（遗传学专业论文）黄曲霉拮抗菌筛选及有效成分分离的初步研究.pdf

中山大学硕士学位论文 黄曲霉拮抗菌筛选及有效成分分离的初步研究 专业：遗传学 硕士研究生：李洪洲 导师：贺竹梅教授 摘要 a f ( a f l a t o x i n ，a f ) 是一组主要由黄曲霉( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) 和寄生曲霉似 p a r a s i t i c u s ) 产生具有相似结构的次级代谢物，是所有真菌毒素中毒性最强的，具 有营养吸收功能干扰、器官损害、免疫功能抑制、致癌和致畸效果。a f 对农作 物的污染给人类健康和农业经济发展都带来了极大的威胁，然而，目前存在的 a f 污染控制方法都存在各种局限性。 本文鉴于黄曲霉生长环境中拮抗微生物存在具有较高可能性的思路出发，我 们从有明显黄曲霉污染的大米、花生、玉米、葵花籽等样品中分离得到了3 株拮 抗活性较高的细菌菌株l 9 、m 3 、m 4 。通过1 6 sr n a 及常规形态学鉴定，这3 株菌株都是属于伯克霍尔德属菌( b u r k h o l d e r i a ) ，但筛选菌活性鉴定结果显示3 株菌株拮抗作用方式存在很大的差异：l 9 能完全抑制黄曲霉菌株a f l a v u s n r r l 3 3 5 7 毒素的产生且具有一定的毒素降解作用，而m 3 、m 4 则表现为完全 抑制黄曲霉菌丝的生长；3 株菌活性物质都为胞外分泌型，我们的初步实验结果 分析表明l 9 、m 3 活性物质可能为小分子物质，m 4 可能为蛋白质组分。 对b u r k h o l d e r i as p m 3 菌株活性物质进一步性质和初步分离的研究结果表 明，m 3 活性物质具有很强的温度和p h 稳定性；论文探索利用有机萃取及p h 沉 淀两种方法进行了活性物质的粗提取，均达到很好效果，微量稀释法测得粗提物 黄曲霉m i c ( m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ) 值为0 10 5m g m l ，而m f c ( m i n i m u mf u n g i c i d a lc o n c e n t r a t i o n ) 值则大于3 4 m g m l ，同时抗菌广谱性及现 象观察测定显示m 3 活性物质能够很好抑制黄曲霉a f l a v u sn r r l 3 3 5 7 ，寄生 中山大学硕士学位论文 曲霉a p a r a s i t i c u s a t c c 2 3 2 1 ，构巢曲霉a n i d u l a n s a t c c 2 1 9 8 ，米曲霉 彳o r y z a ea t c c 2 3 1 2 等丝状真菌的生长，其作用机制表现为抑制孢子萌发和胞壁 生长作用，但是对酵母型真菌白色念珠菌没有作用；同时m 3 有效物质的初步分 离探索得到了纯度较高的活性物质组分，脂肽活性检测及总体实验结果说明该有 效物质是区别于已报导b u r k h o l d e r i a 属产生的主要抗菌物质的新型拮抗活性成 分。 本论文为黄曲霉生物控制的应用及进一步的生物控制中微生物相互作用机 理的研究打下了基础，也提供了良好的素材。 关键词：黄曲霉毒素，生物控制，拮抗菌筛选，伯克霍尔德菌 h 中山大学硕士学位论文 i s o l a t i o no fb a c t e r i a la n t a g o n i s t so f a s p e r g i l l u s f l a v u sa n dp r i m a r y p u r i f i c a t i o no ft h ea c t i v ec o m p o n e n t m a j o r ：g e n e t i c s n a m e ：l ih o n g z h o u s u p e r v i s o r ：p r o f h ez h u m e i a bs t r a c t a f l a t o x i n s ( a f ) a r eag r o u po fc l o s e l yr e l a t e ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e sm a i n l yp r o d u c e d b ya s p e r g i l l u sf l a v u sa n da p a r a c i t i c u s t h e ya r et h em o s tt o x i cm y c o t o x i n sw h i c h c o u l di n d u c et h ee f f e c t so fn u t r i t i o na b s o r b i n gi n t e r f e r i n g ，o r g a n i c d a m a g e ， i m m u n o l o g i cs u p p r e s s i o n , t e r a t o g e n i ca n dc a r c i n o g e n i ca g e n t s a fp o l l u t i o n so fc r o p s h a v