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_ 考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（CoomassieG-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收max的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。二、操作步骤1.标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080去离子水/ml1.00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A595在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100ug/ml的蛋白溶液。b. 考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升三、数据及绘图管号吸光度A1吸光度A2吸光度A3吸光度平均值牛血清蛋白质量（ug）00.0000.0000.0000.000010.0700.0730.0690.0711020.1490.1530.1510.1512030.2810.2830.2780.2814040.4190.4210.4160.4196050.5630
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