（生物医学工程专业论文）基于导电聚合物构建的亲和基材及其性能研究.pdf

摘要 膜的非特异性吸附；所制备的亲和膜在较高的温度和胆红素初始浓度、较低的 离子强度和白蛋白浓度下，对胆红素的吸附量较大。另外还考察了所制备的亲 和膜对于胆红素的吸附机理，结果表明实验数据符合f r e u n d l i c h 等温吸附机理， 且r 2 = 0 9 9 。 研究了亲和膜吸附胆红素后的洗脱和再生，采用n a o h 溶液、b s a 溶液对 膜进行洗脱，可将膜上9 5 的胆红素洗脱下来，使膜得以再生。 试验证明，采用导电聚合物构建的两种形态的亲和吸附基材一聚( n - 2 一羧 乙基吡咯) 微米管、聚( 吡咯3 羧酸) a a o 复合膜均有良好的吸附、解吸和 再生性能。 关键词：基材；亲和微米管；亲和膜；吸附 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sa r t i c l ef a b r i c a t e dt w om o r p h o l o g i c a la f f i n i t ya d s o r bm a t r i xb yc o n d u c t i v e p o l y m e r sa t f i r s tt i m e ：t h ep o l y ( n - ( 2 - c a r b o x y e t h y l ) p y r r o l e ) m i c r o t u b e sa n dt h e p o l y ( p y r r o l e 一3 一c o o h ) 一a a o m e m b r a n e ，a n d r e s e a r c h e do nt h em o r p h o u s ， p h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c ，a d s o r p t i o n ，e l u t i o na n dr e g e n e r a t i o n ( 1 ) f a b r i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c sr e s e a r c ho ft h ep o l y ( n - ( 2 。c a r b o x y e t h y l ) p y r r o l e ) m i c r o t u b e s ： t h ep o l y ( n 一( 2 一c a r b o x y e t h y l ) p y r r o l e ) m i c r o t u b e sw e r ef a b r i c a t e db yc h e m i c a l o x i d i z i n gn ( 2 c a r b o x y e t h y l ) p y r r o l e o n t o p o r o u sp o l y c a r b o n a t e ( p c ) t r a c k e t c h m e m b r a n eu s i n gt e m p l a t em e t h o d c u 2 + w a ss e l e c t e da sl i g a n d ，c h e l a t i n gr e a g e n t i d ar e a c t e dw i t h - c o o ho nt h ee x t e r i o ra n di n t e r i o rs u r f a c eo ft h em i c r o t u b e s ，t h e c u 2 + i m m o b i l i z e da f f i n i t ym i c r o t u b e sw i t hi d e a ls t r u c t u r ew a so b t a i n e d t h ec u 2 + c o n t e n to fa f f i n i t ym i c r o t u b e sw a s1 9 6m e g gm i c r o t u b e s h e m o g l o b i n ( h b ) w a sc h o s e na s t h e a d s o r b a t e ，t h e c h a r a c t e r i s t i c sa n d a d s o r p t i o nm e c h a n i s mo fa f f i n i t ym i c r o t u b e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r