（生物医学工程专业论文）诊断型DNA芯片的新技术.pdf

摘要 样镐( r r o e 平if l i c h 7 ) 的非标记检测，特异性杂交的荧光强度l ：l t t 特异杂交的背景荧光强度 高5 倍。同时，它还具有制作简单、灵敏度好以及检测时间短的优点。 4 提山了t a q m a n 探针微阵列用于d n a 靶序列的高通量、非标记、定量检测。设计了3 条 氢基修饰的t a q m a n 探针。这种t a q m a n 探针包括三个部分：( 1 ) 5 末端的二甲基氮基 叠氮苯一苯甲酸( d a b c y l ) 做为淬灭基团：( 2 ) 饪丁中间的荧光素( f a m ) 标记的荧光报告分 子；( 3 ) 多聚胸腺嘧啶的p o l y ( t ) 2 0 作为手臂分子以及一个3 末端的氨基用于例定。制备 了直接同定在醛基修饰的玻璃片的t a q m a n 探针微阵列芯片。当靶序列存在时，d n a 聚 合酶的5 核酶活性使探针上的猝灭分子被切除，嗣定在基片上的荧光得以恢复。多聚胸腙 嘧啶p o l y ( t k 作为手臂分子用以改善反应速率及信号产生。研究了氮基化的t a q m a n 探 针的猝灭效率、词相t a q m a n 试验的特异性。结果表明，t a q m a n 探针微阵列能够同时 定量、非标记检测多个特异性d n a 靶序列，其反应前后的荧光增量可达2 倍，而且由于 不需要p c r 扩增的厉处理大大缩短了检测时闻。 5 报道了一种新的基因拷贝数变化的检测方法一基于微阵列芯片的多重可扩增探针杂交技 术。根据所检测的d n a 序列，制备若干具有通用引物的p c r 产物作为可扩增探针组 与固定在尼龙膜上待测的基因组d n a 杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针，经生物素标 记的通用引物扩增后，与相应的d n a 芯片杂交。该特异性的d n a 芯片包括1 0 个抗肌营 养不良基因的外显子探针和1 个阴性、1 个阳性探针。杂交清冼后，用s t r e p t a v i d i n - c y 3 染色，再经芯片扫描仪扫描得到杂交的荧光图像。分析荧光信号的强度差异给出特定基 因片断拷贝数的变化。该方法用微阵列技术代替m a p h 中的电泳检测技术，可大幅度增 加检测的通量。本文选择1 个正常男性、1 个正常女性和1 个肌营养不良症患者的x 染 色体上的d m d 基因来进行验证。结果表明，该方法能够同时检测抗肌营养不良基因多个 外显子中的基因片断拷贝数变化。这也可以应用于其它遗传性疾病及其携带者的诊断。 v 一 查堕查兰塑! ：兰竺堡苎 a b s t r a c t d n a c h i pi se m e r g i n gt e c h n o l o g yi nb i o l o g i c a ls c i e n c ea n dm e d i c a lr e s e a r c hf i e l d s a n dad i a g n o s t i cd n ac h i pi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta s p e c t so f m i c r o a r r a y a p p l i c a t i o n sb e c a u s eo fi t su n i q u ea d v a n t a g e so fh i g ht h r o u g h p u td i s e a s ed e t e c t i o n ， r e q u i r e m e n to fs m a l la m o u n t so fs a m p l ea n da u t o m a t i o n ，e t c d i a g n o s t i cm i c r o c h i p sf o rf i e l di d e n t i f i c a t i o na n dc l i n i c a la p p l i c a t i o na r es t i l li ni t s i n f a n c ya n dm a n ya r ei nt h el a b o r a t o r i a ls t a g e s a l t h o u g ht h e r ea r em a n yr e p o r t sa b o u t t h i sp o i n t t h e r es t i l li sag o o dp r o s p e c tf o ra s i m p l e 。p o r t a b l e ，r e a l - t i m e ，s e n s i t i v e ， r e s p o n s i b l ea n ds p e c i a ld i a g n o s t i cm i c r o c h i p sa n da p p a r a t u si nt h em a r k e t t om e e tt h e s er e q u i r e m e n t s 。f i v en e w t e c h n o l o g yp l a t f o r m st oi m p r o v ep r e p a r a t i o n a n dl a b e l i n go ft a r g e ts a m p l e 。