（遗传学专业论文）亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究.pdf

亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究 摘要 海洋亚历山大藻属( a l e x a m d r i u m ) 是一类重要的海洋赤潮甲藻，广泛分布 于北美、欧洲、亚洲海域，其中一半左右能够产生麻痹性神经贝毒。有毒亚历山 大藻引发的赤潮造成的海水养殖业损失和人体中毒事件在国内外均有发生，危害 巨大，这就对亚历山大藻的生长，快速识别鉴定及产毒机制等研究提出了迫切的 要求。 亚历山大藻藻体较小，不同种( 株) 形态相似，缺乏有效的鉴别特征，而利 用分子生物学方法可获得稳定可靠、精确灵敏的识别指标，再与形态学识别鉴定 相结合，可得出可靠、客观的识别鉴定结果。本文在对分离自中国青岛和广州海 域的3 株海洋亚历山大藻似l e x a n d r i u ms p q d l ，a l e x a n d r i u ms p q d 2 ，a l e x a n d r i u m s p g z ) 进行形态学描述的基础上，扩增获得了5 8 s 核糖体基因及其两侧的内部转 录间隔区i t s l 和i t s 2 ，测序后进行了系统学分析。结果显示，a l e x a n d r i u ms p g z 和a l e x a n d r i u ms p q d l 与来自韩国和日本的a c a t e n e l l a 和来自中国的两株可能是 a c a t e n e l l a 的藻株a c 0 3 和a n 0 1 聚类，并显示出很高的可信值，这6 种( 株) 藻的遗传距离值也非常低( ( o 0 2 ) 。因此a l e x a n d r i u ms p g z 和a l e x a n d r i u ms p q d l 可能是a c a t e n e l l a ，该种藻广泛分布于中国海域，而且具有不同的地理型； a l e x a n d r i u ms p q d 2 与a l e x a n d r i u m 属的遗传距离很远，而与共生甲藻 s y m b i o d i n i u mc a l i f o r n i u m ，s y m b i o d i n i u ms p g i5 和g y m n o d i n i u ms p z h a o0 1 聚 类，可信值达1 0 0 。综合已有的报道，推断a l e x a n d r i u ms p q d 2 可能属于 s y m b i o d i n i u m ，并可能是株营自由生活的共生甲藻。 在对a l e x a h d r i u ms p q d l 做出分类鉴定的基础上，设定不同的氮、磷浓度水 平，研究在室内一次性培养条件下，无机氮、磷浓度对链状亚历山大藻 a l e x a n d r i u ms p q d l 细胞生长的影响，结果表明不同氮磷浓度对a l e x a n d r i u ms p q d l 的比生长速率和稳定期生物量均有影响。适当的氮限制可以促进细胞的分 裂，低氮( 8 8 2i n n o l l ) 条件下a l e x a n d r i u ms p q d l 具有最快的比生长速率 ( 0 3 d d ) ，但氮缺乏对生物量的积累是不利的，因而低氮下生物量明显偏低；中 氮( 8 8 2i i m o l l ) 条件下，藻细胞具有最大的生物量和较快的比生长速率；低磷 对a l e x a n d r i u ms p q d l 的生长是极不利的，细胞的比生长速率和稳定期生物量大 大低于磷充足条件；高磷条件下，藻细胞具有较快的比生长速率和最大的稳定期 生物量：随着培养基中磷浓度( 3 6 1 0 8 p m o l l ) 的升高，藻细胞稳定期生物量 也升高。国内外研究者们发现藻细胞的生长特性不仅与环境中的营养盐浓度有 关，而且与n p 比值有很大关系，从本实验可以看出，相对低的n p 比有利于 藻细胞的分裂繁殖，在低氮中磷( n p - - 2 4 5 ) 和中氮高磷( n p = 8 1 7 ) 条件下分别得到 最大比生长速率和最大生物量，而高氮中磷( n p = - 7 3 5 ) 和中氮低磷( n p - = 2 4 5 ) 下比 生长速率和生物量均较低。推测氮磷比2 4 5 可能为该藻对氮、磷吸收的一个合 理比值。 t a r o n e h e r - o l d e n b u r g ( 2 0 0 0 ) 利用同步化技术和差异显示技术，推测在 肛，咖h 昭甲硫氨酰氨肽酶基因( m a p ) 与毒素合成有关，并认为m a p 是表达上 调基因。本文利用r t - p c r 和e d n a 末端快速克隆( r a p i da m p l i f l e a t i oo f e d n a e n d ，r a c e ) 技术，克隆了a l e x a n d r i u ms p q d lm a pc d n a 的3 端序列，得到 三个m a pc d n a 3 端序列，可编码8 0 个氨基酸。这三条序列在编码区完全相同， 但在37 端非编码区有差异。