eb r i n gg r e a tt h r e a t st ot h ed e v e l o p m e n to fa g r i c u l t u r ea n de c o n o m yh u m a nh e a l t h h o w e v e r , e x i s t e n tm e t h o d sa r ea l w a y sl i m i t e dt o c o n t r o la fp o l l u t i o n so f c r o p s t h e r e f o r e ，w eh o p et of i n dn e ww a y t os o l v et h e s ep r o b l e m s a c c o r d i n gt o t h et h o u g h tt h a t i ti se l e v a t e d p o s s i b i l i t yt o i s o l a t eb i o c o n t r o l m i c r o o r g a n i s mf r o mt h ee n v i r o n m e n to fa s p e r g i l l u sg r o w t h ，w es c r e e n e do u tt h r e e b a c t e r i al 9 、m 3 、m 4 谢t l lm g hr e s i s t a n ta c t i v i t ya g a i n s ta fp r o d u c t i o nf r o mv i s i b l e a s p e r g i l l u sp o l l u t i o nm a t e r i a l so ff i c e ，p e a n u t , m a i z ea n ds u n f l o w e r s e e d s a l lo ft h e t h r e eb a c t e r i ab e l o n gt ob u r k h o l d e r i aa c c o r d i n g ，b u tt h e ys h o w e dg r e a td i f f e r e n to n t h em o d ea n dm e c h a n i s mo fa c t i o n l 9i n h i b i t e da fs y n t h e s i so fa f l a v u sn r r l 3 3 5 7c o m p l e t e l ya n dh a ds o m ee f f e c to na fd e g r a d a t i o n m 3a n dm 4p r e s e n t e df u l l y i n h i b i t i o no nt h em y c e l i u mg r o w t h a l lt h ea c t i v ec o m p o n e n t so fl 9 、m 3 、m 4w e r e e x t r a c e l l u l a r t h er e s u l t so ft e m p e r a t u r ea n d ( n h 4 ) 2 s 0 4t r e a t m e n ts h o w e dt h a ta c t i v e c o m p o n e n t so fl 9a n dm 3w e r es m a l l - m o l e c u l a rc o m p o u n d sa n dm 4w a sb e l o n gt o p r o t e i n f u r t h e rs t u d i e so nt h ec h a r a c t e r i z a t i o na n d p r i m a r yp u r i f i c a t i o n r e s u l t so f b u r k h o l d e r i as p m 3a c t i v ec o m p o n e n th a v es h o w nt h a tt h ea c t i v ec o m p o n e n th a s i i i 中山大学硕士学位论文 s t a b i l i t yt ot h et e m p e r a t u r ea n dt h ep h m o r e o v e r , w eo b t a i n e dp r i m a r ye x t r a c t i o n u s i n go r g a n i c s o l v e n td i s t i l l a t i o na n d p hp r e c i p i t a t i o n m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( m i c ) a n dm i n i m u mf u n g i c i d a lc o n c e n t r a t i o n ( m f c ) a g a i n s ta f l a v u s n r r l 一3 3 5 7o ft h ec r u d