环境，而只能适应与耐受。同时，也不具备类似动物体内高 度特化的免疫细胞。因此，植物在与病原物长期的斗争中，逐渐形成了一系列复杂的 防御机制。 一、植物保护素( p h y t o a l e x i n s ) 植保素是指受病菌侵染后，植物体内合成并积累的一种抗微生物低分子量的物 质。在超敏反应中，植保素的合成对抑制、甚至杀死入侵的病原体具有重要作用。 当真菌的孢子接触到植物的表面，在微环境( 温度，湿度，光等) 适宜的条件下开 始生长。在冲破植物机械及化学屏障等多条防御后，才能到达活细胞。例如厚的表皮， 能够抑制孢子萌发的流出物等。这些防御是植物构成或预先形成的抗菌组分，因此也 称作侵染前代谢( p r e i n f e c t i o n a lm e t a b o l i t e s ) 。如果这些防御不能够阻挡真菌孢子发育 以及菌丝对表皮的穿越，植物通常开始局限或延迟入侵者的扩张。通常活性氧作为细 胞以及邻近细胞的警戒信号而产生，并触发各种防御反应。包括细胞壁的加强，超敏 反应，系统获得性抗性，并开始积累称作植保素的抗菌性化学物质。 早在1 9 11 年，法国植物学家n o e lb e r n a r d 就发现植物能够在受到真菌侵染时，特 异性合成抗菌物质。他发现两种兰花o r c h i sm o r i o 和l o r o g l o s s u mh i r c i n u m ( = h i m a n t o g l o s s u mh i r c i n u m ) 的块茎，能够在感染r h i z o c t o n i ar e p e n s 之后对真菌的侵袭 产生抗性。通过观察生长在琼脂上的被感染的块茎组织，并且在培养基中添加真菌， b e r n a r d 发现被侵染的组织产生了一种能够抑制真菌生长的物质，但是这些组分直到几 十年后才得到确定。m u 宦1 l e r 与b o 色r g c r ( 1 9 4 0 ) 在感染- j p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 的土豆块 茎中观察到了相同的现象，他们称这些诱导产生的物质为”p h y t o a l e x i n s ”( r e n e a ej ， g r a y e r ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。m 吐1 1 e r 与b o 立玛e r 将植保素定义为”病原体入侵时作为一种对抗 方式在活细胞内产生的化学组分。这个定义随着研究的深入而逐步修订。后来发现 植保素并不只是在受到真菌侵染时才产生在植物中，在受到非生物胁迫的时例如在受 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 彩j 突变体的筛选及遗传、表型研究 到短波u v 辐射以及用重金属离子处理后也可以生成。出自这个原因，i n g h a m ( 1 9 7 3 ) 重新定义植保素为”是植物受到生物以及化学，环境因子诱导后经过一系列的代谢产 生的抗生素类物质”。其他受到环境胁迫而产生的化合物称作”胁迫化合物”( s t r e s s c o m p o u n d s ) 。 一部分植物在病原体入侵时不合成植保素，但释放毒素，这些毒素通常以无毒糖 苷的形式保存在液泡中，例如酚与环烯醚萜等( o s b o u m ，1 9 9 6 ) 。如果细胞的完整性遭 到菌丝的破坏，配糖基受到存在于该细胞其他部位的水解酶类的作用，从而释放毒素。 尽管这些真菌侵袭后释放的毒素在未受侵染的植物中并不存在，是新鲜合成的，但严 格意义上讲不属于植保素，因为参与该反应的酶类在健康植物中也有存在，没未在侵 染后重新合成。同一种化合物可能在某种植物中合成抗菌物质，而在另一种植物里合 成植保素。例如，樱花素( s a k u r a n e t ) 在黑醋栗( r i b e sn i g r a , g r o s s u l a r i a c e a e ) 叶片中是 一种组成型抗菌成分，但是在水稻叶片中却是诱导产生的( k o d a m a , m i y a k a w aj ，e ta 1 ， 1 9 9 2 a ) 。通常，很难判断一个化合物是组成型存在还是诱导产生的。因此s t o e s s l ( 1 9 8 0 ) 提出了另一个定义：”存在于高等植物的代谢物，通常情况下不存在于健康组织或者 只存在于邻近位点，但当受到真菌或病毒侵染时含量急剧增加”。1 9 9 4 年植保素不仅 仅用来定义在植物抗性反应重起作用的那些化合物，更特指低分子量低于1 0 0 0 的抗菌 次级代谢物( v a ne t t e n , b a i l e yj a , e ta 1 ，19 9 4 ) 。 随着研究的深入，各种各样的植保素从不同植物中分离得到，它们的化学结构通 常和一类植物家族相关。