推测在a l e x a n d r i u ms p q d l 中存在两个或三个m a p 基因拷贝，它们分别转录得到三种m a pm r n a 分子，或者转录得到两种m a p m r n a ( m a p l 和m a p 2 ) 后，由反式拼接或r n a 编辑产生第三种m a pm r n a 分子 ( m a p 3 ) 。s o u t h e r n 杂交结果也说明在a l e x a n d r i u ms p q d l 中最多存在三个m a p 基因拷贝。 氮磷营养元素可以影响藻细胞的生长，细胞的毒素含量和毒素组成。氮限制 可造成藻细胞毒素合成的减少，而相对充足的氮源对藻生长和产毒均有促进作用； 磷限制能够导致藻细胞毒素含量上升基于这一点，利用半定量r t - p c r 技术分 析了不同氮磷浓度下毒素含量和m a p 表达水平，发现m a p 表达量和藻毒力都是 中氮 低磷 低氮 高磷，即藻毒力与m a p 表达量呈正相关。 对看家基因甘油醛3 磷酸脱氢酶( g a p d h ) 的部分e d n a 进行了分子系统 学分析，分析结果中存在与传统分类不一致的地方，尤其是裸甲藻的分类结果。 这种现象可能是甲藻的传统分类方法存在问题，也有可能是由于g a p d h 基因本身 的进化速度与生物的进化速度有很大的差异所造成的。 ， 2 关键词：亚历山大藻；5 8 sr d n a i t s ；分子系统学；甲硫氨酰氨肽酶基因：毒 素 3 t h eb a s i 0r e s e a r c hi ng r o w t ha n df o x i g e n i 0 g e n eo fal e x a n d r i u m a b s t r a o t m a r i n ea l e x a n d r i u mi sa l li m p o r t a n tr e da l g a ea n dd i s t r i b u t e di nt h ec o a s to f n o r t ha m e r i c a ，e u r o p e ，a n da s i a ne x t e n s i v e l y h a l fs p e c i e so fg e n u sa l e x a n d r i u m c a np r o d u c ep a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g r e dt i d e sp r o d u c e db yt o x i ca l e x a n d r i u r a h a dc a u s e dw o r l d w i d ea q u a c u l t u r el o s sa n dh u m a np o i s o n i n g o n c et h eh a r m f u lr e d t i d eb r e a do u t , i te n d a n g e re n o r m o u s l y , s og r e a tr e q u e s ti sp r o p o s e do nt h eg r o w t h , i d e n t i f i c a t i o na n dt o x i np r o d u c i n gm e c h a n i s mo f a l e x a n d r i u m a l e x a n d r i u mi ss m a l li ns i z ea n ds i m i l a ri n m o r p h y l o g yb e t w e e nd i f f e r e n t s p e c i e s ，a n de f f e c t i v ei d e n t i f y i n gc h a r a c t e r i s t i ci s l a c k e da t p r e s e n t u t i l i z i n g m o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o dc a ng e tr e l i a b l e , a c c u r a t aa n ds e n s i t i v ec h a r a c t e r s c o m b i n gt h em o l e c u l a rb i o l o g yd a t aw i t ht h ek n o w l e d g eo fm o r p h y i o g y , m o r e r e l i a b l ea n do b j e c t i v er e s u l t sc a nb ed r a w n t h r e en e w l yi s o l a t e ds t r a i n sf r o mc h i n e s e w a t e r sa l en a m e da l e x a n d r i u ms p q d l ，a l e x a n d r i u ms p q d 2a n da l e x a n d r i u ms p g z b ym