et h a t ：t h e p r e p a r e da f f i n i t ym i c r o t u b e ss h o w e dg o o da d s o r p t i o ns p e c i f i c i t y f o rh b ；h i g h e r a d s o r p t i o nc a p a c i t y c a nb ea t t a i n e da tl o w e ri o ni n t e n s i t y , h i g h e r i n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fh ba n dn e u t r a lh bs o l u t i o n ( p h = 6 8 ) ；t h em e c h a n i s m so fh b a d s o r p t i o no nt h ea f f i n i t ym i c r o t u b e sf i t t e dt h ef r e u n d l i c hm o d e lw e l l ，a n d 群2 0 9 9 9 t h ee l u t i o na n dr e g e n e r a t i o no fa f f i n i t ym i c r o t u b e sw e r es t u d i e d t h eh b a d s o r b e do nt h ea f f i n i t ym i c r o t u b e sc a nb et o t a l l ye l u t e db yt h ea c e t i ca c i d s o d i u m a c e t a t eb u f f e r ( p h = 3 6 ) ，a n dt h ee l u t er a t ew a s9 9 6 3 c u 2 + w a se l u t e db ye d t a ， a n dt h ee l u t er a t ew a s9 5 a f t e ra d s o r p t i o na n de l u t i o ne x p e r i m e n te x e c u t e d10 c y c l i c t h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yd e c r e a s e d8 ( 2 ) f a b r i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c sr e s e a r c ho ft h ep o l y ( p y r r o l e 一3 一c a r b o x y l i c ) 一aa om e m b r a n e ： t h e p o l y ( p y r r o l e 一3 一c o o h ) - a a o m e m b r a n ew a sf a b r i c a t e db yv a p o r t i t 目录 d e p o s i t i o np o l y m e r i z a t i o n ( v d p ) o n t oa a om e m b r a n e l y s i n ew a ss e l e c t e da s l i g a n d ，t h r o u g h - n h 2r e a c t e dw i t h - c o o h o ns u r f a c eo ft h em e m b r a n e ，t h el y s i n e c o n t e n to f a f f i n i t ym e n m b r a n ew a s5 8 6m g gm e m b r a n e b i l i r u b i n ( b r ) w a sc h o s e na st h ea d s o r b a t e ，t h ec h a r a c t e r i s t i c sa n da d s o r p t i o n m e c h a n i s mo fa f f i n i t ym e m b r a n ew e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e d ：t h ep r e p a r e d a f f i n i t ym e m b r a n es h o w e dg o o da d s o r p t i o ns