例如，豆科( 1 e g u m i n o u s ) 的许多植保素都具有异类黄酮骨架， 而十字花科( c r u c i f e r s ) 的植保素生成吲哚生物碱，谷类( c e r e a l s ) 大多生成的异羟肟酸 ( c y c l i ch y d r o x a m i ca c i d s ) 以及二萜( d i t e r p e n o i d s ) ，茄科( s o l a n a c e a e ) 则生成倍半萜以及 多炔。最初，关于植保素的研究主要是针对诱导产生的抗菌组分以及相关疾病的抗性。 后来，大量的研究证实植保素在植物防御病原体的过程中发挥重要的作用。原位定位 和定量试验结果显示病原体侵袭时，植保素能够在正确的部位以一定的浓度发生瞬间 积累，从而进行有效的防御( h a m m e r s c h m i d trd a r me k , 1 9 9 9 ) 。二苯乙烯合酶 ( s t i l b e n es y n t h a s e ) 的转基因烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 、番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m m i l l ) 以及紫花苜蓿( m e d i c a g os a t i v a ) ，能够使转化株合成葡萄( v i t i sv i n i f e r a ) 植保素白 藜芦醇( r e s v e r a t r 0 1 ) ，显示出对烟草病原体b o t r y t i sc i n e r e a ( h a i nrr e i f i - i j ，e ta 1 ， 19 9 3 ) ，p h y t o p h t h o r ai n # s t a r t s ( t h o m z i kj e ，s t e n z e lke ta 1 ，19 9 7 ) 以及p h o m a 2 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g f c l 突变体的筛选及遗传、表型研究 m e d i c a g i n i s ( h i p s k i n dj d ，p a i v a n l ，2 0 0 0 ) 抗性的增加。而在抑制豌豆素合成的转基因 组织中发现同对照比较，转基因根部由于生成较低水平的豌豆素而对病原体n e c t r i a h a e m a t o c o c c a 易感( w uq ，v a n e t t e nh d ，2 0 0 4 ) ，证实了植保素作为防御组分的的重要 性。 植保素合成的过程是抑制病原体的一种节约型途径，因为碳源和能量只在侵染早 期被用于植保素合成途径，并且只发生在感染部位。没有受到威胁的植物能够利用这 部分能量完成基础的生命代谢，例如花的发育，种子的形成，或者作为碳水化合物积 累下来。植保素主要包括酚类( p h e n o l i c s ) 、类黄酮类( f l a v o n o i d s ) 、异类黄酮类 ( i s o f l a v o n o i d s ) 、萜类( t e r p e n e s ) 等，对于植物细胞同样具有毒性，能够在整株植物或 培养细胞中瞬间发生积累，一些胞外的过氧化物酶类能够降解具有氧化性的植保素 ( s o l e d a d em ，p e d r a sc ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前，植保素的生物合成主要包括以下三个途径。 ( 1 ) 莽草酸途径( s h i k i m a t ep a t h w a y ) 莽草酸途径只存在于植物界，它是由碳水化合物合成芳香族化合物的主要途径。 这一途径的重要性在于它能提供合成蛋白质所需要的芳香族化合物，特别是酚类，并 且有些芳香族化合物是进一步合成次生代谢物的前体。这一途径是从两个简单的前体 开始的。第一个前体化合物来自磷酸戊糖途径( h e x o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y , h m p ) 的4 一磷酸赤藓糖，h m p 途径同时还提供还原的脱氢酶。第二个前体来自糖酵解途径中 的磷酸烯醇丙酮酸( p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ，p e p ) 和赤藓糖一4 一磷酸盐。莽草酸代谢途径的 关键酶和限速酶是苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ，p a l ) ，能够使前体物 质迅速转入植保素合成的莽草酸途径。 在植物中两大类酚聚合物是木质素和单宁。木质素和单宁都是经过莽草酸途径合 成的次生代谢物，但二者的生物和化学特性却很不同。木质素是维管植物的细胞壁的 组成成分，木质化有利于植物细胞阻碍微生物和植食性昆虫的攻击；单宁在植物中的 作用起防御植食性昆虫的危害，它一方面阻碍昆虫对食料中蛋白质的消化，更主要的 阻碍昆虫对消化后营养成分的吸收。