o r p h o l o g i c a ld e s c r i b i n g t h e5 8 sr i b o s o m a ld n ag o n ea n df l a n k i n gi n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r1a n ds p a c e r2 ( 1 t s la n di t s 2 ) f r o m3i s o l a t e sa r ea m p l i f i e d , s e q u e n c e d ，a n ds u h j e e t e d t o p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s a l e x a n d r i u ms p g z a n d a l e x a n d r i u ms p q d lg r o u p et ot o x i ca c a t e n e l l a ( f r o ms o u t hk o r e aa n dj a p a n ) a n d t w ou n i d e n t i f i e da l e x a n d r i u ms t r a i n s ( a c 0 3a n da n o i ) w h i c hs u g g e s t e dt ob e c a t e n a l l ai nap r e v i o u ss t u d yw i t hh i g hb o o t s t r a pv a l u e a l e x a n d r i u ms p g za n d a l e x a n d r i u ms p q d lw e r ei d e n t i f i e da sa c a t e n e l l a t h e n 彳c a t e n e l l ai sb r o a d l y d i s t r i b u t e di nc h i n e s ew a l e r s a n dh a saf e wg e o g r a p h i c a la n dg e n o t y p es t r a i n s a l e x a n d r i u ms p q d 2d i f f e r e dg r e a t l yw i t ht h eg e n u sa l e x a n d r i u m ，b u tc l u s t e rw i t h s y m b i o d i n i u mc a l i f o r n i u m ，s y m b i o d i n i u ms p g i5a n dg y m n o d i n i u ms p z h a o0 1 w i t h1 0 0 b o o t s t r a pv a l u e a l e x a n d e i u ms p q d 2i sa f f i l i a t e dt os y m b i o d i n i u m ，a n d p r o b a b l yb e l o n g st oaf r e e - l i v i n gs t a i n 4 l e x a n d r i u ms p q d li sc u l t i v a t e di nf 2m e d i u mw i t hd i f f e r e n ti n o r g a n i c n i t r o g e n ，p h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o n t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f n i t r o g e n ，p h o s p h o r u s o nt h eg r o w t ho fa l e x a n d r i u ms p q d li ss t u d i e di n o n e b a t c h c u l t u r ei nl a b t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es p e c i f i cg r o w t hr a t e sa n d s t a b i l i z e db i o m a s sa r cd i f f e r c n tu n d e rd i f f e r e n tn i t r o g e na n dp h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n s r e a s o n a b l en i t r o g e nl i m i t a t i o nc a l lp r o m o t et h ep r o l i f e r a t i o no f a l e x a n d r i u ms p q d l ， u n d e rt h ec o n d i t i o no fl o wn i t r