p e c i f i c i t yf o rb r ；h i g h e ra d s o r p t i o n c a p a c i t yc a nb ea t t a i n e da tl o w e r i o ni n t e n s i t y , h i g h e ri n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fb ra n d l o w e ra l b u m i ni n t e n s i t y ；t h em e c h a n i s m so fb ra d s o r p t i o no nt h ea f f i n i t ym e m b r a n e f i t t e dt h ef r e u n d l i c hm o d e lw e l l ，a n dr 2 = 0 9 9 t h ee l u t i o na n dr e g e n e r a t i o no fa f f i n i t ym e m b r a n ew a ss t u d i e d t h eb r a d s o r b e do nt h ea f f i n i t ym e m b r a n ec a nb et o t a l l ye l u t e db yt h en a o ha n db s a ，a n d t h ee l u t er a t ew a s9 5 t h er e s u l t ss h o w e d ：t h ed i f f e r e n tm o r p h o l o g i c a la f f i n i t ym a t r i xf a b r i c a t e db y c o n d u c t i v ep o l y m e r s ：t h ep o l y ( n 一( 2 一c a r b o x y e t h y l ) p y r r o l e ) m i c r o t u b e sa n dt h e p o l y ( p y r r o l e - 3 - c o o h ) - a a om e m b r a n eh a df a v o u r a b l ea d s o r p t i o n ，d e s o r p t i o na n d r e g e n e r a t i o nf u n c t i o n k e y w o r d s ：m a t r i x ；a f f i n i t ym i c r o t u b e ；a f f i n i t ym e m b r a n e ；a d s o r p t i o n i v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体己经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：r 膏蓉营 夕年多月，口日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：t 曾慧絮 叩年多月，。日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 亲和柱色谱技术研究进展 1 1 1 亲和柱色谱法基本原理 近年来，生物技术的迅速发展，对于多肽、蛋白质、核苷酸等生物分子以及 细胞等纯化分离的要求越来越迫切。因为不论自然界存在的还是通过发酵、培养、 合成等手段人工制取的上述物质，在初始阶段总是由多种物质组成的混合物，不 能直接在医药、食品等行业应用，必须经过分离、纯化，提取出一种或几种真正 有用的物质，而将那些无用甚至有害的物质加以去除才能使用。这些生物分子一 般都具有生物活性，一旦脱离了它们原来的生理环境或与某些金属或载体相接 触，很容易改变其分子构象，并失去其固有的活性。它们的热稳定性也较差，有 的需在恒温( 如体温) 才不变性，有的需在低温( 如4 ) 才能保持其活性。在 用生物技术制取的初产品中，其浓度都较低，因此对它们的浓缩、分离、提取是 一个难以解决的复杂课题，是生物学家和化学家所面临的共同任务。对于生物工 程下游目标产品的纯化分离，采用传统的方法和手段，如沉淀、结晶、离心、冻 干、萃取等都还达不到所要求的纯度，还必须用色谱、膜分离等手段进一步分离 纯化。 