d e t e c t i o nm e t h o do fh y b d do nc h i p sa n de x p e d m e n t a l c o n d i t i o n sh a v eb e e np r o p o s e da n ds t u d i e di nt h i st h e s i s ，w h i c hi n c l u d et h ef e i l o w i n g a s p e c t s ：1 ) i n c o r p o r a t i o nl a b e l i n go fb i o t i n l a b e l e dn u c l e o t i d ea n a l o g sa n ds t a i n i n g m e t h o dw i t hs t r e p t a v i d i nc o n j u g a t e dc y 3 ；2 ) t y r a m i d es i g n a la m p l i f i c a t i o n ，n a n o g o l d l a b e l i n ga n ds i i v e re n h a n c e m e n tf o rac o l o r m e t r i cm i c r o a r r a ya s s a y ；3 ) m o l e c u l a rb e a c o n a r r a y sf o rl a b e l f r e ed e t e c t i n gt h ev i r u l e n c ef a c t o r so fs p e c i f i ce s c h e # c h i ac o i ls e r o t y d e 0 15 7 ：h 7 ；4 ) t a q m a np r o b ea r r a y sf o rq u n a t i t a t i v e l yd e t e c t i n gt h eu n l a b e l e dd n a t a r g e t s b ys o l i dp h a s e5 n u c l e a s ep c ra s s a y ；5 ) an o v e im i c r o a r r a y b a s e dm u l t i p l e xa m p l i f l a b l e p r o b eh y b r i d i z a t i o nt e c h n o l o g yf o rd e t e c t i o no fg e n ec o p yn u m b e rc h a n g e si nt o t a l 9 e n o m e a nt h es t u d i e sa r eb a s e do nt w ob i o l o g i c a ld e t e c t i o ns y s t e m s a ne s c h e r i c h a c o i ls e r o t y p e0 15 7 ：h 7a n dah u m a nd u c h e n em u s c u l a rd y s t r o p h y t h em a i nc o n t r i b u t i o n so ft h i st h e s i sa r ed e s c r i b e da sf e b o w s a no l i g o n u c l e o t i d ea r r a yc o m p o s e do fa m i n e m o d i f i e do i k i o n u c l e o 珏d ep r o b e s c o m p l e m e n t a r yt os e v e ne c e i lg e n el o c i ，i n c l u d i n gu i d a ，讯) e ，n i c h 7 ，i n “m i n 。 s h i g a l i k et o x i n s fa n di i a n dh e m o l y s i nw a sf a b d c a t e do ng l a s ss l i d e t h e b i o t i n y l a t e dd n at a r g e t sw e r ep r e p a r e d b yd i r e c ti n c o r p o r a t i o no fb i o t i n - l a b e l e d n u c l e o t i d ea n a l o g si ns i n g l et u b ed u r i n ga no p t i m a lm u l t i p l e xp c rr e a c t i o n t h e b i o t i n y l a t e dd n at a r g e t sw e r et h e nh y b r i d i z e dw i t ht h eo l i g o n u c l e o t i d ea r r a ya n d s t a i n e dw i t hs t r e p t a v i d i nc o n j u g a t e dc y 3 t h er e s u l t si n d i c a t et h a tf o u rv a r i o u s s e r o t y p e so fe c o i li n c l u d i n gn o r m a ie c o i l ( a t c c2 5 9 2 2 ) ，e c o i l0 1 ：h 7 ( u 5 4 1 ) ， e c o i l0 1 5 7 ：h 1 9 ( a 2 ) a n de c o i l0 1 5 7 ：h 7 ( 8 8 2 3 6 4 ) s t r a i n sw e r es u c c e s s f u l l y i d e n t i f i e d b yo u ro l i g o n u c l e o t i o d ea r r a y i nt h i sl a b e l i n gm e t h o d ，al e s sb u l k y b i o t i n - l a b e l e dn u c l e o t i d ew a su s e dt or e