ee x t r a c tw e r ed e t e c t e dt ob e0 10 5m g m la n do v e r 3 4 m g m l ，r e s p e c t i v e l y t h ea c t i v ec o m p o n e n ta l s oc o u l di n h i b i ts p o r eg e r m i n a t i o n a n dc e l l - w a l lg r o w t ho fo t h e rf i l a m e n t o u sf u n g i ，s u c ha sa p a r a s i t i c u sa t c c - 2 3 21 ， a n i d u l a n sa t c c 一219 8 ，a o r y z a ea t c c 2 312 ，b u tn o tf o rc a n d i d a a l b i c a n s ( y e a s t t y p ef u n g i ) a f t e r w a r d sl i p o p e p t i d ec h a r a c t e r sw e r ea l s od e t e c t e df o rm 3a n d w ef o u n dt h a ta c t i v ec o m p o n e n to fm 3i san o v e lc o m p o u n da m o n gt h es u b s t a n c e s p r o d u c e db yb u r k h o l d e r i a t h i sa r t i c l el a yas o l i df o u n d a t i o na n da l s op r o v i d ea p p r o p r i a t em a t e r i a l sf o r 蛐e r r e s e a r c ho ft h ea fb i o c o n t r o la n dt h em i c r o o r g a n i s mi n t e r a c t i o nm e c h a n i s m sa m o n g t h e m k e yw o r d s ：a f l a t o x i n s ，b i o c o n t r o l ，i s o l a t i o no f b a c t e r i a la n t a g o n i s t s , b u r k h o l d e r i a i v 中山大学硕士学位论文 缩略词表 蛏 a f b l c c f d m s o d o n e d l a l a b m i c m f c o d p d a p d b p p m p e g r p m s d s t l c a f l a t o x i n a f l a t o x i nb1 c e l l f r e ec u l t u r ef i l t r a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y n i v a l e n o l a f a f b i 去菌体过滤培养液 二甲基亚砜 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 l a c t i ca c i db a c t e r i a 乳酸菌 m i n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n 最小抑菌浓度 m i n i m u mf u n g i c i d a lc o n c e n t r a t i o n最小杀菌浓度 o p t i c a ld e n s i t y p o t a t od e x t r o s ea g a r p o t a t od e x t r o s eb r o t h p a r tp e rm i l l i o n p l y e t h y l e n eg l y c o l r o u n dp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 光密度值 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 马铃薯葡萄糖液体培养基 百万分子一 聚乙二醇 每分钟转速 十二烷基硫酸钠 薄层色谱法 中山大学硕士学位论文 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已注明应用的内容外，本论文不 包括其他任何个人或集体已发表或撰写过的作品成果。对本论文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：夕知研 一 日期： 佣谭多月9 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它方法保存学位论文。 保密论文保密期满后适用本申明。 