亲和柱色谱( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，a c ) 是利用生化物质问特异性相互作 用从而实现分离，这种相互作用具有识别功能，即一种物质( 配基) 能特异性地 识别某一个或一类目标产物( 配体) ，因此该技术已经广泛应用于生物分子的分 离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、 核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等【1 2 1 。亲和作用是范德 华力、疏水力、空间和静电等作用力的综合表现，亲和吸附时，配基与配体之间 主要遵循以下互补匹配原则：( 1 ) 几何形状互补匹配；( 2 ) 静电相互作用互补匹 配；( 3 ) 疏水相互作用互补匹配。几乎所有的生物活性物质与其特异性的互补结 合物质之间，都存在着亲和作用，这种亲和作用是基于配基与生物分子之间的生 第一章绪论 物学特异性，而不是物理化学性质，因此，采用亲和柱色谱进行生物物质的分离 具有选择性强、纯化效率高等优点，其优化效果远远高于其他分离方法，已广泛 用于生物工程中许多有经济价值和应用价值的蛋白质产品的纯化。 1 1 2 亲和柱色谱的基材 亲和柱色谱对基材的要求是：( 1 ) 表面积大；( 2 ) 基材颗粒为均匀的球形， 有一定的机械硬度和化学稳定性；( 3 ) 非特异性吸附弱；( 4 ) 抗生物降解；( 5 ) 有一定的粒度；( 6 ) 能功能化，可直接或通过间隔臂与配基连接。在实际应用时， 还应考虑基材的孔隙率和基材骨架对配基微环境的影响。传统的亲和柱色谱基材 填料是从液相色谱发展而来的，如琼脂糖、聚丙烯酰胺、纤维素、硅胶、多孔玻 璃、陶瓷等，这些均为微球或无定形填料，大小一般在6 0 - - 3 0 0 目之间。其中最 常用的是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。多糖结构疏松，不易吸附敏感生物大分 子，也不使其变性，且p h 适用范围比较广，亲和容量高，价格比较便宜。这类 基材不足之处是质软，不耐压，在较低的p h 范围内易降解，此外，其固有的可 压缩性使其在流速方面受限制，因此限制了它在大规模分离纯化中的应用。为了 克服这些缺点，人们通过多糖交联方法获得了半刚性凝胶交联琼脂糖，常见的有 s e p h a r o s ec l4 b 、6 b 等，目前，多糖类凝胶仍是应用最广的亲和柱色谱基材。 控制孔径的多孔玻璃是亲和柱色谱中一类独特的基材，它不溶解，几乎不受洗脱 液、压力、流速、p h 值和离子强度变化的影响；但它非特异性吸附较强，有报 道将葡聚糖涂布于玻璃珠上，消除了非特异性吸附作用。另一种应用广泛的基材 是硅胶，其刚性结构在流速方面比琼脂糖有很大改善，机械强度高，有很好的流 体动力学性质和化学稳定性，不溶于有机溶剂，孔径和形状易人为控制，但由于 硅胶的表面有残余电荷使得其非特异性吸附强，且只在低p h 值范围内稳定，碱 性过大，即使表面覆盖一层疏水聚合物，易被腐蚀。近年来，在硅胶的改性研究 方面已见多篇文献报道。l a k h i 撕【3 】等用表面包敷一层葡聚糖的大孔硅胶作基材， 它结合了多糖凝胶的优点和硅胶的高机械强度，将n 一乙酰氨酸连接在这种基材 上，分离得到高纯度的胰岛素。基材的结合容量与其表面积呈正比。据此发展起 来的直径1 3 m 的硅胶和有机聚合物的无孔微粒，表面积大、刚性好、结合容 2 第一章绪论 量高，较好地改善了柱效，有利于提高样品的回收率和保持其生物活性，适合于 生物大分子的高分辨分离和快速分析。l e e 4 1 等以平均直径1 4 “m 的无孔硅球作 基材，分离纯化了人免疫球蛋i 兰t l g g 。合成的高分子微粒，如聚丙烯酰胺( p a a ) 、 聚乙烯醇( p v a ) 、聚四氟乙烯( p t f e ) 等，有良好的化学稳定性，p h 适用范围 广，与生物大分子有良好的生物相容性，在蛋白质的分离纯化过程中能保持样品 的生物活性；尽管耐压性和柱效率不如硅胶，但它们的亲水性减少了对蛋白质的 非特异性吸附。一些基材的适宜p h 范围见表1 1 。 表1 - 1 常用基材及其p h 值适用范围 t a b l e1 - 1u s u a lm a t r i xa n dt h es e r v i c e a b l er a n g eo f t h ep h 基材 p h 范围 纤维素 交联琼脂糖 葡聚糖 硅胶 玻璃 聚丙烯酰胺 羟乙基异丁烯酸 环氧乙烷丙烯酸聚合物 苯乙烯二乙烯苯聚合物 聚丙烯醇 n 丙烯酰胺2 氨基2 羟甲基1 ，3 丙二醇 聚四氟乙烯 1 1 4 2 1 4 2 1 4 8 湫 之 第一章聚n 一2 - 段l 辈毗喀亲和微米管的制备及性能研究 2 2 2 5 聚( n 一2 - 羧乙基吡咯) 亲和微米管的表征 采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜系统观察所制备的聚( n 2 羧乙基 吡l 咯) 微米管的表面形貌。 