p l a c eab u l k yf l u o r o p h o r e - l a b e l e d n u d e o t l d ef o ri n c o r p o r a t i n gd i r e c t l yi n t od n at a 呜e t s a n di tp r o v i d e du n b i a s e d ， m o r ee f f i c i e n ti n c o r p o r a t i o na n dt h e ni n c r e a s e df l u o r e s c e n ts i g n a li n t e n s i t i e sa n d f u r t h e ri m p r o v e di t s 他i 诘b n 耐a n ds e n s i t i v i t yf o rd e t e c t i n ga n di d e n u f y i n gb a c t e d a l p a t h o g e n s v i 摘要 2 ac o l o r i m e t r j cd n a m i c r o a r r a yw i t has e r i e so fs i g n a la m p l i f i c a t i o ns y s t e mi n c l u d i n g t y r a m i d es i g n a la m p l i f i c a t i o n ，n a n o g o l dp a r t i c l e sl a b e l i n ga n ds i l v e re n h a n c e m e n t w a si n v e s t i g a t e df o rd e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fi n f e c t i o u sp a t h o g e n i ce c o l i 0 1 5 7 ：h 7 i nt h i sm e t h o d b i o t i n y l a t e dd n at a r g e t sw e r eb o u n dw i t hap r o b eo n m i c r o a r r a yv i ah y b r i d i z a t i o na n dw e r ef u r t h e rd e t e c t e dw i t ha nh r p l a b e l e d s t r e p t a v i d i nc o n j u g a t e w h e nh 2 0 2w a sp r e s e n t m u l t i p l ec o p i e s o fa t y r a m i d e c o n j u g a t e dg o l dp a r t i c l e w e r ea c t i v a t e d b yt h ec a t a l y t i ca c t i v i t y o f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n dt h e nt h ea c t i v a t e dt y r a m i d e - c o n j u g a t e dg o l d p a r t i c l e sw e r ed e p o s i t e di nt h ev i c i n i t yo ft h eh r p - t a r g e t i n t e r a c t i o ns i t e t h e c l u s t e r s o ft h et y r a m i d e c o n j u g a t e dg o l dp a r t i c l e sw e r e u s e dt om a k et h e b i o t i n y l a t e dd n at a r g e t sv i s i b l ei nl i g h ta n dw e r ef u r t h e rr e d u c e db ya ge n h a n c e r a g e n tt oa m p l i f yt h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l s w ea l s o i d e n t i f i e ds u c c e s s f u l l yf o u r v a r i o u ss e r o t y p e so fe c o i li n c l u d i n gn o r m a ie c o i l ( a t c c2 5 9 2 2 ) ，e c o i l0 1 ：h 7 ( u 5 4 1 ) e c o i l 0 1 5 7 ：h 1 9 ( a 2 ) a n de c o i l0 1 5 7 ：h 7 ( 8 8 2 3 6 4 ) s t r a i n sa n dt h er e s u l t s o ft h i sm e t h o da r ec o n s i s t e n tw i t ht h a to ft h ec o n v e n t i o n a if l u o r e s c e n td e t e c t i o n i t i saf a s t s i m p l em e t h o df o rd e t e c t i n gn u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o no nm i c r o a r r a y sa n d d o n tn e e de x p e n s i v ea n dc o m p l i c a t e di