学位论文作者签名：孝移哪 导师签名：溯 日期：y l 哞6 月f 日 中山大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 黄曲霉毒素的污染及危害 真菌毒素( m y c o t o x i n s ) 是一类由丝状真菌产生的有毒次生代谢产物，现已 被鉴定的超过3 0 0 余种，主要由曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、镰 刀菌属( f u s a r i u m ) 产生，人们在很早以前就已经对真菌毒素有了一定的认识 ( f o r g a c se t a l ，1 9 6 2 ) ，但是直至1 j 1 9 6 0 年从霉变花生饼粉中分离得到黄曲霉毒 素( a f l a t o x i n ，a f ) ，该毒素导致英国超过1 0 万只火鸡死亡，真菌毒素才开始被 作为严重威胁人类和饲养动物健康的因素得到广泛重视( h a n se ta 1 ，2 0 0 7 ) ， 并在毒素的产生条件、生理代谢途径、结构毒性、毒素的合成途径与基因调控及 检测方法等领域进行了广泛的研究。针对真菌毒素的危害，现已有超过1 0 0 个国 家通过法规对粮食制品中真菌毒素的含量作了限量要求，据联合国粮农组织 ( f o o da n da g r i c u l t u r a lo r g a n i z a t i o n ，f a o ) 统计，全球每年约有2 5 的农产品 受到真菌毒素的污染，同时约有2 的农产品由于污染严重而失去营养和经济价 值，造成数千亿的损失( s c h a t z m a y re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 a f 主要由黄曲霉( 么f l a v u s ) 和寄生曲霉( a p a r a s i t i c u s ) 产生，包括a f b i 、 a f b 2 、a f g l 和a f g 2 等至少1 8 种具有二氢呋喃香豆素结构的衍生物，其中a f b i 毒性最强，分布也最为广泛，a f 在2 6 0 以上才能分解( d o m e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 a f 是所有真菌毒素中毒性最强的，具有营养吸收功能干扰、器官损害、免疫功 能抑制、致癌和致畸效果，1 9 9 3 年被国际癌症研究机构( i n t e r n a t i o n a la g e n c yf o r r e s e a r c ho nc a n c e r ，i a r c ) 列为i 级肝癌物( i a r c ，2 0 0 2 ) 。a f 的限量标准相 当严格，如与常见真菌毒素单端孢霉烯族毒素( d o n ) 相比较，美国、欧盟、 中国的a f 限量分别为1 5 、4 、2 0p p b ( p g k g ) ，而d o n 限量为4 0 0 0 、2 0 0 - 1 7 5 0 、 1 0 0 0p p b ( h a n se la 1 ，2 0 0 7 ) 。由于a f 的高毒性，至少8 0 的真菌毒素污染损 失都是由a f 造成的，现对于真菌毒素的研究也都主要集中在a f ( h a n se t a l ， 中山大学硕士学位论文 2 0 0 7 ) ，它已成为一个研究真菌毒素的分子模型。 黄曲霉及寄生曲霉等相关a f 产生菌株，在6 - 4 2 都能够很好的生长，极易 污染花生、玉米、大豆、大米、小麦、高粱等谷物，也会在木薯、胡椒及坚果类 如杏仁、胡桃等产品上生长，在2 4 , - 3 5 达到最适产毒温度，含水量在7 以上 将会使得产毒量剧增，所以一般农产品在收获前就已经受到了产毒菌株的污染， 而主要的a f 是在贮藏过程中产生的o o n a t h a n ，2 0 0 4 ) 。m a n j u n a 等人对坦桑尼亚 ( t a n z a n i a ) 和刚果( c o n g o ) 市场上的甘薯和玉米样品进行了a f 的检测调查， 甘薯中a f 的含量平均在o 3 4 4p p b 之间，贮存超过4 个月的平均含量上升至 o 4 1 3 0p p b ，说明随着贮存时间的延长a f 含量会有显著的增高( m a n j u n ae ta 1 ， 2 0 0 9 ) 。其中农产品收获前污染程度受到农作物基因差异、干旱、土壤情况、害 虫感染等因素的影响，由于这些因素难以调控，采收前对a f 的控制存在很大的 困难，同时将产品贮存前干燥至标准程度，也会由于贮存过程中生物呼吸作用及 局部聚集作用等导致含水量的变化从而扩大a f 的污染程度( j o n a t h a ne ta l ， 2 0 0 4 ) ，所以对于农产品生产流程、干燥贮存条件方面因素的调节并不能显著防 止a f 的产生，解决农产品中a f 的污染问题关键也是现在研究的热点在于探索其 它有效的方法直接去除a f 和在一般生长环境下抑制a f 的产生。 