o g e n ( 8 8 2 i _ t m o l l ) ，t h es p e c i f i cg r o w t hr a t ei sh i g h e s t ( o 3 8d 。) b u tl a c ko fn i t r o g e ni sa d v e r s ef o ra c c u m u l a t i o n ，s ot h eb i o m a s sw a st h e l o w e s t ；t h eb i o m a s sa c h i e v e dt h em a x i m u ma n dt h es p e c i f i ci sh i g h e ru n d e rt h e m i d d l en i t r o g e n ( 8 8 2 1 a m o l l ) l o wp h o s p h o r u si sb a d l ya d v e r s ef o rt h eg r o w t ho f a l e x a n d r i u ms p q d l ，t h es p e c i f i cg r o w t hr a t ea n dt h eb i o m a s sl o w e rt h a nt h e p h o s p h o r u sa b u n d a n c e ；t h es p e c i f i cg r o w t hr a t ei sh i g h e ra n dt h eb i o m a s si sm o r e u n d e rt h eh i 曲p h o s p h o r u s ( 1 0 8 t a m o l l ) c o n d i t i o n ；t h eb i o m a s si sr i s i n gw i t ht h e i n c r e a s i n go ft h ep h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o n ，r e a c h i n gt h em a x i m u m1 2 0 0 0e e l l m l u n d e rh i g hp h o s p h o r u s i ti sf o u n dt h a tt h eg r o w t ho fa l e x a n d r i u ms p q d li sa l s o r e l a t e dt on p i ti sc o n c l u d e dt h a tl o wn pi si nf a v o ro ft h ec e l lp r o l i f e r a t i o no f a l e x a n d r i u ms p q d l t h eh i g h e ms p e c i f i cg r o w t hr a t ea n dt h em o s tb i o m a s sr e a c h e da t t h er a t i o ( n p ) 2 4 5a n d8 1 7s e p a r a t e l y , c o n t r a s t , t h es p e c i f i cg r o w t hr a t ea n dt h e b i o m a s si sl o w e ra tt h er a t i o ( n p ) 7 3 5a n d2 4 5s e p a r a t e l y t h er a t i o2 4 5m a yb e a p p r o p r i a t ef o rt h en i 廿o g e na n dp h o s p h o r u sa b s e r p t a n c e t a r o n c h e r - o l d e n b u r g ( 2 0 0 0 ) p u t a t i v et h a tm e t h i o n i n ea m i n o p e p t i d a s eg e n e 向蝇砂 i sr e l a t e dt ot h et o x i ns y n t h e s i sa n di sa nu p - r e g u l a t e dg e n eb yt h es y n c h r o n i z a t i o n a n dd i f f e r e n t i a ld i s p l a yt e c h n i q u e i no u re x p e r i m e n t , t h r e ee d n as e q u e n c e so f m a p ( m a p l ，m a p 2a n dm a p 3 ) a r eo b t a i n e db yr t - p c ra n dr a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d ) ，t h et h r e es e q u e n c e sa r ei d e n t i c a li nt h ec o d i n gr e g i o na n dd i f