（生物医学工程专业论文）节律基因period2对紫外线损伤细胞的研究.pdf

四川大学硕j ：学位论文 节律基因p e r i o d 2 对紫外线损伤细胞的影响 生物医学工程专业 研究生：史修波指导教师：王正荣教授 紫外线是引起d n a 损伤常见的物理因素。根据日光中紫外线波长的不同， 可将其分为3 种：u v a ( 3 1 5 - - 4 0 0 r i m ) 、u v b ( 2 8 0 - - 3 1 5 n m ) 和u v c ( 2 0 0 一 2 8 0 r i m ) 。其中u v c 较前两者造成的d n a 损伤重一些。过量的紫外线照射皮肤 可诱发皮肤癌。 近日节律广泛存在于生物体内，其周期在2 4 小时左右，故称为近日节律 ( c k c a d i a nr h y t h m ) 。人体的许多生理、生化参数均有近日节律的特点，如睡 眠觉醒、体温、血压、心率等，均表现出明显的近日节律。 p e r i o d 2 是近日节律基因家族的重要一员。研究发现，p e r i o d 2 和肿瘤的发生 发展有密切的关系。本实验室发现，p e r i o d 2 过表达能够减轻1 ，射线对细胞的损伤 作用，降低细胞对t 射线的敏感性。紫外线也能够引起细胞的损伤，其机制可能 与y 射线引起d n a 破坏类似。据此推测，p e r i o d 2 基因可能在紫外线引起细胞损 伤方面有一定的作用。 本文首先诱导体外培养的细胞产生近日节律，在p e r i o d 2 表达处于峰值和谷 值的时候给与紫外线照射。流式细胞术、克隆形成实验和彗星电泳实验的结果 发现，不同组细胞的凋亡率、细胞周期分布和细胞的生长能力具有显著性的差 异。然后，将p e r i o d 2 真核表达质粒转染入体外培养细胞中，增加细胞的p e r i o d 2 表达。发现p e r i o d 2 高表达的细胞与对照组细胞相比，紫外线引起的凋亡率、细 胞周期分布和细胞的生长能力改变具有显著性的差异。 紫外线照射可引起d n a 的单链断裂、双链断裂及环丁烷嘧啶二聚体形成， 这种损伤可经d n a 修复系统进行修复。通过彗星实验，提示p e r i o d 2 基因过表 达有抑制紫外线d n a 损伤并促进d n a 修复的作用。 关键词：近日节律；p e r i o d 2 ；紫外线；d n a 损伤 四川大学硕士学位论文 t h ei n f l u e n c eo fc i r c a d i a ng e n ep e r i o d 2o nc e l ld a m a g e db yu l t r a v i o l e t u l t r a v i o l e tr a d i m i o n ( u v ) i sac o m m o np h y s i c a lf a c t o ri nt h ec a u s eo fd n a d a m a g e a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tw a v e l e n g t h , u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nc a nb ed i v i d e d i n t ot h r e et y p e s ：u v a ( 3 1 5 - - 4 0 0 n m ) ，u v b ( 2 8 0 - - 3 1 5 r i m ) a n du v c ( 2 0 0 - - 2 8 0 n m ) u v c i n d u c e dd n ad a m a g ei sh e a v i e rt h a nt h a to ft h eo t h e rt w ou v s t u d i e s s h o w e dt l l a to v e r d o s eu vr a d i a t i o no ns k i nc a ni n d u c es k i nc a n c e r i na l m o s ta l ll i v i n go r g a n i s m s ，v a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n db e h a v i o r a lf u n c t i o n s ， s u c ha ss l e e p w a k ec y c l e ，b o d yt e m p e r a t u r e ，b l o o dp r e s s u r ea n dh e a r tr a t e ，a r e e x p r e s s e dr h y t h m i c a l l y t h e s ed a i l yr h y t h m s ，r e f e r r e dt oa sc i r c a d i a nr h y t h m ，a r et h e s t r o n g e s tb i o l o g i c a lr h y t h m p e r i o d 2i sam a j o rp a r t i c i p a n to fc i