我国与众多发展中国家一样，由于农业生产、食品管理体系的欠缺，a f 污 一 染极为严重，给国民的食品安全带来了隐患，w a n g 等对国内六个省份的不同粮 食产品进行了抽样调查，结果高达7 0 2 7 的玉米中检测出a f ，平均浓度为2 7 4 4 p p b ，最高浓度10 9 8 3 6p p b ， 远远高于f d a 标准2 0p p b ，花生中a f 检出率也有 2 3 0 8 ，最高含量2 8 0 9p p b ( w a n ga n dl i u ，2 0 0 7 ) ；百奥明饲料添加剂( 上海) 有限公司对收集来自全国各地的1 7 4 份饲料原料样品进行霉菌毒素污染情况普 查，其中a f b l 的阳性检出率为2 5 o ，最高值达2 1 8p p b ；本实验室对部分食 品和饲料中a f 污染情况的检测发现，鲜虾虾肉样品中a f b l 的阳性检出率为6 5 7 ， 其中5 1 4 超出了欧盟安全限量范围( 2p p b ) ；虾肝样品中a f b l 的阳性检出率为 1 0 0 ；猪肝样品中的阳性检出率为7 3 3 。饲料污染率更是惊人，在所检测的2 4 份水产饲料中阳性检出率为1 0 0 ，最高达1 2 0p p b ( 王琼，2 0 0 9 ) 。 a f 的污染对于人类健康和经济都带来了严重的威胁，对于有效控制方法的 开发迫在眉睫。 2 中山大学硕士学位论文 1 2a f 控制方法研究进展 1 2 1 传统物理化学方法去除黄曲霉毒素 传统的a f 物理化学去除方法包括分离去除和降解两个方面：( 1 ) 分离去除 a f ，包括机械法淘洗、密度分离去除含有a f 的霉变原料或黄曲霉菌丝；有机试 剂浸提去除a f 等；添加吸附剂如硅酸铝盐、活性炭、皂土等吸附去除a f 。( 2 ) 降解产品中a f ，采用高温、辐射、超声波、紫外、碱处理、氧化降解( 常用氧 化试剂有次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、醛及氯气等) 等。虽然以上方法在a f 的 脱毒中有一定作用，但每种方法的作用效果表现很大的差异，且都有各自的局限 性。 机械法和有机试剂的提取具有能耗和劳动强度大的缺点，其中有机试剂的提 取还能够对食物及相关产品的营养成分造成极大的破坏，且只能应用于少数物性 的物料，最主要的是容易导致二次污染。 添加吸附剂是物理化学方法中存在缺陷最少的，现主要应用于饲料行业，但 是虽然吸附剂能够在实验条件下达到很好的吸附a f 的作用，却不能完全去除毒 性，有研究表明高岭土t m 在实验条件下能够达到1 9 2 6m g a f gt m 的吸收能 力，而在饲料中添加比例达到2 5m ga f 5 0gt m 才能够预防a f 对小鼠的毒性 ( s a m i r ，2 0 0 8 ) ，d u a r t e 等在奶牛饲料中添加斑脱土( a b 2 0 、f g 、m s ) ，甘露 聚糖m t b 1 0 0 等吸附剂达到去除a f 剂量的情况下，产奶中毒素降低率分别为 6 1 、6 5 、5 0 、5 9 ( d u a r t ee t a l ，2 0 0 4 ) ，同时吸附剂还可能由于吸附作 用降低产品中营养物质的利用率。 高温、辐射、超声波、紫外法去除a f 除了具有能耗高的特点外，还容易导 致贮存样品中微生物菌群的改变以及局部温湿度变化造成产毒菌株新的毒素产 生，不能彻底去除毒素( i s m a i le ta l ，1 9 9 7 ) 。 碱法处理对于产品的色、香、昧等感官特性具有很大的影响，处理后产品会 产生不理想的棕色调，并且其中营养氮的含量将显著降低，部分氨基酸如胱氨酸、 甲硫氨酸特别是赖氨酸成分会被降解( p i v a ie ta l ，1 9 9 5 ) 。氧化法主要是利用 物质的强氧化性对a f 进行降解，处理效果不稳定，同样对于产品的感官特性以 及营养成分具有破坏效果，能导致维生素等主要营养成分的流失。 中山大学硕士学位论文 f a o 在1 9 7 7 年会议讨论中就已经提出，有效的a f 去毒方法应该满足以下 几点要求( p i v a ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ：1 ) 能够分离毒素、破坏或将毒素转化为无毒化 合物，不能引入新的有害、毒性及致癌物质；2 ) 不能破坏其中主要营养成分：3 ) 真菌孢子和菌丝体应该被破坏，防止新的毒素的产生。b a t a 等人又在此基础上进 行了进一步的归纳，提出除营养成分外有效去毒方法还应该最大限度保持产品的 物性及风味，同时最主要的，去毒加工应经济可行( b a t ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 从以上分析可以看出传统的物理化学去毒方法都存在不同的缺陷，不能满足 有效a f 去除方法的要求，给实际生产应用带来了局限性，因此，高效、节能、 无害的生物控制方法与技术的探索已成为目前a f 控制研究的主流。 1 2 2 黄曲霉毒素生物控制与生物转化方法研究进展 生物控制与生物转化主要是利用微生物及其酶的作用降解a f 或利用生物间 的拮抗作用直接或间接降低毒素的合成量或利用粘附作用去除a f ，进而减少a f 污染。不同微生物作用的机理各异且都较为复杂，目前，按其作用机理可以概括 为以下几类： 1 2 2 1 直接去除黄曲霉毒素 微生物对于a f 的去除作用可以表现在物理吸附和代谢降解两个方面，不同 的细菌具有不同作用方式，甚至同时具有两种作用方式。 