f e r e n ti nt h e u n t r a n s l a t e dr e g i o n p r o b a b l y ，t h r e ec o p yo fm a pg e n ee x i s t e di na l e x a n d r i u m s p q d l a n dm c yt r a n s c r i b e di n t ot h r e em a pm k n a ，o rt h e r ea r et w oc o p y ( m a p l a n dm a p 2 ) a n dt h et h i r dm a pr n a ( m a p 3 ) i sp r o d u c e db yt r a n s s p l i c i n gm e c h a n i s m t h er e s u l t o fs o u t h e r nb l o t t i n ga l s ov e r i f i e st h e r ea r en om o r et h a nt h r e ec o p yo fm a pg o n ei n a l e x a n d r i u ms p q d l 5 t h en u t r i t i o nm a t e r i a lo fn i t r o g e np h o s p h o r u sc a r le f f e c tt h eg r o w t h ，t o x i n c o n t e n ta n dt o x i nc o m p o n e n t t o x i np r o d u c t i o ni sr e d u c e db yn i t r o g e nl i m i t a t i o na n d a c c e l e r a t e db ya b u n d a n c en i t r o g e n t o x i np r o d u c t i o ni sa c c e l e r a t e db yp h o s p h o r u s l i m i t a t i o n b a s e do nt h i sr e p o r t ，t h er e l a t i o no ft o x i np r o d u c t i o na n dm a pg e n e e x p r e s s i o nq u a n t i t yi sa n a l y z e db ys e m i q u a n t i t i v er t - p c t h et o x i np r o d u c t i o na n d m a pg e n ee x p r e s s i o nq u a n t i t y i s i nt h es a m eo r d e r ：m i d d l en i t r o g e n l o w p h o s p h o r u s l o wn i t r o g e n h i g hp h o s p h o r u s ，t h er e s u l ts h o w e st h er e l a t i o no ft o x i n p r o d u c t i o na n dm a pg e n ee x p r e s s i o nq u a n t i t yi sp o s i t i v e t h em o l e c u l a rp h y l o g e n ya n a l y s i sb a s e do n p a r t i a l e d n as e q u e n c eo f g l y c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g a p d h ) i sd i f f e r e n tw i t ht r a d i t i o n a l e l a s s i f y i n gs y s t e m ，e s p e c i a l l yt h eg y m n o d i n i u mg e n u s ，m a y b ct h ed i f f e r e n c e i s c a u s e db yt h ee v o l u t i o nr a t eo f g a p d hg e n ew h i c h d i v e r g e df r o mt h el i f e f o r m k e yw o r d s ：a l e x a n d r i u m ；5 8 sr d n a i t s ；m o l e c u l a rp h y l o g e n y ；m e t h i o n i n e a m i n o p e p t i d a s eg e n e ；t o x i n 6 亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究 第一节前言 1 赤潮的定义 赤潮( r e dt i d e ) 又称红潮，是在一定的环境条件下，海水中某些浮游植物、 原生动物或细菌在短时间内突发性增殖或高度聚集而引起的海水变色的一种生 态异常现象，包括所有能改变海水颜色的有毒藻或无毒藻引发的赤潮，以及那些 虽然生物量低不能改变海水颜色，但却因含有藻毒素而具有危险性的藻华。 