香豆素一般分布在植物的根和种皮中，对病毒、 细菌、真菌、脊椎动物和无脊椎动物都具有毒性。 ( 2 ) 乙酸一丙二酸途径( a e e f a t e m a l o n a t ep a t h w a y ) 这条途径的重要产物是脂肪酸及其代谢物芳香族化合物，芳香族化合物合成 聚交脂以保护植物免受细菌和真菌的侵染。 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜驴j 突变体的筛选及遗传、表型研究 ( 3 ) 乙酰一甲羟戊酸( a c e f a t e m e r a l o n a t ep a t h w a y ) 途径 几类重要的天然化合物如萜类、甾醇都是通过乙酰一甲羟戊酸途径合成的，合成 这些物质是植物防御植食性动物的重要策略。萜类物质对昆虫的作用主要有以下几个 方面：毒剂、取食阻碍剂和产卵阻碍剂。 研究病原体产生的能够对抗植保素毒性的酶类，有助于帮助提高植物对病原体的 抗性( w uq ，v a n e t t e nh d ，2 0 0 4 ) 。通过对水稻稻瘟病的小种专化抗性进行组织学和生 物化学对比研究，发现在非亲和性稻瘟菌侵染的稻叶中特异性的积累两种脂类物质， 证明为两种新的水稻植保素n 一苯甲酰基色胺( n b e n z o y l t r y p t a m i n e ，p 1 ) 和n - 肉桂酰基 色胺( n c i n n a m o y l t r y p t a m i n e ，p 2 ) ( 彭友良，范军，1 9 9 6 ) 。迄今已从水稻中分离出1 0 余种 植保素，结构上分为二萜，黄酮和氧化脂肪酸类。从水稻中提取和分离的n 一酰基色胺 类植保素( n a c y l t r y p t a m i n e ) 未见报道。通过对这两种新的水稻植保素p 1 和p 2 结构进行 研究，推测其合途径中需要一个关键的酶，苯甲酰转移酶( b e n z o y l c o a ： b e n z o y l t r a n s f e r a s e ) 。 二、酰基转移酶( a c y l t r a n s f e r a s e ) 的研究进展 早期研究苯甲酰转移酶是以激发子诱导的康乃馨( d i a n t h u sc a r y o p h y l l u sl ) 细胞 培养物为材料的。在康乃馨型尖镰孢( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s pd i a n t h i ) 的诱导下会产 生邻氨基苯甲酸衍生物，在许多文献中被称作d i a n t h a l e x i n 和d i a n t h r a m i d e ( m a t e mu ， 1 9 9 4 ；n i e m a n ng j 。1 9 9 3 ) ，以及大量的苯甲酰和肉桂酰残留物。d i a n t h a l e x i n 和 d i a n t h r a m i d e 是含氮生物碱植保素，已经在多种康乃馨变种中有所报道( n i e m a n ng j ， 1 9 9 4 ) ，对植物的抗病性极其重要，但是这种抗性可能要基于3 一羟苯乙酮 ( 3 - h y d r o x y a c e t o p h e n o n e ) 的存在( c u r i rp ，m a r c h e s i n ia ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。由激发的康乃馨 细胞纯化得到的n 苯甲酰转移酶( b e n z o y l c o a ：a n t h r a n i l a t en b e n z o y l t r a n s f e r a s e ) ，能 够催化来自于莽草酸途径的两种物质苯甲酰c o a ( b e n z o y l c o a ) 和临氨基苯甲酸盐 ( a n t h r a n i l a t e ) 生成n b e n z o y l a n t h r a n i l a t e 的反应( f i g u r e1 ) ，是康乃馨中植保素合成途 径的第一个酶，也是限速酶。纯化得到的酶对氨基苯甲酸盐显示出狭窄的特异性，对 4 或3 羟基邻氨基苯甲酸( 4 o r3 h y d r o x y a n t h r a n i l a t e ) 几乎没有活性( 分别少于l o 和3 0 ) 。然而在转移酶活性下，其他芳香族酰基物能够代替苯甲酰c o a s ( m a t e m u ，1 9 9 4 ；n i e m a n ng j ，1 9 9 3 ) 。在康乃馨细胞培养物中添加了诱导物之后，转移酶活性 4 兰州大学硕士学位论文拟南芥菜驴j 突变体的筛选及遗传、表型研究 很快在6 小时达到了最大值，即开始反应时的9 倍。但它只在很窄的温度内( 2 0 。c 左右) 和酸碱度( p h6 8 7 0 ) 范围具有催化活性并且很容易失活。