n s t r u m e n t t h ee x p e r i m e n t a li m a g er e p o r t s c a nb ev i s u a l i z e do n l yb yn a k e de y eo rb yac o m m o nf l a t b e dc c ds c a n n e rw i t h c o r r e s p o n d i n ga n a l y s i ss o f t w a r e 3 t h r e es p e c i f i ca m i n o - m o d i f i e dm o l e c u l a rb e a c o np r o b e sw e r ed e s i g n e da n d i m m o b i l i z e do na na g a r e s ef mt of a b r i c a t em o l e c u l a rb e a c o na r r a y s a ti o wi o n s t r e n g t h ( 1 0 m mm g c l 2 ，2 0 m mt r i s h c i ( p h8 o ) ) p r a c t i c a lu n l a b e l e dp c rp r o d u c t s o ft w ov i r u l e n c ef a c t o r so fe c o i l0 15 7 ：h 7 曲ea n df i l c h 7w e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t si n d i c a t et h a tm o l e c u l a rb e a c o na r r a y sc a np r o v i d ec a p a b i l i t yo fp a r a l l e l ， t a b e l f r e ea n a l y s i sf o rt h ep r a c t i c a ls a m p l e ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e so ft h e p o s t i t i v eh y b r i d i z a t i o ni s5t i m e sh i g h e rt h a nt h eb a c k g r o u n ds i g n a l s o ft h en e g a t i v e h y b r i d i z a t i o n 1 na d d i t i o n 。i ta l s oh a sa d v a n t a g e so fs i m p l ef o rp r e p a r a t i o n ，h i g h s e n s i t i v i t ya n ds h o r td e t e c t i o nt i m eb e c a u s eo fe l i m i n a t i n gt h et a r g e ts a m p l e i a b e l i n gs t e pi nt h em i c r o a r r a ye x p e r i m e n t 4 t a q m a np r o b e sa r r a yi sf i r s t l yp r o p o s e df o rq u a n t i t a t i v e ，i a b e l - f r e e p a r a l l e ln u c l e i c a c i da n a l y s i s i nt h i sm e t h o d ，as e to fa m i n o - m o d i f i e dt a q m a np r o b e sa r ed e s i g n e d t h e yc o n t a i nt h r e ep a d s ：( 1 ) a5 e n df 4 一( 4 一d i m e t h y | a m i n o p h e 叫i a z o ) b e n z o i ca c i d 】 i su s e da st h eq u n c h e rd y e ；( 2 ) ai n t e r a lf a md y ew i t h i n3 a r mi su s e dt h e f l u o r o p h o r e ；( 3 ) ap o l y ( t ) 2 0i su s e da sas p a c e ra n da3 e n da m i n og r o u p i s u s e dt oi m m o b l i z eo nt h eg l a s ss l i d e a n dt h e nat a q m a np r o b ea r r a yi s f a b r i c a t e db yt h e s ep r o b e sa b o v ei m m o b i l i z e do ng l u t a r a l d e h y d e m o d i f i e dg l a s s s l i d e w h e nt h et a r g e ti sp r e s e n c e ，5 n u c l e a s ea c t i v i t yo fd n ap o l y m e r a s ew i l l c l e a v et h eq u e n c h e rd y eo ft h ei m m o b i l i z e dp r o b eo ng l a s ss l i d ed u r i n gt h e e x t e n s i o ns t e po ft h ep c rr e a c t i o nl i k e i ns o