s e m 样品的制各：将所制各的固载c 一的亲和微米管分散在乙醇溶液中， 以硅片或导电玻璃为基底，将乙醇溶液滴在表面光滑的基底表面，待乙醇溶液 挥干，用液氮冷冻，根据所耍观察的角度摆放样品，对各试样表面进行喷金处 理。s e m 加速电压为2 0 0k v 。 t e m 样品的制备：将所制各的固载c u 2 + 的亲和微米管分散在乙醇溶液中， 用移液器吸取微量乙醇溶液滴在铜叫上，待乙醇溶液挥干用液氨冷冻，存透 射电子显微镜下观察铜网上微米管的形貌。 2 2 3 固载c u 2 + 亲和微米管的制备 2 2 3 1c n “的固载 。cj|-。h。誊，：挚o。!|! 图2 - 4 聚( n 2 一羧乙基吡咯) 亲和微米管固载配基c u 2 + 线路图 f i g 2 - 4 r e a c t i o ns c h e m e f o rp r e p a r a t i o no f c u “一c h e l a t e da f f i n i t yn a n o t u b e s 将微米管浸入5m l 的1 一( 3 - 二甲氨基丙基) - 3 一乙基碳二亚胺( e d c ) 、1 - 羟 基7 偶氮苯井三氮唑( h o a t ) 混合水溶液中进行活化1 5 1 6 1 ，e d c 的浓度为0 3 6 8 m p f l ，h o a t 与e d c 浓度比为1 ：0 1 ，存室温f 反应3h 。反应完成后将微米管 转移至0 1 6 m 的亚氪基二乙酸( i d a ) 的碳酸钠溶液中，5 0 下反应1 2h ，再 。、，叼 。：鬈气 * 第二章聚n 2 一羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 将纳米管浸入0 0 2m 的硫酸( c u s 0 4 ) 溶液中室温下反应2h ，螯合配基c u 2 + ， 即得聚( n 2 羧乙基吡咯) 金属螯合微米管。配基固载的过程如图2 4 所示。 2 2 3 2 微米管上所固载c u 2 + 含量的分析 由于c u 2 + 能与螯合剂e d t a 进行显色反应，可通过标准曲线法，于7 4 0 n l l l 处分别测定c u s 0 4 溶液反应前后的吸光值，将吸光值带入标准曲线求得c u s 0 4 溶液反应前后浓度差，从而计算得到固载在微米管上c u 2 + 的含量。 具体测定方法及条件为：配置5m l 浓度为o 0 5m 的c u s 0 4 溶液，取适量 用e d t a 显色，在7 4 0 眦波长处测得吸光度值，准确称取适量的偶联了i d a 的微米管，浸入中上述c u s 0 4 溶液，螯合反应2h 后，取适量c u s 0 4 溶液用e d t a 显色，在7 4 0a m 波长处测得吸光度值a l ，将和a 1 分别代入标准曲线计算 反应前后浓度羞，进而计算出c u 2 十固载量。 图2 - 5c u 2 + 的标准曲线 f i g 2 - 5s t a n d a r dc u r v eo fc u 2 + 标准曲线绘制方法： 配置0 0 2 5m 的c u s 0 4 溶液；用移液管准确量取0 1 、o 2 、0 3 、0 4 、o 5 、 0 6 、0 7m lc u s 0 4 溶液置于1 0m l 的容量瓶中，以e d t a 水溶液( o 1m ) 定容 3 l 第二章聚n 一2 羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 至刻度。使用u v 2 1 0 0 紫外可见分光光度计在7 4 0n m 处测定吸光度值，以0 1 me d t a 水溶液为空白。 以c u s 0 4 溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果参 见图2 5 。 2 2 4 亲和微米管的吸附试验 2 2 4 1h b 的分析方法 由文献【1 8 , 1 9 1 可知，h b 在4 0 5n l n 处有最大吸收峰，故可在4 0 5n l t l 波长下测 定h b 的含量。以每次所用的溶剂作为空白，用d u 8 0 0 核酸蛋白检测仪测定吸 附前后h b 溶液的吸光度值变化( 测定波长为4 0 5n m ) ，根据不同p h 值条件下 绘制的h b 标准曲线计算浓度。 准确称取一定量的牛血红蛋白( 1 i b ) 置于烧杯中，加入适量p h = 6 8 的 1 0m m 的磷酸盐缓冲溶液，静置待蛋白完全溶解后，转移入1 0 0m l 容量瓶中， 用p h = 6 8 的1 0m m 的磷酸盐缓冲溶液清洗烧杯数次，洗涤液亦转入容量瓶中， 最后缓缓加入p h = 6 8 的1 0m m 的磷酸盐缓冲溶液定容，即为h b 标准溶液。 