乳酸菌l a b ，是一类发酵糖类产生乳酸的无芽孢革兰氏阳性菌的统称，在对 a f 的吸附应用中研究最广，最开始被发现能够降低发酵- 孚t , n 品中a f 含量，随后 人们对于不同种属不同l a b 菌株进行了一系列的筛选工作，发现很多的菌株都具 有a f 吸附能力，对a f 的吸附效率可以达到9 0 以上，但是不同菌株问存在较大 差异( e 1 - n e z a m ie ta 1 ，1 9 9 8 ；l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ；h w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ；m e n d o z ae t a 1 ，2 0 0 9 ) n a g e n d r a 等研究双歧杆菌与乳杆菌对a f b l 吸附能力的结果结果表明，其解 毒机理是吸附作用而非降解作用，菌体与a f 主要是通过与菌体细胞壁结构有关 的非共价方式结合( n a g e n d r ae la 1 ，1 9 9 9 ) ；h a s k a r d 等的研究进一步表明疏水 作用在乳酸菌对a f b l 的吸附中起主要作用，离子效应及氢键吸附则与吸附作用 4 中山大学硕士学位论文 相关性不大( h a s k a r de ta 1 ，2 0 0 0 ) ，说明胞壁结构与成分是吸附效果差异的关 键，且吸附作用具有可逆性。对于乳酸菌的研究进一步发现除了吸附作用外，许 多菌株对a f 的代谢降解亦有定的作用，m e g a l i a 等发现接种了乳酸乳球菌的发 酵液中a f b l 能够被转化为b 2 a 和粕两种形式，其q b b 2 a 为无毒的( m e g a l i ae ta 1 ， 1 9 8 4 ) ：l i n e 等使用1 4 c 标记的a f b i 接种橙色黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ma u r a n t i a c u m ) 培养，发现活细胞及死细胞均能够吸附a f b l ，但活细胞的吸附作用远大于死细 胞的吸附作用，并且只有活细胞释放了被标记了的c 0 2 ，这表明一定量的a f b l 被菌体细胞所代谢( l i n ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 除了乳酸菌外，研究人员也筛选到了许多其它具有a f 吸附或降解作用的细 菌和真菌菌株。对于细菌菌株，h o r m i s c h 等报道从多环芳香烃化合物( p a h ) 污 染的土壤中分离出菌株m y c o b a c t e r i u m f l u o r a n t h e n i v o r a n s 能降解a f b i ，在a f b l 初始浓度2 5p p m 的培养集中接a d 4 y c o b a c t e r i u m f l u o r a n t h e n i v o r a n s 培养3 6h 能达 到6 0 至7 0 的降解率，培养7 2h 条件下则检测不到a f b l 的存在( h o r m i s c he ta 1 ， 2 0 0 4 ) ；t e n i o l a 等也从相同的土壤环境中分离得至l j - f m y c o b a c t e r i u m 1 u o r a n t h e n i v o r a n s ，红平红球菌r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l & 菌株能够降解a f b l ( t e n i o l ae ta 1 ，2 0 0 5 ) ，该研究小组在对红平红球菌r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 进 一步研究中发现，其胞外粗提液与a f b l 作用7 2 h 后去除率可达6 6 8 ，而在红平 红球菌细胞存在的情况下，7 2 h 后a f b l 只有3 6 的残留，证明吸附和降解两种 作用方式均存在( a l b e a se ta 1 ，2 0 0 6 ) ；t o p c u 等研究表明人类肠道菌株 e n t e r o c o c c u s f a e c i u m 也有a f 去毒作用，去毒效率在1 9 3 4 5 3 ，表现为吸附作 用( t o p c u e ta 1 ，2 0 1 0 ) 。同时许多真菌微生物也具有a f 降解作用，s h a t h a 等对 不同真菌菌株进行了a f b l 降解效果分析发现试验菌株中p h o m as p ，毛霉菌 m u c o rs p ， 木霉菌t r i c h o d e r m a 踱及侧孢霉s p o r o t r i c h u ms p 都具有一定降解效 果，其中p h o m as p 的无细胞提取液对5 0u # l o om l 的a f b l 在培养时间为9 6h 时达 到9 0 ( s h a t h ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ，其它表现为毒素降解的真菌还有t i h n o c a r d i a c o r y n e b a c t e r i o i d e s 、假密环菌、假丝酵母菌、黑曲霉、寄生曲霉等( c i e g l e re l a l ， 1 9 9 6 ； s h e t t ye ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 在生物代谢a f 的机理研究中，人们发现许多菌株效果都与酶作用相关。