（材料学专业论文）双亲性葡聚糖修饰聚乳酸微球的制备及体内外评价.pdf

摘要 本文以胆固醇和丁二酸酐为原料制备了胆固醇3 半琥珀酸酯，并以此为原 料，以三乙胺为催化剂在d m s o 中制备了胆固醇疏水改性葡聚糖衍生物 ( d e x c h ) ，通过改变胆固醇3 半琥珀酸酯和葡聚糖的投料比得到不同取代度 的改性产物。1 h n m r 表征其实际取代度为2 2 ，3 4 和8 。 分别以透析法和溶剂挥发法制备胆固醇疏水改性葡聚糖衍生物修饰的聚乳 酸( d e x c h p l a ) 纳米粒子。考察透析法制备纳米粒子时葡聚糖的取代度、透析 过程中的超声扰动、聚乳酸分子量等因素对纳米粒子粒径及形貌的影响；考察溶 剂挥发法制备纳米粒子时溶剂性质、葡聚糖胶柬溶液浓度、葡聚糖取代度、超声 功率等因素对纳米粒子粒径分布的影响，比较两种制备方法各自的优势和缺点。 动态光散射测得的粒径分布和透射电镜照片显示，以取代度为5 的 d e x c h ，在浓度0 ，5m g m l ，超声功率4 0 0w 的条件下，用溶剂挥发法可制备 出平均粒径在1 0 4n i l l 左右的，分布均一，形貌为规则球形的纳米粒子，适用于 长循环药物载体所需要的粒径和形貌。稳定性实验表明d e x c h p l a 纳米粒子 具有4 和3 7 下的稳定性，在冻干时d s = 2 的样品稳定性较差，其他取代度 的纳米粒子粒径变化不大。 以b s a 为模型蛋白考察d e x c h p l a 纳米粒子对血浆蛋白的非选择性吸附 性能。结果显示d e x c h p l a = 1 0 ：1 和d e x c h p l a = 3 ：1 的纳米粒子吸附 f i t c b s a 的量与胆酸钠作乳化剂的p l a 纳米粒子相比都有显著降低，说明 d e x c h 的表面修饰能够显著地降低p l a 纳米粒子对血浆蛋白的非选择性吸附。 以s p r a g u e d a w l e y 大鼠为动物模型，考察用9 9 m t c 放射性标记的d e x c h p l a 纳米粒子的血液半衰期和体内分布，以聚乙烯醇作稳定剂制备的p v a p l a 纳米粒 子作为参比。结果显示，d e x c h p l a 纳米粒子的血液半衰期为6 1m i n ，而 p v a p l a 纳米粒子的血液半衰期为1 3 8r a i n 。d e x c h p l a 纳米粒子在肝、脾、 肺等器官中的滞留严重，在肾中也有较严重的滞留，而在脑组织中几乎没有观察 到放射性。说明d e x c h 的表面修饰没有显著地改善p l a 纳米粒子的血液半衰期 和生物分布。这可以解释为d e x c h p l a 纳米粒子表面多糖链段的构象具有激发 补体系统的作用。 关键词：疏水改性葡聚糖；纳米粒子；血液循环时间；补体系统：构象 a b s t r a c t c h o l e s t e r o l 3 - h e m i s u c c i n y lc h l o r i d e w a ss y n t h e s i z e du s i n gc h o l e s t e r o la n d s u c c i n i ca n h y d r i d ei na n h y d r o l l sp y r i d i n e c h o l e s t e r o lh y d r o p h o b i c a l l ym o d i f i e d d e x t r a n ( d e x - c h ) w a s o b t a i n e d b y e s t e r i f i c a t i o no fd e x t r a nc h o l e s t e r o l 3 - h e r n i s u c c i n y lc h l o r i d eu s i n ga n h y d r o u sd i m e t h y ls u l f o x i d e ( d m s o ) a sas o l u t i o n a n dt e r e t h y l a m i n ea sac a t a l y s t s u b s t i t u t e dd e g r e ec a l lb ec o n t r o l l e db yt h er a t i oo f d e x t r a na n dc h o l e s t e r o l3 - h e m i s u c c i n a t e ，t h ea c t u a ls u b s t i t u t e dd e g r e ew a sd e t e r m i n e d t 0b e2 2 ，3 4 ，a n d8 b y1 h - n m rs p e c t r a c h o l e s t e r o lh y d r o p h o b i c a l l ym o d i f i e dd e x t r a n d e c o r a t e dp o l y ( d ，l l a c t i ca c i d ) ( d e x c h p l a ) n a n o p a r t i c l e s w e r e p r e p a r e d u s i n gd i a l y s i s a n do w e m u l s i o n e v a p o r a t i o nm e t h o d sr e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so fv a r i o u sf a c t o r s s u c ha s s u b s t i t u t e dd e g r e e ( d s ) o fd e x t r a n ，s o n i c a t i o nd u r i n gd i a l y s i sp r o c e s sa n dm o l e c u l a r w e i g h to fp l a e ta l o nt h es i z ed i s t r i b u t i o na n dm o r p h o l o g yo fd e x c h p l an p s w e r ei n v e s t i g a t e df o rt h ed i a l y s i sm e t h o d r 1 1 i l et h ee f f e c t