r c a d i a nf a m i l y c l i n i c a ls t u d i e sf o u n d p e r i o d 2h a dg r e a t r e l a t i o n s h i p w i t ht u m o rg e n e s i s i no u rl a b o r a t o r ys t u d i e s ， o v e r e x p r e s s i o no fp e r i o d 2r e s u l t si nr e d u c e dc e l l u l a rd a m a g ec a u s e db y1 , - r a ya n d r a d i o s e n s i t i v i t y i va l s oc a nc a u s ec e l l u l a rd a m a g ed r i v e nb yt h es i m i l a rm e c h a n i s m 船y - r a y s ow ei n f e r r e dp e r i o d 2m i g h tb ei n v o l v e di nc e l l u l a rd a m a g e t h en i h 3 t 3c e l l sw e r et r e a t e dw i t hr a d i oa tt w od i f f e r e n tt i m ep o i n t si n c l u d i n g p e r i o d 2e x p r e s s i o ni np e a kl e v e la n di nt r o u g hl e v e l a p o p t o s i sr a t e ，c e l lc y c l er a t e a n dg r o w t ha b i l i t yo ft w od i f f e r e n tt i m et r e a t m e n tc e l l sw e r ed e t e c t e dw i t h f l o w c y t o m e t r y , c o l o n yf o r m a t i o na s s a ya n ds c g e f u r t h e r m o r e ，w et r a n s f e c t e d p e r i o d 2 - e x p r e s s i o np l a s m i di n t oc e l li no r d e rt oi n c r e a s ep e r i o d 2e x p r e s s i o ni nc e l l a f t e rr a d i ot r e a t m e n t p e r i o d 2l l i g he x p r e s s i o nc e l la l s os h o wt h ed i f f e r e n c ei nc e l l g r o w t ha n da p o p t o s i s u vi r r a d i a t i o nc a l li n d u c ed n ad a m a g es u c h 嬲s i n g l e b o n d b r e a k a g e d o u b l e b o n db r e a k a g ea n dc y c l o b u t a n e p y r i m i d i n ed i m m e rf o r m a t i o n , w h i c hc a nb e r e p a i r e db yd n ar e p a i rs y s t e m r e s e a r c hr e s u l t sb ys c g es h o w e dt h ee f f e c t so f p e r i o d 2g e n eo ni n h i b i t i n gd n a d a m a g ea n dp r o m o t i n gd n ar e p a i rm a yp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei np r e v e n t i o na n dt h e r a p yo fu v i n d u c e dd a m a g ed i s e a s e s 2 四川大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：c i r c a d i a nr h y t h m ，p e r i o d 2 ，u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，d n ad a m a g e 3 四川大学硕士学位论文 第一章前言 近日节律广泛存在于生物体内，其周期在2 0 - - 2 8 小时之间，故称为近日节 律( c i r c a d i a nr h y t h m ) 。该节律是生物体内最强的生物节律。