配制过程中避免剧烈振荡。 p h = 6 8 条件下h b 的标准曲线制定：用移液管准确量取5 0 、7 5 、1 0 0 、 1 2 5 、1 5 0 、1 7 5m lh b 标准溶液于5 0m l 的容量瓶中，用p h = 6 8 的1 0m m 磷 酸盐缓冲溶液稀释定容至刻度。使用核酸蛋白检测仪分别测各溶液在4 0 5n n l 处的吸光度值，以p h = 6 8 的1 0m m 磷酸盐缓冲溶液为空白。p h = 4 8 、5 8 、 7 8 和9 1 的标准曲线的制定方法与p h = 6 8 的标准曲线制定方法一致，溶解蛋 白的溶液分别为p h = 4 8 的醋酸醋酸钠缓冲溶液、p h = 5 8 的磷酸磷酸钠缓冲 溶液、p h = 7 8 的磷酸磷酸钠缓冲溶液和p h = 9 1 的碳酸一碳酸钠缓冲溶液，测 定时分别以p h = 4 8 的醋酸醋酸钠缓冲溶液、p h = 5 8 的磷酸磷酸钠缓冲溶 液、p h = 7 8 的磷酸磷酸钠缓冲溶液p h = 9 1 的碳酸碳酸钠缓冲溶液为空白。 3 2 第二章聚n - 2 - 羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 c ( m g l ) 图2 - 6ap h = 4 8 的h b 标准曲线( 4 0 5n m ) f i g 2 - 6a s t a n d a r dc u r v eo f h ba tp h = 4 8 1 2 0 9 0 6 o 3 4 08 01 2 01 6 02 0 0 c ( m g l ) 图2 - 6bp h = 5 8 的h b 标准曲线( 4 0 5n m ) f i g 2 - 6b s t a n d a r dc u r v eo f h ba tp h = 5 8 3 3 第二章聚n - 2 - 羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 c ( r a g l ) 图2 - 6cp h = 6 8 的h b 标准曲线( 4 0 5n m ) f i g 2 - 6c s t a n d a r dc u r v eo f h ba tp h = 6 8 c ( m g l ) 图2 - 6dp h = 7 8 的h b 标准曲线( 4 0 5n m ) f i g 2 - 6d s t a n d a r dc u r v eo f h ba tp h = 7 8 第二章聚n 2 - 羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 c ( n a g l ) 图2 - 6ep h = 9 1 的h b 标准曲线( 4 0 5n m ) f i g 2 - 6e s t a n d a r dc u r v eo f h ba tp h = 9 1 以h b 的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，不同p h 值的标 准曲线结果参见图2 6 a ，b ，c ，d ，e 。 2 2 4 2 红细胞裂解液的制备 按文献报道【1 7 1 配置红细胞裂解液，取5 0 0m l 新鲜的牛血，在4 下以2 0 0 0 转分的速率离心1 0m i n ，将上层血浆移除，剩余约2 5 0m l 红细胞用3 倍体积 的0 9 n a c l 清洗5 次，得到的细胞裂解液进行再次离心( 2 0 0 0 转分，4 ，3 0 m i n ) ，除去细胞碎片即得所需红细胞裂解液。 2 2 4 3 实验方法 直接将微米管浸入1 0m lh b 溶液中，在2 5 中速振荡条件下吸附4h ，测 定吸附前后h b 溶液的浓度变化以计算吸附容量。 h b 在亲和微米管上的吸附量可依据下式计算。 q = 耸产 泣， 第二章聚n 2 一羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 式中，q 为微米管对蛋白的吸附量( m g g 管) ；c 。为蛋白的初始浓度( m g l ) ；c 。 为吸附后蛋白的浓度( m g l ) ；v 为蛋白溶液的体积( l ) ；w 为所用亲和微米管的 质量( g ) 。 2 2 4 4 时间对吸附的影响 以p h = 6 8 的磷酸盐缓冲溶液作为溶剂，配制1 5 0m g l 的h b 溶液1 0 “； 取所制备的固载c u 2 + 的亲和微米管约5 6m g ；在2 2 4 3 所述实验操作条件下进 行吸附实验，于不同时间点监测h b 溶液的吸光度值变化。根据公式( 2 1 ) 计 算每个时间点对应的吸附量。