一 赤潮实际上是各种色潮的统称，发生赤潮的水色依形成赤潮时占优势的浮游 生物种类的颜色不同而变化。如大多数甲藻( d i n o p h y c e a e ) 大量繁殖时呈褐色， 夜光藻( n o c t i l u c as c i n t i l l a n s ) 、中缢虫( m e s o d i n i u mr u b r u m ) 形成的赤潮呈粉红 色，绿色鞭毛藻( t e t r a s e l m i s ) 大量繁殖时呈绿色，硅藻( d i a t o m ) 形成的赤潮 往往呈黄褐色，锥状斯克利普藻( s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a ) 形成的赤潮里红棕色。 近年来，国际科学界将那些造成直接危害的赤潮，称为有害藻类水华( h a r m f u l a l g a lb l o o m ，h a b ) ，而把一些无直接危害的赤潮( 如某些硅藻引发的一些赤潮) 不归于此类，所以近年的一些国际学术会议或论文都用h a b ，但在亚洲，特别 是我国和日本仍使用赤潮一词。 赤潮现象自古就有，我国古代就有关于赤潮现象及其后果的记录，只是古时 赤潮发生次数较少。2 0 世纪以来，赤潮发生的频率不断升高，持续时间增长， 赤潮高发区不断扩大。导致这一现象的原因主要有：工农业迅速发展，尤其是沿 海地区工业日益增多，沿海工农业发展和城市化进程使得进入海洋中的营养盐、 有机物和微量元素等逐渐增加；沿海养殖业的迅猛发展，在加剧近海富营养化的 同时，也改变了近海的营养元素结构；全球变化和气候异常可能产生适宜于某些 有毒或有害藻的生长条件；全球商业和运输业的发展为有毒或有害藻的传播提供 了可能性等。 2 有害赤潮 h a b 也称有害赤潮( h a r m f u lr e dt i d e s ，h r t ) ，是当今全球海洋的一大灾害， 也是国际社会共同关注的重大海洋环境问题和生态灾害。 海洋中大部分浮游藻类是滤食性海洋生物的重要食物来源，适度的藻类繁殖 亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究 对海水养殖和自然生态系统都是有利的，但是藻类的爆发性增殖会对人类和生态 系统形成威胁。根据赤潮生物造成危害的方式可以将有害赤潮大致分为三类 ( h a l l e g r a e f f , 1 9 9 3 ) 。第一类形成赤潮的生物能够产生毒素，这些毒素通过食物 链的累积与传递对高营养级海洋生物和人类造成危害( b r u s l e ，1 9 9 5 ；s m a y d a ， 1 9 9 0 ) 。人类在误食藻毒素后会出现一系列急性和慢性中毒症状，严重的甚至会 死亡。目前全球每年因藻毒素造成的中毒事件约有2 0 0 0 起；第二类形成赤潮的 生物不能产生危及人类健康的毒素，但是部分微藻，如角刺藻( c h a e t o c e r o s c o n v o l u t u s ) ，藻本身的特殊结构能够伤害鱼类及其它无脊椎动物的鳃；同时也有 部分微藻，如夜光藻产生的氨通过损伤鱼类鳃组织的呼吸上皮而对鱼类造成危 害，从而危及海洋生物资源的开发和持续利用。目前，频繁发生的有毒有害赤潮 已经成为制约水产养殖业可持续发展的一项重要因素；第三类形成赤潮的生物本 身没有危害，不能产生毒素或者对其它海洋生物造成直接损伤，但是如果大量繁 殖，会导致水体理化因素的改变，致使水体溶解氧含量降低，或产生硫化氢等有 毒气体，对海洋生物和生态系统造成间接危害。 与常见的大规模赤潮不同，有毒赤潮通常具有以下特点：( 1 ) 藻种密度低。 由有毒藻种形成的赤潮通常密度很低，在浮游植物群落中不占优势；( 2 ) 时间或 空间分布不均匀。部分有毒藻种形成的赤潮往往与特定的水文条件，如海水中密 度梯度的形成有关，因此，在自然水域中常常呈片状分布于特定的水层，增加了 监测难度；( 3 ) 潜在危害大有毒赤潮所产生的毒素生物活性高，而且毒素可以 在滤食性生物中累积，因此，即便是在藻密度较低的情况下也有可能导致严重的 危害效应。 3 赤潮研究的重要。胜与必要性 赤潮本是一种自然现象，但在近2 0 年中，赤潮发生的频率和规模都在逐年 增加，有全球蔓延的趋势( h a l l e g r a e i f , 1 9 9 3 ；s m a y d a , 1 9 9 0 ；周名江，2 0 0 1 ) ， 其对公众健康及经济影响日益加剧。在日本，由于赤潮造成的渔业损失，每年都 在1 0 亿日元以上。1 9 9 6 年墨西哥的环境问题4 5 是赤潮造成的，仅仅在贝类 方面的损失就达几百万美元。中国足世界上赤潮灾害的重灾国之一，1 9 7 7 i 9 9 8 年间，仅大陆沿海就发生了3 1 5 次，香港水域发生4 8 4 次，平均每年3 0 多次 据统计自7 0 年代开始，我国赤潮的发生以每l o 年增加3 倍的速度不断上升 亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究 ( 图l 1 ) ，且自1 9 9 8 年至今影响范围达到数千平方公里的特大赤潮不断出现， 如2 0 0 0 年至今每年春季在东海长江口海域都会发生大规模的东海原甲藻赤潮， 世界罕见。