人体的许多生理、 生化参数均有近日节律的特点，如睡眠一觉醒、体温、血压、心率等，均表现 出明显的近日节律”。就本质而言，近日节律的产生是由一系列时钟基因的转 录和转录后调控所引起的分子振荡。 i 近日节律及近1 3 节律基因 中枢生物钟在高等动物是指位于视交叉上核( s c n ) 的分子振荡器，视交 叉上核在维持机体行为节律以及外周生物钟节律方面起着重要的作用。研究表 明，中枢生物钟对光- 暗周期变化敏感，主要对其作用的授时因子是夜间的光刺 激，而且作用时段应是主观夜晚的早期和末期。其它因素如饮食并不能影响s c n 生物钟基因表达。光信息由视网膜的独立光感受器传递到s c n ，递质主要为谷 氨酸盐，谷氨酸盐受体可能为化学门控c a 2 + 通道，引起c a 2 + 内流，最终导致靶基 因的激活睇j 。期间，乙酰胆碱可能也参与了信息传递过程。该刺激的靶基因很 可能是p e r i o d l ( p e r l ) 和p e r i o d 2 ( p e r 2 ) 基因，这两个基因在接收到光信息后都 会出现与光刺激相关的变化，但它们的反应有各自的特点。通过对基因突变的 个体研究表明，在光诱导中枢生物钟节律重新设置的过程中，n r ，和n 厂2 基因 是必需的。其它基因如c r y l 和c r y 2 基因则可能是非必需的，因为在c r y l 和c r y 2 突变的小鼠中，光仍然能使心r 基因的节律表达发生改变。光能迅速激活n r 基 因表达，可能与转录因子c r e b 磷酸化和m a p 激酶的激活有关【3 1 。 外周生物钟对光暗循环的反应较中枢慢，而且正常情况下受中枢调控，与 中枢节律同步。如单独的肝细胞生物钟在光诱导1 6 天后，也不能完全适应新的 光暗循环周期。但有研究发现，外周生物钟的适宜刺激是某些非光授时因子， 非光授时因子较光刺激更能诱导外周生物钟节律的重置，这可能与进化选择有 关，因为光不能直接到达。肾、肝等外周器官组织中。但也有研究表明光照胭窝 可引起褪黑素分泌节律改变，其机制有待研究。b a l s a l o b r e 等【4 】发现，糖皮质类 激素能改变外周生物钟n ，基因的节律表达，从而对外周生物钟的节律进行重 4 四川大学硕士学位论文 新设置，但该激素对中枢生物钟节律几乎无影响。而且与仅主观夜晚的光脉冲 才能激活尸钾基因的表达不同的是糖皮质激素在任何时间都能诱导户钉基因表 达。另外有研究表明，视黄酸( r e t i n o i ca c i d ) 即能改变体内心r 基因表达节律，也 能改变体外培养( 含血清培养基) 的血管平滑肌细胞 r 基因表达节钭5 1 。在此 过程中，视黄酸受体能与c l o c k b m a l l 和m o p 4 b m a l l 异源二聚体相互作 用，从而引起生物钟基因表达节律发生改变。另外发现，人的n ，j 启动子能被 白i l 6 激活，这与c a m p 信号路径有关。还有实验表明，干扰素a 能干扰小 鼠的活动节律、体温节律和生物钟基因表达节律。还有体外实验表明，血清能 诱导大鼠成纤维细胞生物钟基因节律表达1 6 j 。另外发现动物摄食周期变化也能 影响生物钟近日节律的表达1 7 1 。 近日节律是由一组近日钟基因及其基因产物相互作用构成的一个闭环震荡 系统产生的。不同种属动物的近日节律系统有很大差异，但总体来说由三个基 本部分组成：接受和传递外界环境刺激至振荡器的输入途径，启动产生节律的 振荡器，节律的输出部分i 鄹。 振荡器是维持生物节律的关键组分，它是指生物体内的关键基因表达随昼 夜节律而有规律的振荡，导致蛋白水平也随昼夜更替有规律地振荡，通过对下 游基因( 钟控基因) 表达的调控输出其影响，调节众多生命过程。对近日钟 ( c i r c a d i a nc l o c k ) 的分子机制的研究主要集中在振荡器的研究上。自1 9 8 4 年 r o c k e f e l l e r 大学的遗传学家m y o u n g 等从果蝇中发现了与近日节律有关的基因 p e r i o d 后，基因( c i r c a d i a nc l o c kg e n e ) 的相关研究逐渐引起人们的重视。大量 的近日钟基因( 如c l o c k ，t i m , b m a l l ，c r y l 2 ，r e v 等) 。以及钟控基因( c c g ) ( 如d b p , p k 2 , e 4 b p 4 , r i p , t e l 等) 被发现，人们对近日节律钟振荡器部分有了一 个较为清楚的认识h 。人类的这些基因称为h p e r i o d ，h c i o c k ，h t i m e l e s s 等，而 小鼠的这些基因称为m p e r i o d ，m c l o c k ，m t i m e l e s s 等。 利用e m s 诱变，k o n o p k a 等i lu j 在1 9 7 1 年筛选出了果蝇的e e l ( 长周期基 因) ，n r 轼短周期基因) ，p e r 0 ( 去周期基因) ( o ：a b o l i s h e d ；s ：s h o r t e n e d ；l ：l e n g t h e n e d ) 等3 个生物钟突变型，n 儿突变型具有延长的昼夜节律( 2 8 - 3 0 小时) ；p p 心 突变型昼夜节律有明显缩短；而p e r o 则缺乏昼夜节律，因为该基因的突变改变 了果蝇的近日节律周期，因此k o n o p k a 把它称为“周期基因”( p e r i o d ) 。