结果表明时间达到2 4 0m i n 时，达到吸附平衡。 2 2 4 5p l - i 值对吸附性能的影响 分别以p h = 4 8 的醋酸醋酸钠缓冲溶液，p h = 5 8 、6 8 、7 8 的1 0m l v l 的 磷酸盐缓冲溶液，p h = 9 1 的碳酸碳酸钠缓冲溶液为溶剂配制浓度为1 5 0m g l 的h b 溶液l om l ，作为吸附溶液，在2 2 4 3 所述实验操作条件下研究p h 值对 吸附性能的影响。每个不同p h 值条件的吸附实验都要取新制备的亲和微米管， 同条件下进行固载c u 2 + 的微米管的平行实验。根据吸附前后h b 溶液浓度的变 化，利用公式( 2 1 ) 计算吸附量。 2 2 4 6h b 初始浓度对吸附性能的影响 以p h = 6 8 的上述磷酸盐缓冲溶液作为溶剂，配制浓度分别为：5 0 、1 0 0 、 1 5 0 、2 5 0 、3 5 0m g lh b 溶液各1 0m l 。分别以上述各不同浓度的蛋白溶液作为 吸附质溶液，在2 2 4 3 所述实验条件下进行吸附性能研究，通过吸附前后溶液 中的h b 浓度变化并利用公式( 2 1 ) 计算出吸附量。 2 2 4 7 离子强度对吸附性能的影响 分别以含有0 、0 0 2 、0 0 5 、o 1 、o 4mn a c i 的p h = 6 8 的磷酸盐缓冲溶 液作为溶剂配制1 5 0m g l 的h b 溶液各1 0m l ，按所述实验条件下进行吸附。 3 6 第= 聚n ，2 - 羧基吡咯采和微米管的制鲁及性臆研究 根据吸附前后h b 溶液浓度的变化，代入公式( 21 ) 计算吸附最 2 2 5 蛋白的洗脱和亲和微米管的再生 2 2 5 1 洗脱液的配制 ( 1 ) 蛋白洗脱液一醋酸- 醋酸钠缓冲液( p h = 36 ) 的配制：称取醋酸钠5 l g ，加入冰醋酸2 0 m l ，搅拌使溶解，用蒸馏水稀释至2 5 0 m l 定容，塑料瓶中保 存备用。 ( 2 ) c 0 + 洗脱液e d i a ( 0 0 5 m ) 的配置：称取e d t a0 6 8 0 7g ，加入去 离子水2 0 m l ，搅拌使溶解，用蒸馏水稀释至1 0 0 m l 定容即l 。 2 2 5 2 蛋白的洗脱 洗脱步骤立下：将己吸附h b 的c u 斗螯合亲和微米管先在纯水巾浸泡并振 荡过夜，以去除凼物理吸附 去的蛋白，再置于p h = 36 的醋酸一醋酸钠缓冲液 中，于室温震荡洗脱4h 后，取出膜依移= 用去离子水、口h = 68 的磷酸盐缓冲 溶液冲洗。用紫外检测洗脱液中h b 的量，通过吸附量和洗脱量的比值，得出 蛋白洗脱率。蛋白洗脱率可依据公式( 22 ) 计算。 蚩。洗脱率= 堕篙芸需：! ：! 警- 。* c zz ， ：b h b 图2 7 固载c u 2 + 的亲和微米管的吸附解吸h b 过程 f i g 2 - 7s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o nf o rb a t c ha f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp r o e c e s s 鍪一 警 = 一 警 0 第二章聚n - 2 羧乙基吡咯亲和微米管的制备及性能研究 固载c u 2 + 的亲和微米管的吸附解吸过程如图2 - 7 所示。 2 2 5 3 微米管的再生 取已洗脱了m 的微米管，先在纯水中浸泡并振荡过夜，以去除因物理吸 附上的配基c u 2 + ，再加5m 1 洗脱液直接洗脱( 室温下中速振荡) ，洗脱时每隔 1h 测定洗脱液中的c u 2 + 浓度，并同时更换新的洗脱液，直到洗脱液中检测不 到c u 2 + 。作者采用o 0 5m 的e d t a 溶液对c u 2 + 进行洗脱。c u + 洗脱率可依据 公式( 2 3 ) 计算。 c p 洗脾= 罐禚鬻警川。 眩3 ， 将洗脱了c u 2 + 的微米管再置于o 0 5m 的c u s 0 4 溶液中，进行再次螯合，2 h 后取出用大量去离子水进行清洗，即得再生c u 2 + 螯合亲和微米管。 2 2 5 4 亲和微米管的特异性吸附 为了考察亲和微米管在真实体系中对h b 的特异性吸附，将微米管在红细胞 裂解液中吸附的蛋白进行洗脱，采用s d s p a g e 凝胶电泳对洗脱的蛋白进行定 性分析。 按表2 3 配备s d s p a g e 凝胶电泳浓缩胶和分离胶液，制备胶板。蛋白样品按 1 ：1 ( v v ) 与上样缓冲液混匀后，置于沸水浴中加热5m i n 。将配好的胶板放入电 泳槽中，精密吸取一定体积样品溶液加入到胶板的样孔中，进行电泳时设定浓缩 胶电压6 5v ，电泳2 0m i n ，然后调整分