从 橙色黄杆菌提出的粗蛋白可以降解7 4 1 的a f b l ，蛋白酶k 处理后a f b l 降解率 中山大学硕士学位论文 降低为3 4 5 ，而热处理失活粗蛋白只能降解5 5 的a f b l ，这表明该粗蛋白对 a f 的降解机理可能是酶促反应，进一步研究结果得出粗蛋白用d n a s ei 处理后可 以降解8 0 5 的a f b l ，这表明这种菌对a f 的解毒并非由于与细菌d n a 的非特异 性结合( l i n ee t a l ，1 9 9 4 ) s m i l e ) , e t a ，2 0 0 0 ) ) 上面介绍的a l b e r t s 等在红平红 球菌降解a f 的研究中，也发现活性成分的蛋白酶降解及s d s 变性能够降低a f 的 降解活性，可以推测红球菌对a f 的降解是酶解反应( a l b e r t se ta 1 ，2 0 0 6 ) ；t e n i o l a 等的研究结果除了分离得到了能够降解a f 的m y c o b a c t e r i u m f l u o r a n t h e n i v o r a n s ， 红平红球菌r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 菌株，对菌株降解机制的研究发现红平红球 菌和m l u o r a n t h e n i v o r a n sn o v d s m 4 4 5 5 6 菌的胞外提出物在3 0 分别与a f b l 混 合8 h 后基本检测不到a f b l 残留，对胞外提取物在热处理和蛋白酶k 处理后发现 降解率降低了，他们认为解毒机理是酶促反应( t e n i o l ae la 1 ，2 0 0 5 ) 。 对于这些a f 降解相关酶的分离纯化及深入机理研究也有了一些初步的结 果，m a r i s a 等研究发现糙皮侧耳菌a f 降解活性为酶成分，最适活性温度p h 分别 为2 5 和4 - 5 ，s d s p a g e 分析显示该酶活性成分分子量大小为9 0k d a ( m a r i s ae t a 1 ，2 0 0 3 ) ；l i u 等对假密环菌e 2 0 中的a f 降解酶成分进行了分离及性质研究， 结果显示该酶分子量大小5 1 8k d a ，最适活性温度和p h 值分别为2 8 ( 2 和6 ( l i ue t a 1 ，2 0 0 0 ) 。虽然有很多的工作已经证实微生物降解活性与酶促反应具有很大的 相关性，对于各种酶的分子量及最适作用条件等初步性质也做了相应的探索，但 是对于酶结构及作用机理等方面的研究还很缺乏。现已研究相对成熟的，过氧化 物酶进行酶促反应催化氢过氧化物的分解从而产生自由基，这些自由基会与a f 发生反应达到降解效果( d o y l ee ta 1 ，1 9 7 8 ：d a se ta 1 ，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ) ；白腐菌 产生的漆虫酶能够在lu m l 的浓度下对寄生曲霉生长过程中产生的a f b l 达到 8 7 3 4 的降解率，但是具体的降解机制仍不是很清楚( a l b e r te ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 通过以上的分析可以看出，微生物的a f 吸附及降解作用在实验条件下对于 a f 的控制具有很好的效果，其中微生物酶降解控制a f 的应用已取得了一定的进 展，但是对于特别是降解作用成分分析及机理研究还不够深入，给实际大规模应 用带来了障碍；同时研究也注意到，某些通常认为是安全的微生物可能在霉菌毒 素存在条件下产生某些有毒代谢产物，一些菌株甚至在条件改变的情况下可能产 生a f b l ，因此需要对使用的微生物重新进行安全性评价。 6 中山大学硕士学位论文 1 2 2 2 拮抗抑制黄曲霉菌丝的生长从而降低黄曲霉毒素的合成 拮抗抑制主要表现在生物竞争以及分泌活性因子抑制菌丝生长两个方面，同 时两个方面存在相互作用及相互诱导的关系。 生物竞争抑制是通过对生长空间、营养成分的竞争产生优势生长，以非产毒 微生物取代产毒菌株达到a f 控制目的的方法。c o t t y 等首先对非产毒菌株在玉米 中a f 含量控制效果进行了研究( b r o w ne ta 1 ，1 9 9 1 ) ，随后对利用筛选得到的7 株非产毒黄曲霉菌拮抗抑制产毒黄曲霉菌来降低棉籽中a f 的含量进行了研究， 其中6 株表现明显效果，a f 3 6 先接种到棉籽中培养2 4h 后再接入产毒菌株，最终 检测a f 含量，对a f 的控制抑制达到9 0 以上( c o t t ye ta 1 ，1 9 9 4 ) ，其中效果最 为显著的菌株a f 3 6 先后被美国及澳大利亚等应用于棉花、玉米等农作物的a f 控 制，也是生物控制方法在a f 控制方面大规模成功应用的首例。