在d 四川大学硕t 学位论文 m e l a n o g a s t e r 中，p p ，基因总长约1 3k b ，有8 个外显子，包括1 2 1 8 个氨基酸 的开放阅读框架。其中第1 个外显子和第8 个外显子的一部分不编码蛋白质， 另两个转录产物是通过3 端不同的拼接产生的，它们在细胞中的浓度较低，但 是相应的转化实验证明三者都可以重建突变体的节律0 1 。 在鼠和人体内也发现了类似于果蝇p 打的基因，并且存在尸台r ，、n 刀，p p 一 三种亚型，它们表达的部位和时相上有着差异 1 2 1 。p e r l 抑制p e r 2 表达，在 s c n 维持节律的稳定性、精确性，与节律的周期及振幅关系不大。在外周，起 调控节律的周期和振幅。p e r 2 在s c n 处，与节律的周期及振幅维持有关，而 p e r 3 突变后节律无明显改变。 s h e a r m a n 等【1 剐于1 9 9 7 年分离出编码n 以的e d n a ，小鼠忍r 2 的同源物， 他们报道，人的n ，2 蛋白与p e r 和小鼠的p e r 2 具有4 4 和7 7 的同源序列。 n 以含有p a s 蛋白二聚化的结构域和3 个假定的双侧细胞核定位区域( p u t a t i v e b i p a r t i t en u c l e a rl o c a l i z a t i o nd o m a i n s ) 。n o r t h e r n 印迹杂交分析表明p e r 2 在组织 中，转录为7 k b 的m r n a 的；另外，也同时在相同的组织中检测到1 8 k b 转录 本。 p e r 2 基因功能多通过基因敲除小鼠而得以研究。m p e r 2 的p a s 结构域是被 敲除产生了突变的等位基因m p e r 2 b m 。该种小鼠在d d 条件下，其转轮运动与 野生型小鼠相比，其周期缩短，并且这种短周期逐渐转变为节律紊乱 ( a r r h y t h m i a ) 。该表现与c l o c k 基因突变小鼠十分相似。另有报道说，r o p e r 2 基 因敲除小鼠，s c n 中r o p e r l 和r o p e r 2 基因转录的m r n a 的水平同时降低，表 明r o p e r 2 在体内可能通过直接或间接的方式控制这些基因的转录。 近年来，许多研究工作者将研究目光对准了n r 2 与肿瘤治疗的相关性研 究。在外周组织的细胞中，s c n 近日钟通过调节近日钟控基因的表达来控制着 细胞的增殖和凋亡。在啮齿类动物中，大约7 的钟控基因已被证实参与调节 细胞的增殖和凋亡。这些钟控基因包括c - m y c 和m d m 2 ，抑癌基因t ，p 5 3 和 g a d d 4 5 a ，以及编码半胱天冬酶c a s p a s e ，细胞周期蛋白，转录因子和泛素相关 因子( u b i q u i t i na s s o c i a t e df a c t o r ) ，可以调节细胞周期和凋亡。许多细胞周期蛋 白和抑癌基因p 5 3 的节律性表达，在人类口腔黏膜中被检测到。这些基因的表 6 四川大学硕士学位论文 达周期变化与相同组织中n r ，和b m a lj r 的表达一致1 14 1 。 最近，在缺失核心钟基因n 以的小鼠中发现其唾液腺增生并有自发性淋巴 瘤的发生。可能是因为p e r 2 突变小鼠因为多种分子途径的失衡，导致具有易患 肿瘤的特性。由c - m y c 介导的生长调节途径可能是近日钟失调后促进肿瘤形成 的可能机制之一。c - m y c 的过度表达可以导致d n a 的损伤、增生和肿瘤的产生。 e - m y cm r n a 在小鼠组织内存在有低振幅震荡，在凡以突变小鼠体内2 4 小时 周期内其表达量显著增加。近日节律异二聚体调节因子例如b m a l l _ c l o c k 和 b m a l l - n p a s 2 在转录水平负性调节e - m y c 的表达。n 力功能的丧失，导致2 4 小时明暗周期中，b m a l l 表达的降低，致使b m a l l - c l o c k 或b m a l l - n p a s 2 细 胞内水平的降低，对c m y c 脱抑制。另外，e - m y c p l 启动子直接由核心近日节 律调节因子所抑制，表明c m y c 是一个钟控基因。m y c 目标基因c c n s l 和c c n a l 2 的表达在体内也呈现出近日节律的振荡，该振荡在心，2 突变小鼠中具有显著变 化。 1 9 9 7 年美国西北大学的t a k a h a s h i 研究小组成功克隆了小鼠的c l o c k 基因。 经连锁分析证实该基因位于小鼠第五号染色体上。而且t a k a h a s h i 确定了 c l o c k 蛋白质的突变区域，c l o c k 蛋白含有一个蛋白质蛋白质结合区域 ( p a s ) 。研究证明小鼠的c l o c k 基因的突变会使小鼠丧失近日节律。