p h6 0 和4 c 下，不到2 小 时酶几乎全部不可逆的丧失活性。另外，p h7 5 和4 0 条件下，该酶也很快失活( y a n g o ，r e i n h a r dk ，1 9 9 7 ) 。添加诱导物后的快速诱导，高催化活性以及来自于莽草酸途径 的两种物质苯甲酰c o a s 和氨基苯甲酸盐，使得这个酶在康乃馨抗病及调节途径中扮 演了重要的角色。由于在体外用肉桂酰或者4 香豆酰c o a s ( e i n n a m o y l o r 4 - c o u m a r o y l c o a ) 代替苯甲酰c o a s 时仍可发生上述反应，推测康乃馨中苯甲酰转移酶 可以视作高等植物中普遍存在的羟基肉桂酰转移酶( h y d r o x y c i n n a m o y l t m n s f e r a s e s ) 的 进化前体( s u z u k ih ，k o i k ey ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。并且，氨基苯甲酸盐在康乃馨中转变的机 制，可能会为吲哚生物碱生物合成调节的早期事件提供一些线索。这些方面都证实了 这个酶的分子组成以及表达是一个双功能酶，即羟基肉桂酰和苯甲酰转移酶 ( h y d r o x y e i n n a m o y l - a n db e n z o y l t r a n s f e r a s e ，h c b t ) ( q i a ny a n g l ，k l a u sr e i n h a r d ， 1 9 9 7 ) 。 b e n z o y l - 4 1 0 an b 蚰狮妇i h n n 渤协 d i 誓t m r 帅柚e 脚 一扣 m 眦喇哆d i 册m 憎m eb 图1 ：由h c b t 催化的m e t h o x y d i a n t h r a m i d e 的合成途径 f i g u r el ：r e a c t i o nc a t a l y z e db yh c b t i nt h ec o u r s eo fm e t h o x y d i a n t h r a m i d eb i o s y n t h e s i s 山丁草( c l a r k i a b r e w e r i ) 中分离得到一段e d n a 序列( f i g u r e 2 ) ，编码了苯甲酰c o a ： 苯甲醇苯甲酰转移酶( b e n z o y l - c o a ：b e n z y la l c o h o lb e n z o y lt r a n s f e r a s e ，b e b t ) 。正常 情况下b e b t 在叶片中没有表达，但是当叶片受损时，b e b t 将受到诱导并在损伤发生 后的6 小时活性达到最大。同样的状况在烟草和拟南芥中也有发现，当烟草的叶片受 5 兰州大学硕士学位论文 拟南芥菜g 佬j 突变体的筛选及遗传、表型研究 到植物病原体侵染，诱导表达的蛋白具有b e b t 的活性；而拟南芥中i 拘c h a t ( a c e t y l c o a ：c i s 。3 h e x e n 1 o la c e t y lt r a n s f e r a s e ，c h a t ) 也受到诱导而表达，表明了在叶片受伤 时这些酰基转移酶都参与了植物防卫反应( j o h ncd a u r i a , c h e nf ，2 0 0 2 ) 。 o 、厂，s c a ar o h o l 叁3 + ( 量l b e b 二t “一。7 、( 9 + 姒s h 图2 ：山丁草 b e b t 催化的反应 酰基化作用在代谢过程中是普遍存在的。目前b e b t 以及其他结构相似的酶类的 特点，促进了对进化上相关的其它酰基转移酶进行研究，通常这些酶被定义为酰基转 移酶b a h d ( b e n z y l a l c o h o la c e t y l 一，a n t h o c y a n i n - o - h y d r o x y - e i n n a m o y l - ，a n t h r a n i l a t e - n - h y d r o x yc i n n a m o y l b e n z o y l - ，d e a c e t y l v i n d o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ，b a h d ) 家族。在模式植 物拟南芥中大约有7 0 个b a h d 基因家族成员，然而目前这些基因编码的酶的作用底物 及产物尚不明确( m ax y ，k o e p k ej ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。b a h d 家族成员都具有典型的保守氨 基酸序列h x x x d ，位于蛋白中部，普遍认为该序列构成了酶的活性中心，参与植物 的多种代谢途径，在植物各种次生代谢物