据不完全统计，我国因赤潮而造成的经济损失每年在l o 亿元以上， 一次大规模的赤潮可能会带来几亿元的直接经济损失。 毒； 懿 - t * 4 剿 镫 糠 5 0 年代6 0 年代7 0 辱代8 0 年代9 0 年代 图l l 中国各海区赤潮发生情况( 1 9 5 2 1 9 9 8 ) 资料来自周名江等( 2 0 0 1 ) f i g 1t h es t a t o f h a r m f u la l g a lb l o o m so 。c m m l f r o m1 9 5 2 1 9 9 8i nc h i n e s ec o a s t s 赤潮频发是大自然发出的一个危险信号，它预示着赤潮发生区的海洋生态环 境已经受到严重干扰，生态系统的正常结构和功能已经或正在被改变，而生态环 境一旦失衡恶化将很难在短期内恢复；赤潮引起的“生物污染”不同于化学污染， 具有繁殖潜能，使得其强度和影响范围不断的扩大，总之，赤潮已成为全球性的 海洋灾害之一。因此，预防、控制和治理赤潮是保护海洋生态环境，实现海域经 济可持续发展的关键。 赤潮的频繁爆发和带来的巨大经济损失受到了全世界的关注，联合国政府阋 海洋学委员会0 0 c ) 和海洋研究科学委员会( s c o r ) 组成了赤潮联合工作组，并于 1 9 9 8 年在丹麦联合发起了全球有害赤潮生态学与海洋学研究计划g l o b a le c o l o g ) a n do c e a n o g r a p h yo f h a r m f u l a l g ab l o o m s ( g e o h a b ) ，协调世界各国相关的( 有害 赤潮) 研究活动。我国也成立了相应的组织( c e o h a b ) 4 甲藻与赤潮 据s m a y d a ( 1 9 9 3 ) 和s o u m i a ( 1 9 9 5 ) 的统计，在世界各地已报道的4 0 0 0 种微藻中能引发赤潮的种类有3 3 7 种，约占微藻总数的8 ，其中以甲藻种类 0 o o o o o 嬲 拍 埔 5 亚历山大藻生长和产毒相关基因的基础研究 最多( 1 8 4 种) ，占赤潮生物总种数的5 5 左右；已知能够产生毒素的赤潮藻约有 7 6 种，其中有毒甲藻5 7 种，占有毒赤潮种类总数的7 5 。据邹景忠( 2 0 0 3 ) 等统计，分布于中国沿海的赤潮生物有1 4 8 种，包括曾引发赤潮的赤潮生物和 尚未引发赤潮但数量以及危害性均较大的赤潮生物种类，其中已经引发赤潮的赤 潮生物有4 3 种，甲藻占赤潮生物总种类数的4 8 。引发赤潮的有毒甲藻主要 集中在漆沟藻科( g o n y a u l a c e a e ) 、裸甲藻科( g y m n o d i n i a c e a e ) 、原甲藻科 ( p r o r o c e n t r a c e a e ) 、鳍藻科( d i n o p h y s i a c e a e ) 以及异沟藻科( h e t e r a u l a c a c e a e ) 。 甲藻又称双鞭毛藻，多数为海产，淡水种类较少，少数营寄生生活，包含两 大类：d i n o p h y c e a e 和s y n d i n o p h y c e a e ( a d a c h i ，1 9 7 2 ) 。s y n d i n o p h y c e a e 仅为少 数的寄生种类，约4 0 个种，而通常所指的甲藻主要为前者 甲藻多为单细胞，也有由单细胞连成的不同形状的群体。细胞表面有一层由 原生质分泌形成的相当坚实的表质膜( a m p h i e s m a ) ，具细胞壁或无，壁薄或厚而 硬，由纤维素组成，纵裂甲藻类( d e s m o k o n t a e ) 的细胞壁由左右两片组成，无 纵沟和横沟。横裂甲藻类( d i n o k o n t a e ) 的壳壁( t h e c a ) 由复杂的甲片组成，具 有角( h o r n ) 、刺( s p i n e ) 、突起( p r o c e s s ) 、孔纹等精致的结构；具一条横沟 ( e i n g u l u m ) 和一条纵沟( s u l c u s ) 。游动细胞具两条不等长鞭毛，顶生或从横、 纵沟相交处的鞭毛孔伸出。甲藻有多个色素体，圆盘状、棒状、片状等，常分散 于近细胞表层，含叶绿素a 、叶绿素c 、叶黄素和胡萝h 素等，还含有甲藻特有 的甲藻素( p h y e o p y r r i n ) 和多甲藻素( p e r i d i n i n ) 等，色素体金黄色、黄绿色或 褐色，极少数种类无色。有的甲藻种类有蛋白核，储藏物质为淀粉和油。有些种 类具刺丝胞( t r i s h o e y s t ) 或液泡( p u s u l a ) 或眼点( e y e s p o t ) 。有些种类具生物荧 光。甲藻细胞内有一很大的细胞核，染色质串珠状排列，在整个有丝分裂过程中 核膜不消失，不形成纺锤体。其在生物学上的分类地位比较特殊，介于真核生物 和原核生物之间，许多学者称之为介核生物或间核生物( m e s o k a r y o t e ) 。 