小鼠c l o c k 基因位于小鼠5 号染色体，长约1 0 0 k b ，有2 4 个外显子，e d n a 全长约1 0k b 。 a l l a d a 掣2 0 】发现人c l o c k 基因位于4 号染色体长臂，其内含子外显子的组 成也与小鼠一样，其编码序列长2 5 3 8 b p ，与鼠有8 9 的同源性。 。 c l o c k 基因产物是以杂二聚体的形式发挥生物学作用，其配体为b m a l l 。 b m a l l 基因的表达产物b m a l l 蛋白是与c l o c k 基因表达蛋白。通过酵母双杂交 系统配对结合筛选出来的。b m a l l 也是b h l h p a s 家族的转录因子，其表达 存在近日节律性l l $ l 。 b m a l l 在果蝇中的类似物被称为c y c l e ，c y c l e 基因在1 9 9 8 年得以鉴定 和克隆。c y c l e 基因也是昼夜节律产生和维持所必需的。c ，d 靠基因和c y c l e 基因 的产物形成杂二聚体，起正向调节作用；p e r i o d 基因和f 咖基因的产物杂二聚体 起负调节作用。c l o c k c y c l e 作用于p e r i o d 和t i m 的启动子区的e b o x ，激 7 四川大学硕士学位论文 活p e r i o d 和t i m 基因转录。 在对拟南芥、果蝇和小鼠中隐色素( c r y p t o c h r o m e ) 进行的研究中发现，这 种蛋白在生物钟的光信号转导及近日钟的振荡中发挥重要作用【1 6 1 。c r y 基因编 码的蛋白质c r y 是一种核蛋白，在反馈环路中起负调控的作用。 哺乳动物近日系统的负反馈很可能由两种隐色素m c r y i 和m c r y 2 完成， m c r y 抑制m c l b m a l l 介导的基因激活。m c r y lm r n a 及m c r y l 和m c r y 2 蛋白存在循环，与s c n 中m p e r 转录产物和蛋白相协调。和m p e r 转录产物一 样，c l k 突变小鼠中m c r y l 和m c r y 2 的m r n a 都减少。m c r y s 在体外双杂交 试验中结合到b m a l l 和m c l o c k 上。这些蛋白可单独起作用或在复合物中抑 制m c l k b m a l l 激活基因表达。另外这些蛋白还可能有其他的功能，例如 m c r y 蛋白可影响m p e r 的细胞内定位，还可稳定m p e r i o d 2 。 s e h g a l 等在1 9 9 4 年筛选出t i m e l e s s 基因，并于1 9 9 5 和1 9 9 8 分别由m y e r s 等测序。它的转录产物为4 9 5 5 b p 的m r n a ，其表达蛋白有1 4 2 1 个氨基酸残基。 果蝇的t i m e l e s s ( t i m ) 基因是其近日功能发挥所必需的，推定的果蝇t i m 同系 物已经在小鼠和人上得到了鉴定( 分别是m t h n 和h a m ) 。完整的果蝇基因组数 据库分析显示，哺乳动物t i m 不是果蝇t i m 的真正同源物，而是一个新近发现的 果蝇基因一t i m e o u t ( 也称t i m 2 ) 的类似物。由于果蝇t i m 所起的核心钟功能已经被 小鼠其他的钟相关基因所代替，所以哺乳动物不存在其等价物。与此一致的是， 人类基因组序列分析没有发现另外的t i m e l e s s 同系物。 n p a s 2 神经源性p a s 蛋白因2 ，又名m o p 4 ，是一种主要表达于动物 前脑的转录因子，其初级氨基酸序列与c l o c k 相似旧。它是b h l h p a s 域转 录因子家族的成员。研究证明n p a s 2 是c l o c k 的功能类似物，它和b m a li 也能形成二聚体，激活凡r ，、n 刀和c r y 的转录。而且n p a s 2 无功能突变的 小鼠被置于连续黑暗环境中时，凡门的m r n a 水平不再发生节律性振荡。 2 紫外线照射导致的细胞d n a 损伤及损伤修复的研究现状 2 1 紫外线诱导细胞d n a 损伤的研究现状 8 四川大学硕士学位论文 对于人类的生存来说，太阳光中的紫外线( u v ) 辐射是一种非常显著的环境 因子，它主要作用于人的皮肤。根据波长大小，太阳光中的紫外线可以分为三 类：i ) u v a ，波长为3 1 5 - 4 0 0n i n ，是长波紫外线，能穿透真皮；2 ) u v b ，波长为 2 8 0 3 1 5n i n ，是中波紫外线，可以穿透皮肤几毫米；3 ) l r v c ，波长为2 0 0 2 8 0n m ， 是短波紫外线，能量较高。不同波长的紫外线对机体的损伤程度不同。 有机分子中的共轭键能吸收较短波长的u v 射线，而线性重复结构或环状 结构吸收较长波长的l 射线。d n a 上所有碱基都包含有环状结构和许多共轭 键，所以在细胞中主要是d n a 吸收u v 射线，u v 射线将首先损伤细胞中的染 色体，从而使d n a 上的基因受到损伤。这种损伤可导致细胞内的基因发生突变 【l 引。紫外线诱导产生的d n a 损伤主要都是通过核甘酸切除修复途径进行修复 的，切除细胞内大量d n a 加合物及螺旋扭曲损伤，同时修复位于转录d n a 链 上的损伤【1 9 1 。