l u t i o ne n v i r e n m e n ta n di tc a u s e sa n i n c r e a s ei nr e p o r t e rf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb e c a u s eo fac h a n g ei np n y s i c a l d i s t a n c eb e t w e e nar e p o r t e rf l u o r o p h o r ea n daq u e n c h e rm o i e c u l eo ft h ep r o b e s h e r ep o l y ( t ) 2 0a sas p a c e ri su s e dt oi m p r o v et h es i g n a la n di n c r e a s e r e a c t i o nv e l o c i t yo ft h es o l i dp h a s et a q m a na s s a y t h ea n n e a l i n gp r o p e r t ya n d v j 查塑查兰堡! ：兰竺堡兰 s p e c i f i c i t yo ft h ep r e s e n tt e c h n i q u ea r ei n v e s t i g a t e d i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e t a q m a np r o b ea r r a y so nap l a n a r g l a s ss l i d eh a sa b i l i t yt od e t e c tm u t i p l el a b e l - f r e e d n at a r g e t s s i m a n t e o u s l ya n dq u n a t i t a t i v e l yw i t he x c e l l e n ts p e c i f i c i t y ，t h e i n c r e m e n to ft h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e sa f t e rc l e a v a g ei s2t i m e so fb e f o r e c l e a v a g e a n di ta l s os h o r t e n sc l e a r l yd e t e c t i o nt i m eb ye l i m i n a t i n gt h et a r g e t s a m p l el a b e l i n gs t e pa n dn or e q u i r e m e n to fp o s t - p c rs t e p 5 an o v e l0 l i a o n u c l e o t i d ea r r a y s - b a s e dm u l t i p l e xa m p l i f i a b l ep r o b eh y b r i d i z a t i o n ( a r r a y - b a s e dm a p h ) t e c h n o l o g yf o rm e a s u r e m e n to fd n af r a g m e n tc o p yn u m b e r c h a n g e si nt o t a lg e n o m ew a sf i r s t l yr e p o r t e d as e to fa m p l i f i a b l ep r o b e sw e r e p r e p a r e d b yl o c u s s p e c i f i cf o r w a r da n dr e v e r s ep r i m e r ss y n t h e s i z e dw i t ht h et 7 a n dt 3p r o m o t e rs i t e sa tt h e i rr e s p e c t i v e5 。e n d st ot h ei n t e r e s td n af r a g m e n t s t h es e to fp r o b e sw e r et h e nh y b r i d i z e dw i t hg e n o m ed n ai m m o b i l i z e do nt h en y l o n m e m b r a n e t h es e l e c t i v ep r o b e sa f t e rm a p hw e r ec o l l e c t e dw i t hs t r e p t a v i d i n c o a t e dm a g n e t i cb e a d sa n da m p l i f i e db yab i o t i nl a b e l e du n i v e r s a ip r i m e r s t h e b i o t i n y l a t e dp c rp r o d u c t sw e r et h e nh y b d d i z e d w i t ht h e c o r r e s p o n d i n g o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y sc o n s i s t e do f1 0e x o n so fd m dg e n ep r o b e sa n dp o s i t i v e ， n e g a t i v ec o n t r o ip r o b e si m m o b i l i z e do ng l a s ss l i d e s a f t e rh y b r i d i z a t i o n 。