so fa n o t h e rg r o u po f f a c t o r s ，s u c ha ss o l u t i o np r o p e r t i e s ，c o n c e n t r a t i o no fd e x - c h ，d sv a l u e so fd e x t r a n a n dp o w e ro fs o n i c a t i o ne ta 1 o ns i z ed i s t r i b u t i o no fn p sw e r ei n v e s t i g a t e df o ro w e m u l s i o n e v a p o r a t i o nm e t h o d t h e nt h e i rm e r i t sa n ds h o r t a g e sw e r ee v a l u a t e d t h er e s u l t so fd l sa n dt e mi n d i c a t e dt h a td e x c h p l an p sc a nb eo b t a i n e d w i t ha l m o s tu n i f o r ms i z e sa b o u t10 4n l i la n ds p h e r i c a lf i g u r e su n d e rt h ec o n d i t i o no f c d e x - c h = 0 5m g m la n dd s = 5 t h e s en p sw o u l da b s t r a c t l ys a t i s f yt h er e q u i r e m e n t s f o rl o n g c i r c u l a t i n g d r u gd e l i v e r ys y s t e m t h er e s u l t s o fs t a b i l i t y e x p e r i m e n t d e m o n s t r a t e dt h a ta l lo ft h ed e x - c hn p sa r es t a b l eu n d e r4 ca n d3 7 。c w h i l eo n l y t h ed s = 2 n p sw e r eu n s t a b l ew h e nf r e e z e d r i e d t h en o n s p e c i f i ci n t e r a c t i o no fd e x c h p l an p sw i t hb l o o dp r o t e i n sw a s e v a l u a t e du s i n gb o v i n es e r u ma l b u m i nf b s a ) a sam o d e lp r o t e i n 1 1 1 er e s u l ts h o w e d t h a tf i t c b s aa b s o r d e dm u c hl e s so n t od e x c h p l a 孑l o ：la n dd e x c h p l a = 3 ：l n p st h a n p l a 厂n p s ，s u g g e s t i n g t h a tt h ed e c o r a t i o no fa m p h i p h i l i cd e x t r a n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h en o n - s p e c i f i cp r o t e i na d s o r p t i o no n t op l a n p s 1 1 1 eb l o o dh a l f - l i f ea n db i o d i s t r i b u t i o no f 蜘t c 1 a b e l l e dd e x c h p l an p s w e r ei n v e s t i g a t e du s i n gs p r a g u e d a w l e yr a t sa sm o d e la n i m a l s 。i tw a se v a l u a t e d c o m p a r e dt op v a p l an p s w h i c hw a sp l an p ss t a b i l i z e db yp v a t h eh a l f - l i f eo f d e x c h p l aw a sf o u n dt ob e6 1r a i n w h i l ep v a p l an p sw a s1 3 8m i n a c c u m u l a t i o no fd e x c h p l an p si nl i v e r ，s p l e e n ，l u n g sw a sr a t h e rm u c ha n da l s o i nk i d n e y ，b u ta l m o s tn or a d i o a c t i v i t yw a so b s e r v e di nb r a i n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tt h es u r f a c ed e c o r a t i o no fd e x c ht op l ac o u l dn o ts i g n i f i c a n t l yp r o l o n gt h e b l o o dc i r c u l a t i o nt i m eo fp l an p sn o ri m p r o v et h e i rb i o d i s t r i b u t i o n 。