5 甲藻的分类研究进展 甲藻是形成海洋灾害的主要门类，面对日益恶化的海洋环境，对沿海海域诱 发赤潮发生的海洋甲藻进行快速准确的检测、鉴定及监控是目前研究赤潮，进而 预防和控制赤潮的最根本的问题。 传统的生物分类系统主要是根据生物的形态构造和生理生化特点为基础的 亚历山大藻生长和产毒相关基困的基础研究 自然分类系统，即根据生物所具有的特征，将生物逐级分类。在过去十几年中运 用光学显微镜、电子扫描显微镜对甲藻的外形特征进行了观察，以藻细胞的形态 和壳面上的花纹为主要的分类依据，研究甲藻的分类及其亚显微结构。甲藻鞭毛 的着生位置，壳板的数目、形状和排列方式，腹孔的有无是分属、定种的主要依 据。甲板可分成几组( k o f o i d ，1 9 0 9 ) ：顶孔板( a p c ) 、顶板( ) 、沟前板( ”) 、 前间插板( a ) 、横沟板( c ) 、沟后板( ” 、底板( 、纵沟板( s ) ( 图1 - 2 ) 。据此划分 出多甲藻( p e r i d i n i a l e s ) 、原甲藻( p r o r o c e n t r a l e s ) 、漆沟藻( g o n y a u l a c a l e s ) 、 鳍藻( d i n o p h y s i a l e s ) 和裸甲藻( g y m n o d i n i a l e s ) 等目，为现存甲藻主要代表， 也是海洋甲藻的常见类群。 a p c 图l - 2 具壳壁甲藻的甲板排列图 顶孔板( a p c ) 、项板( ) 、沟前板( ，前间插板( a ) 横沟板( c ) ，沟后板( ”，、底板( ”、纵 沟板( s ) f i g 1 - 2p l a t es t r u c t u r eo f t h e c a ld i n o f l a g e l l a t e a p i c a l p o r ep l a t e ( a p c ) 、a p i c a lp l a t e ( ) 、p r e c i n g u l a r p l a t e ( 、a n t e r i o r i n t e r c a l a r y ( a ) 、s u l c u s p l a t e 【c ) ，p o s t e i n g u l a rp l a t e ( ”，、a n t , a p i c a lp l a t e ( ， 形态学研究方法虽然较直观，但却存在很大的缺陷：1 ) 甲藻个体微小，个 体大小一般在几十微米或以下，属于微型浮游植物的范畴，若缺乏必要的分类 学知识与研究手段，要将某些物种鉴定到种的水平是有困难的；2 ) 某些甲藻甲 片薄且透明，细胞中所含的大量原生质及色素大大干扰了对甲板的观察，很难看 清甲板的细微结构；3 ) 有些属的甲藻其有毒种和无毒种形态上很相似，如亚历 亚历山大藻生长和产毒相关基周的基础研究 山大藻属的一些种类仅个别甲板的形态上有极微小的差异，但它们形成的赤潮所 造成的危害性差异很大；4 ) 甲藻为单细胞藻，形态学特征受环境变化及不同生 理阶段的影响较大，某些形态特征具有可交性，一些野生种和实验室培养种有较 大差异；5 ) 以形态上的差异作为分类的依据，不同的分类学家有不同的标准， 因此形态学观察有一定的主观性，对于形态上特别相似的物种往往是难以定论 ( t a y l o r , 1 9 8 5 ) 。例如a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 。a c a t e n e l l a , a f u n d y e n s e 以及 p r o r o c e n t r u ms p 等在分类上一直存在着争议和不确定性；6 ) 无壳甲藻的分类更 是困难。再加上甲藻分类方法缺乏较为完整、系统的指导性标准，这都给赤潮甲 藻的准确鉴定带来了困难，影响了赤潮研究工作的进展。因此，非常有必要发展 _ 种准确、快速的检测或鉴定方法来弥补形态分类方面的不足之处。 随着科学技术的发展，一些新的技术手段应用到甲藻的分类研究中。首先是 化学分析技术，如毒素的高效液相色谱分析技术等等，对有毒赤潮动态变化及其 可能导致的危害进行研究和监测；八十年代开始采用同工酶电泳分析方法 ( c e m b e l l a , 1 9 8 6 ；h a y h o m e ，1 9 8 9 ；s a k o , 1 9 9 0 ；t a y l o r , 1 9 8 5 ) ，该方法是一种基于 酶基因位点的分子标记技术，但一些性状是由多基因协调作用产生的，很不稳定， 因此，也未能获得理想的结果；免疫技术，即克隆抗体技术，是通过把目标藻类 注射到动物中，使得动物对那些未被破坏的外源生物产生抗体，采用抗体特异结 合藻类细胞壁上的蛋白质，从而识别该目标藻种，但是容易发生交叉反应，即标 识了非靶细胞，并且在不同学者的研究中得到了不一致的结果，该方法也未能在 微藻分类研究中得以广泛应用。 近十几年来分类学家开始采用分子生物学方法研究甲藻的分子进化。已应用 的技术包括限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf m g m e n tl e n g t hp o l y m