t h es l i d e s w e r ew a s h e db yh y b r i d i z a t i o nb u 仟e ra n ds t a i n e dw i t ht h es t r e p t a v i d i nc o n j u g a t e d c y 3 t h eh y b r i d i z a t i o nf l u o r e s c e n c ei m a g e sw e r es c a n n e db yt h es c a n a r r a y s o f t w a r ea n df u r t h e rq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e db yt h ei m a g e js o f t w a r e h e r ew eu s e d o l i g o n u c l e o t i d ea r r a yt e c h n o l o g yt or e p l a c et h ea g a r o s eg e la n a l y s i sf o rd e t e c t i n g t h eb i o t i n y l a t e dp c rp r o d u c t ss ot h a te x t e n d a b l ea b i l i t yo fp a r a l l e ia s s a yi no u r m e t h o dh a dg r e a t l yb e e ni m p r o v e d o r ec o n t r o lf e m a l e ，o n ec o n t r o im a l ea n do n e d m dp a t i e n tw e r es u c c e s s f u l yt e s t e di nt h i ss t u d y t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h e f e a s i b i l i t yo fh i g h - t h r o u g h p u td e l e c t i o na n dr e l a t i v eq u a n t i f i c a t i o no fd n af r a g m e n t c o p yn u m b e r sc h a n g e si nt o t a lg e n o m ed n aw i t ho l i g o n u c l e o t i d ea r r a y sb a s e d m a p ht e c h n o l o g y 1 ta l s oc a nb ea p p l i e dt od i a g n o s i so fo t h e rh u m a ng e n e t i c d i s e a s e sa sw e l la si t sr e c e s s i v ec a r r i e rs t a t u s v i l l 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文足我个人在导师指导下进行的研究t 作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，沦文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为状得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同t 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：垂1 堑至 e t 期：丝塑：璺加 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名导师签 e 1 期： ，2 ，。鼍 7 第一章绪论 第一章绪论 生命科学正处在其发艘的黄金时期前夜。过去，科学家一次仪仪能同时对少数几个基冈或 感兴趣的靶标进行分折。近米生物芯片技术在各个方面取得突出进胜m + 3 4 ，5 8 - 8 ，9 一0 1 从而使得 同时对上千个，甚至更多个基冈、蛋白、或其它的生物识别分子同时进行分析成为现实。这种 从整体水f 来认t l 人类及其它生命体生老病死之问的复杂关系的能力与意义足以前的研究方法 所h i 可比拟的。正足由于这种背景需求，生物芯片这个集多学科之大成的技术产物得以迅猛发 j 楚。 生物芯片的基础在于生物分子之问的特异性识别，起源于s o u t h e r n 杂交理论，也即把核 酸分子固定在膜上与另一标记的核酸分子进行杂交来识别未知的核酸分子，其后衍生为特异性 识别的分子对，如酶一底物、抗体- 抗原、受体- 配基、蛋向一蛋白、受体- 药物、生物素一亲和素、 核酸一蛋白、蛋白一小分子、糖蛋白- 受体等特异性分子识别的相互作用情形。借鉴于微电子芯片 的概念，这些特异性分子识别的相互作用的检测高度集成化、小型化和自动化乃构成生物芯片 的缘起。目前，生物芯片在后基因组时代纷繁的信息中已经成了晟重要的研究工具之一。而生 物芯片的分析实质是在面积不在的固体基片如硅片、塑料片、玻璃片表面有序地按一定图案排 列了一系列固定于一定位置的可寻址的生物识别分子。在一定的生化反应条件下进行固定分子 与待测靶分子的相互识别。其结果用不同的检测方法，包括同位素洼、比色法、荧光法、化学 发光法、电化学法、质谱法、光散射法等显示甚至放大，然后经精密的，占片扫描仪、高精度c c d 成像技术或其它物理手段将光、电信号转化为数字信号输出。从而，在讣算机软件分析给出可 读的实验结果。