非产毒黄曲霉菌 控制a f 含量应用效果与作用对象特性如水分及油脂含量、接入时间、培养条件 有很大的关系( y i n e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 d o m e r 等通过紫外诱变从植物来源的寄生曲霉中得到了a f i 非产毒突变株， 通过平板混合培养进行了生长能力及产毒抑制的检测，发现各突变菌株之间存在 显著差异( d o m e re ta 1 ，2 0 0 0 ) ；以此为基础利用分离得到的非产毒寄生曲霉菌 株n r r l 2 1 3 6 9 进行了花生田间及储存过程中a f 控制应用的研究，试验期间干旱 条件使得a f 含量远高于正常水平，其中田间处理后的花生中a f 平均含量5 4 1 p p b ，未处理组则为5 1 6 8b b p ，达到了9 5 9 的抑制率，储存后含量分别为9 1 4 5 1 p p b 和3 7 4 2p p b ( d o m e r e ta 1 ，2 0 0 2 ) 与c o 斜非产毒株优先接种效果相比较， c h a n g 等研究y n o r b c y p a 基因缺失非产毒突变体t x 9 8 的竞争抑制活性，共同接 种情况非产毒株和产毒株1 ：l l ：1 0 的接种比例都能够很好抑n a f 的产生，产 毒株先培养2 4h 后再接入非产毒菌a f 含量为对照组的2 1 0 倍，其中抑制效果与产 毒株本身差异存在很大的关联，1 ：l 接种比例下砌f l a v u sc a 4 3 抑制效果是c a 2 8 的1 0 倍( c h a n g e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 前期研究发现非常产毒菌株的产毒能力丢失主要与a f 合成代谢途径相关 基因功能缺失有关。e h r l i c h 等发现a f 3 6 是由于a f 合成相关基因( 聚酮合成酶基 因) 的点突变造成了a f 不能合成( e h r l i c he ta 1 ，2 0 0 4 ) ；c h a n g 等利用突变筛选 非产毒黄曲霉菌株，对获得的3 8 株非产毒株序列分析结果显示在a f 合成相关基 7 中山大学硕士学位论文 因上有6 个不同的片段缺失( c h a n ge t a l ，2 0 0 5 ) ，但是现也有研究发现突变非 产毒菌株有3 6 5 是没有基因片段缺失的，说明产度能力丢失除了基因缺失外还 有其它影响因素，可以在转录前或蛋白质水平进行进一步的研究( c r i s e oe t a l ， 2 0 0 8 ) 。 此外，其他菌株也对能够通过对产毒黄曲霉菌丝的生长抑制来降低产品中 a f 的含量。利用b a c i l l u sm e g a t e r i u m 菌株l 1 0 9c f u 浓度培养液洗涤花生壳样 品，能使得黄曲霉感染率降低4 1 6 7 0 社2 8 9 ( k o n ge t a l ，2 0 1 0 ) ；h u a 等发现 酵母菌株c a n d i d ak r u s e i 和p i c h i aa n o m a l a 能够抑制食品中黄曲霉菌丝的生长同 时降低a f 含量( h u ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ：e t c h e v e r r y 等从选取的菌株中分离发现 b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s 具有很强的黄曲霉菌丝抑制活性，能很好的降低玉米粉 中黄曲霉菌落含量( e t c h e v e r r ye ta 1 ，2 0 0 9 ) ；j e f f r e y 等从杏仁的花和果实中分 离细菌菌株，通过平板扩散法进行了黄曲霉菌丝抑制菌株的筛选，b a c i l l u s ， p s e u d o m o n a s ，r a l s t o n i a 和b u r k h o l d e r i a 属的不同细菌菌株都表现了抑制活性， 表现为非接触抑制( j e f f r e ye ta 1 ，2 0 0 6 ) ；s t r e p t o m y c e ss p a s b v - 1 抑制寄生曲 霉8 5 孢子萌发，对应的a f 降低率为6 3 0 0 - 9 8 ，推测该菌株能够通过抑制孢 子萌发减少菌株含量降低a f 的合成( z u c c h ie ta 1 ，2 0 0 8 ) ；l a c t o b a c i l l u sc a s e ic r l 4 3 1 和l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sc r l1 2 2 4 菌株在3 7 与黄曲霉共培养7 天，对 黄曲霉菌丝的生长抑制率分别为7 3 和8 5 ，培养后未检测到a f 的产生( b u e n o e ta 1 ，2 0 0 6 ) ；r e d d y 等将假单胞杆菌p s e u d o m o n a s f u o r e s c e n s ，绿霉菌t r i c h o d e r m a v i r e n s 和短小杆菌b a c i l l u ss u b t i l i s 等菌株培养物接种到贮存谷物中，在2 5m l k g 浓度下对黄曲霉菌丝抑制率6 8 0 0 - - - 9 3 ，对应a