核甘酸切除修复途径是d n a 损伤修复最主要的机制之一。紫外 线诱导d n a 损伤的效应最终可在细胞增殖、凋亡、周期等方面体现。 2 1 1 损伤对细胞增殖与分化的影响 u v 对细胞生长的影响，可以表现在细胞形态、增殖能力、存活情况等方面。 1 9 5 9 年f a l l l 2 0 】等最早发现u v 照射后表皮郎格汉斯细胞( l c ) 的形态改变， 随后s e i t es 1 2 1 】等采用不同波长的紫外线照射健康志愿者的皮肤，结果发现在给 予2 m e ( m i n i m a le r y t h e m a ld o s e ，最小红斑量) 照射后，l c 密度及其表面标志分 子数量明显下降，表现在l c 细胞体积变小，树突减少并缩短，部分断裂，l c 与角质形成细胞之间的连接变松散等；还有研究发现，较大能量u v b 照射可直 接损伤肥大细胞的细胞膜，使大量生物活性物质释放，引起局部血管扩张【2 2 1 。 可见，u v 照射将通过抑制免疫细胞的增殖和破坏正常的细胞形态，进而影响皮 肤免疫系统。 实验发现4 0 m j c m 2 的l i v - b 能够影响细胞的增殖能力，使角化细胞和成纤 维细胞的细胞活力降低吲。u v 照射还可以抑制c o n a 诱导的脾细胞增殖反应， 而2 0 0 j m 2 的u vb 几乎可以完全抑制淋巴细胞增殖【2 4 1 。另外，u v 照射还可以 抑制细胞的克隆形成能力，甚至导致细胞死亡瞄j 。 2 1 2 损伤对细胞凋亡的影响 四川大学硕l 学位论文 细胞凋亡是一种受多基因控制的程序性细胞死亡过程，是与细胞坏死完全 不同的细胞的生理性死亡形式。当细胞损伤严重、修复无望时，细胞群体以凋 亡的形式以消除严重受损的细胞，避免将错误的遗传信息传递给子细胞或发生 恶性转化。u v 产生的d n a 损伤即可诱导细胞凋亡的发生。 冯莉等人在研究紫外线诱导的h e p g 2 凋亡的分子机制时发现，经紫外线辐 射处理的h e p 2 g 2 细胞的p 5 3 ，c a s p a s e 3 和b c l 2 基因表达增加，表明紫外线辐 射所致的d n a 损伤可诱导d n a 受损细胞内p 5 3 等多种细胞凋亡调控基因表达 改变，从而导致细胞凋亡。许多学者研究表明，u v 辐射造成的损伤可通过激活 f a s 途径诱导细胞凋亡【27 1 。 2 1 3 损伤对细胞周期的影响 许多学者的研究发现，细胞在受到u v 照射后其细胞周期出现阻滞现象， 且阻滞的时相与细胞类型有关。成纤维细胞在经u v 照射后细胞周期的改变也 表现出显著差异，年轻细胞g l 期阻滞率明显高于衰老细胞1 2 8 1 。研究发现u v 可使照射的结肠癌细胞( w i d r ) 停止于g 1 期，并且这种效应在p 5 3 突变型和p 5 3 野生型的细胞中均有体现，而在p 5 3 缺失的细胞中却无此现象。与之相似的是 人正常的角化细胞经u v 照射后表现g 1 期的短暂停滞，而p 5 3 突变的癌变细胞 却不发生细胞周期的阻滞【2 9 j 。进一步研究发现，u v 造成的g l 期停滞存在依赖 p 5 3 和不依赖p 5 3 的两种途径1 3 0 】。因此，u v 造成的细胞周期的变化与细胞内信 号通路中某些蛋白的表达量密切相关。 2 2 紫外线诱导的细胞d n a 损伤修复的途径及主要机制 d n a 损伤的修复是影响细胞存活和死亡的主要原因。对细胞损伤修复的研 究最早源于细菌对紫外线光复活效应的研究。目前研究表明，无论是原核生物 还是真核生物，u v 诱导产生的d n a 损伤主要都是通过核昔酸切除修复 ( n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r , n e r ) 修复的l 3 1 1 0n e r 机制是切除细胞内大 量d n a 加合物以及螺旋扭曲损伤的主要路径，也是d n a 损伤修复最主要的机 制之- - 1 3 2 1 。 n e r 机制可分为两种作用模式：能够修复全体基因组上损伤的称为全基因 组n e rc g l o b a l g e n o m e n e r , g g n e r ) 、修复位于转录d n a 链上损伤的称为转 l o 四川大学硕上学位论文 录祸联性n e rt t r a n s c r i p t i o n - c o u p l e dn e r , t c - b j e r ) ，前者修复速度相对较慢。 g g n e r 修复速度依赖于损伤的类型，如6 4 光产物自基因组的去除要快于环 丁烷啼吮二聚体，这可能与损伤传感器x p c h h r 2 3 b 对不同损伤的敏感性有关。 此外，损伤位置也会影响切除修复的速度，在t c - n e r 中，损伤只有遇到延伸 r n a 聚合酶i i 时才能够被识别【3 2 1 。 3 本研究的目的 细胞d n a 损伤以及损伤修复对细胞基因组的稳定至关重要。研究这一问题 可以能够深入了解遗传物质的结构、功能及遗传稳定性，深入了解基因稳定对 细胞生命活动的意义；同时u v 作为环境因子在人们的经济与生产过程中对人类 的健康有重要的影响。