下面介绍生物芯片目前的研究状况、应用及本文的主要内容和结构。 1 1 生物芯片的研究进展 1 1 1 生物芯片的种类 从构成生物芯片的材料来看生物芯片大致有以下几种，d n a 芯片、蛋白质芯片、多肽 芯片、细胞芯片、组织芯片和碳水化台物或糖芯片。从制各方法而苦，可分为电了芯片、微流 栓芯片等。 d n a 芯片 d n a 芯片足现代生物芯片技术中避成功的案例。基因芯片，又称d n a 微探针阵列 ( m i c r o a r r a y ) ，也是一种最为重要的生物芯片。它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被 检测的核酸序列互补匹配，进行序列测定。基因芯片能够在同一时间分析大量的基因，实现生 物基因信息的大规模检测。生物芯片与电子工程学巾的硅半导体芯片非常相似或者也可以 说足一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构 建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信 息最的筛选或检测。一些主要的公司包括o p e f o n 、a f f y m e t r i x 、s t r a t a g e n e 、c l o n c t e c h 、i n c y t e 等。 查塑生堂竖主兰丝丝苎 蛋白质芯片 为了解决传统的蛋向质分析所用的一二维凝胶技术巾存在的问题，抗体或蛋白质序列芯片应 运而生。这是因为m r n a 的量的变化并不精确表明蛋向质数量的变化，事实上m r n a 的量和 蛋白质没有很多的相互关系。而是存在三维时空上的著异，而且实际上在细胞中参与各种不同 反应的都是蛋臼质a 尽管与d n a 芯片相比，蛋内质芯片巾蛋白质的周定化在印象巾存在着潇 如蛋向的功能如何保持等许多问题，其发艘的步伐并没有停滞不前。2 0 0 0 年秋天，哈佛大学的 m a c b e a t h 和s c h r e i b e r 等”1 撤道了通过点样机械装置制作蛋广 质芯片的研究，取得了突破 性进胜，他们在3 f 个载玻片大小的玻璃基片表面同定了1 0 ，0 0 0 种蛋门质并用其研究蛋广j 质与 蛋白质问、蛋白质与小分子问的特异性相互作用0 1 4 1 5 。从而胜w i 了制造高密度蛋f = i 质芯片并且 保持蛋n 质特异性结合能力的技术。这一技术的关键问题在于保证被点在载玻片上的蛋n 质分 子4 i 失活而又能牢固地固定在玻璃片表面。 同时。一些研究组在微孔板上的e l s a 技术的基础上发展了多种蛋白质芯片的模型b 4 , 1 6 。 如德国g e s i m m b h美国普林斯顿o r c h i d 生物计算公司的毫微多孔式芯片( 1 0 0 - - 1 0 0 0 n l 孑l ) i s j 7 o 而m e n d o z a 和他的同事1 1 8 研制的蛋白芯片仍然沿用了9 6 孔扳模式但在每个孔的底部 制备成微阵列，从而大大增加了蛋向质样点的密度。由于该板与普通酶标板一样，可真接旅入 与之相配套的全自动免疫分析仪中使用，通过c c d 扫描监测，适用于蛋白质的大规模、多种 类筛选。此外在美国阿贡国家实验室和俄罗斯科学院思格尔哈得分子生物学研究所的共同资 助下，m i r z a b e k o v 小组所开发了一种三维凝胶块芯片”他们把不同的蛋白质如抗原、抗体 和酶固定在1 0 0 x 1 0 0 x 2 0p , m 凝胶块。修饰后的凝胶块可以容纳分子量为4 0 0 ，0 0 0 道尔顿的蛋 白质每个凝胶块可用于靶d n a 、r n a 和蛋白质的分折”“j 。 2 0 0 1 年，耶鲁大学的s n v d e rd 、组研究一种基因纽水平上的蛋自质芯片覆盖了芽孢酵母 大部份基因产物的大约6 0 0 0 种蛋白质，这些蛋向质被表达并在n - 末端以g s t - h i s x 6 ( g l u t o a h i o n es - 转移酶聚组氨酸) 标记，然j 焉植入制成：矗片1 2 0 1 ，通过光滑的玻璃表碰上的醛基 或n i 离子包裹( 与h i s x 6 成键) 使蛋向质附于芯片之上。平均分配的蛋白质样品点则通过荧光 标记的g s t 抗体确认，以此证明蛋白质问的相互结合能力并用其识别新的能与之特异性结合 的蛋白质。 而商业性的蛋1 3 质芯片公司g i q b ! 四盟在：笛片表面包裹了并种材料，利用这些不同的表面 区别不同的蛋白质。设计的表面材料有疏水性的、亲水性的、阳离子和阴离子交换型的、金属 离子和潜在的活性分子等。但是仅用这些有限数量的表面来识别数以千计的不同蛋白质比较困 难。与芯片能相互结合的蛋白质采用基质辅助激光解嗷离子化飞行时m l 质谱( m a l d i - t o f ) 进 行分析。o x f o r d , g l y c o s c i e n c e ：1 囟四璺目地量| q ! 四y 是现在蛋九质组学研究的领袖口”。 小分子芯片 2 0 0 1 年，s c h u l t z 小组通过联合使用肽核酸( p n a ) 标记的小分子和d n a 可寻址芯片技术 而发胜了新的4 、分子芯片伫2 。2 3 。早在十年前就发展了单分子下的编码和解码法。但是在给标记 台成编码时需要额外的化学修正，而且合成化合物的量受限于粒子的体积。在新方法中，p n a 是编码标记带有标记的文庳化台物直接与芯片上对应的d n a 序列相关联。缩果是，p n a 和 d n a 形成双螺旋小分子文库化合物嚣在双链的顶端，通过对一出片上特定地址解码来识别化合 物。实验使用的例子是c y c t e i n 蛋白酶抑制剂，证i ! l = | 了p n a 标记对该抑制剂的活性没有影响。 2 一 一一 一一里：。! 竺堡 存在的问题是这些以p n a 标记的分子小能穿透细胞膜，这对于以细胞为基础的筛选可能小太 合适。 许多公_ j 宜称他们具有小分子芯片技术，但是他们大部份是为高通最筛选准符的小圆片或 薄膜排列。一家德国的新诞生的公司鱼