因此研究u v 诱导的细胞d n a 损伤及损伤修复可为辐射 生物学领域的相关研究研究提供理论和实验等方面的科学资料。 单细胞凝胶电泳是一种检测细胞d n a 微量损伤的方法，高灵敏度，快速、 方便和相对便宜，并能精确检测细胞d n a 的损伤，并可对损伤后的修复进行检 测。紫外线常用作实验室研究细胞损伤的工具，其辐射波长介于电离辐射与非 电离辐射之间，且照射能量易于控制，容易进行实验设计与结果的分析处理。 本论文应用流式细胞术、克隆形成实验、单细胞凝胶电泳的方法，研究紫 外线对n i h 3 t 3 细胞d n a 的损伤情况：并进一步探讨u v c 介导的细胞d n a 损 伤与损伤修复的初步机理。 四川大学硕上学位论文 参考文献 1 王正荣等编。时间生物学 m 】。科学出版社，2 0 0 6 。 2 g i l l e t t em u ，m i t c h e l lj w s i g n a l i n gi nt h es u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ：s e l e c t i v e l yr e s p o n s i v e a n di n t e g r a t i v e c e l lt i s s u er e s 2 0 0 2 ；3 0 9 ( 1 ) ：9 9 1 0 7 3 l i s e t t ek e v a ne s s c v e l d t , m i c h a e ln l e h m a n ，g e r a r dj b o e rt h es u p m c h i a s m a t i c n u c l e u sa n dt h ec i r c a d i a nt i m e - k e e p i n gs y s t e mr e v i s i t e d b r a i nr e s e a r c hr e v i e w s2 0 0 0 ；3 3 ： 3 4 - - 7 7 4 a l b r e c h tu i n v i t e dr e v i e w ：r e g u l a t i o no f m a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c kg e n e s ja p p lp h y s i o l ， 2 0 0 2 ，9 2 ( 3 ) ：1 3 4 9 一1 3 5 5 5 y a m a z a k is ，n u m a n o 凡a b em ，e ta 1 r e s e t t i n gc e n t r a la n dp e r i p h e r a l c i r c a d i a n o s c i l l a t o r s i nt r a n s g e n i c r a t s s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 8 8 ( 5 4 6 6 ) ：6 8 2 8 5 6 b a l s a l o b r ea ，b r o w nsa ，m a r c a c e il ，e ta 1 r e s e t t i n go f c i r c a d i a nt i m ei np e r i p h e r a lt i s s u e s b yg l u c o c o r t i c o i ds i g n a l i n g s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 89 ( 5 4 8 8 ) ：2 3 4 4 - - 4 7 7 m c n a m a r ap ，s e os 只r u d i crd ，e ta 1 r e g u l a t i o no fc l o c ka n dm o p 4b yn u c l e a r h o r m o n er e c e p t o r si nt h ev a s c u l a t u r e ：a h u m o r a lm e e h a n i s m t o r e s e t ap e r i p h e r a lc l o c k c e l l ， 2 0 0 1 ，1 0 5 ( 7 ) ：8 7 7 - $ 9 8 徐军，童建生物钟基因研究进展生物化学与生物物理进展2 0 0 1 ，2 8 ：1 8 1 1 8 3 。 9 m w y o u n g , s a k a y , t i m ez o n e s ：ac o m p a r a t i v eg e n e t i c so fc i r c a d i a nc l o c k s n a t r e v g e n e t 2 0 0 1 ；2 ：7 0 2 - 7 1 5 j c d u n l a p ，m o l e c u l a rb a s e sf o rc i r c a d i a nc l o c k s ，c e l l 1 9 9 9 ；9 6 ：2 7 1 - 2 9 0 1 0 k a v a k l ii h ，s a n c a ra c i r c a d i a np h o t o r e c e p t i o ni nh u m a n sa n dm i c e m o li n t e r v 2 0 0 2 ；2 ( 8 ) ： 4 8 4 9 2 1 1 n a m b uj1 ll e w i s ejo ，w h a r t o nk ae ta 1 1 9 9 1 t h ed r o s o p h i l as i n g l e m i n d e dg e n e e n c o d e sah e l i x - l o o p h e l i xp r o t e i nt h a ta c t sa sam a s t e r r e g u l a t o ro fc n sm i d l i n e d e v e l o p m e n t c e l l , 6 7 ：11 5 7 i1 6 7 1 2 婴型查兰婴主兰竺丝奎 1 2 k i n gd p ，t a k a h a s h ij s m o l e c u l a rg e n e t i c so fc i r c a d i a nr h y t h m si nm a m m a l i a n 【j 】a n n u r e vn e u r o s i c ，2 0 0 0 ，2 3 ：7 1 3 7 4 2 1 3 s h i g e y o s h i ，y ，t a g u c h i ，k ，y a m a m o t o ，s ，e la 1 l i g h t - i n d u c e dr e s e t t i n go fam a m m a l i a n c i r c a d i a nc l o c ki sa s s o c i a t e dw i t hr a p i di n d u c t i o no ft h er o p e r i t r a n s c r i p t c e l l 1 9 9 7 ，9 1 ： 1 0 4 3 1 0 5 3 1 4 l o n i n gf u , c h a n gc h il e e t h ec i r c a d i a nc l o c k ：p a c e m a k e ra n dt l n n o rs u p p r e s s o r n a t u r e 2 0 0 3m a y v o l u m e3 ：3 5 0 - 3 6 1 1 5 o i s h ikf u k u ih ，i s h i d ah r h y t h m i ce x p r e s s i o no fb m a l im r n ai sa l t e r e di nc l o c k m u t a n tm i c e ：d i f f e r e n t i a lr e g u l a t i o ni nt h es u p r a c h i a s m a t i en u c l e u sa n dp e r i p h e r a lt i s s u e s j 】 b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m a n , 2 0 0 0 ；2 6 8 ( 1 ) ：1 6 4 1 7 1 1 6 k u m el ( ，z y l k am j ，s r i r a ms ，e ta 1 m c r y1a n dm c r y 2a r ee s s e n t i a lc o m p o n e n t so ft h e n e g a t i v el i m bo f t h ec i r c a d i a nc l o c kf e e d b a c kl o o p 【j 1 c e l l ，1 9 9 9 ；9 8 ( 2 ) ：1 9 3 - 2 0 5 17 m a r t i nr e i c k , j o s e p ha ，g a r c i a , c a r o ld u d l e y , e ta 1 n p a s 2 ：a na n a l o go rc l o c k o p e r a t i v ei nt h em a m m a l i a nf o r e b r a i n s c i e n c e2 0 0 1 ；2 9 3 ：2 0 1 8 任建廷，桑建利紫外线诱导的d n a 损伤与皮肤癌的发生( 1 ) 生物学通报2 0 0 4 ，3 9 ( 1 ) ： 4 5 1 9 r o c h e t t ep j ，t h e r r i e nj p ，d r o u i n ，e ta 1 u v a i n d u c e dc y c l o b u t a n ep f r i m i d i n ed i m m e r sf o r m p r e d o m i n a n t l ya tt h y m i n e - t h y m i n ed i p y r i m i d i n e sa n dc o r r