t h i sc o u l db e a t t r i b u t e dt ot h ec o n f o r m a t i o no fd e x 仃a nc h a i n so nt h ep l an p s s u r f a c e ，w h i c hw a s s u g g e s t e d t ob eas 仃o n ga c t i v a t o ro ft h ec o m p l e m e n ts y s t e m k e y w o r d s ：h y d r o p h o b i c a l l ym o d i f i e dd e x t r a n , n a n o p a r t i c l e s ，b l o o dc i r c u l a t i o n t i m e ，c o m p l e m e n ts y s t e m ，c o n f o r m a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人己经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨叠盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 阼了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：马艾冬签字日期： 哆年多月? 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞童盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 争授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 耄，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 日国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) j 位论文作者签名： 马文爿 导师签名： 翱期：冲多月舯 签字吼 月7 藏救 乡月加 第一章绪论 第一章绪论 1 1 聚合物纳米粒子作为药物投递和控释载体 1 1 1 纳米药物载体的优势 药物与适当的载体结合，可以实现按照治疗的需要在特定部位控制释放药 物。载体按大小可以分为纳米级的胶体载体，微米级的微粒以及几个毫米大小的 植入型载体。近些年来，已有大量的研究集中于药物投递的纳米技术的开发【l 】。 纳米载体以其小尺寸和高比表面效应为药物控制释放的研究提供了一种新的方 法。归纳起来，纳米药物具有以下优势【2 j ： ( 1 ) 纳米载体尺寸小，是一种比人体组织细胞还小的超微小药物载体，可 以以流动形式给药，甚至可以制成静脉注射剂。毛细血管腔直径大约几个微米， 纳米级药物载体可以进入毛细血管，在血液循环系统中自由流动，还可以穿过细 胞，被组织和细胞以胞饮的方式吸收，大大提高了生物利用度。 ( 2 ) 纳米载体的比表面积高，水溶性差的药物在纳米载体中的溶解度相对 增强，克服了无法通过常规方法制备成制剂的难题。 ( 3 ) 许多半衰期短的药物可能需要每天重复给药多次，制备成缓释载药纳 米微粒将极大地延长药物的半衰期。甚至可能制成微小的直接包含药物工厂的分 子机器，在体内循环过程中制造出治疗所需的药物，解决许多需长期用药治疗的 疾病，如高血压、冠心病、糖尿病等的用药问题。 ( 4 ) 能解决口服易水解药物的给药途径问题。多肽类、蛋白质类、酶类及 某些抗生素类药物口服后易被胃酸或胃肠道消化酶所破坏，因此只能通过注射给 药，这样它们的使用受到了极大的限制。纳米药物有可能从根本上解决这一问题。 ( 5 ) 纳米载体经还可以通过偶联某种或某几种生物靶向因子制成靶向定位 系统，更精确地针对组织或器官定向给药，减少药物的不良反应。许多有良好的 药理作用的药物进入人机体之后不能到达治疗部位，或在治疗部位的浓度远低于 血药浓度，使得此类药物因严重的不良反应而应用受限。将药物制成纳米制剂， 如磁性载药纳米微粒，更易于实现靶向给药，减少毒副作用。 ( 6 ) 可消除特殊生物屏障对药物作用的限制。机体有许多保护机体不受损 害的天然生物屏障，如血脑屏障、血眼屏障、细胞生物膜屏障等，给一些病变的 治疗带来困难。纳米载药微粒可能穿过这些屏障部位，治疗某些目前不得不进行 第一章绪论 手术的疾病，减轻患者的痛苦。 j a y 柚山等人的研究证实【3 】粒子尺寸的大小明显地影响细胞和组织的摄取， 并且在一些细胞系( 如h e p a1 - 6 ，h e p g 2 ，和k l n2 0 5 ) 中，只有微米级以下的 粒子才能够被有效地摄取，而微米级的粒子却不能。 1 1 2 可降解聚合物材料作为药物载体 目前药物载体材料大多是高分子材料。高分子材料包括天然高分子材料、改 性的天然高分子材料和合成高分子材料。传统药物的载体大多是无机物质。随着 药物制剂的发展，新剂型的出现，高分子材料具有的优良性能，使它在药物载体 中的地位越来越重要。 用作药物载体的高分子材料性能应该满足以下要求【4 】： ( 1 ) 具有生物相容性和生物降解性，即载体材料能在体内降解为小分子化 合物而被机体代谢、吸收或排泄。如果不能降解，则需要在药物释放后通过外科 手术取出； ( 2 ) 高分子的降解产物须无毒和不发生炎症反应： ( 3 ) 高分子的降解必须发生在一个合理的期间； 给药途径不同，对于载体体系的高分子载体材料要求也不同。对用于体内的 药物载体体系的高分子载体要求较高，而对于经皮给药的高分子载体要求相对较 低。生物降解高分子比生物惰性材料更安全、可靠，从而逐渐取代了生物惰性材 料，成为在体内使用的首选材料。 ， 1 1 3 生物降解高分子的降解机理 生物降解高分子材料的降解机理：生物降解高分子材料的降解分为本体降解 ( 均相降解) 和表面降解( 异相降解) 。本体降解过程是降解在整个材料内同时 发生，表面降解是降解从表面先发生，由表及里。高分子材料在体内降解涉及的 反应有水解、酶解、氧化等。对大多数生物降解材料来说，尤其是合成的高分子 材料，降解过程主要是水解反应。其形式是：直线型高分子主链内不稳定键断裂； 主链为线型而带侧链的高分子侧链基团的水解；交链网状高分子内不稳定交联链 的断裂；通过以上三种形式使聚合物分子变小，达到降解的目的。 影响水解反应的因素有：( 1 ) 分子链中是否有易水解键，如酸酐和原酸酯最 易水解，其次为酯键和酰胺键。( 2 ) 材料的结晶性、分子量等。例如结晶性的聚 乳酸( p ( l l a ) ) 降解要慢于非晶态的聚乳酸( p ( d l l a ) ) 。( 3 ) 亲水疏水性 以及环境中的p h 值等。由于疏水聚合物吸水少，故降解速度慢。而亲水性聚合 2 第一章绪论 物可吸收大量水分，故降解速率快。特别是含有羟基、羧基的高分子，不仅因为 它们其有较强的亲水性，而且由于其自身的自催化作用，所以比较容易水解。另 外，不同的p h 值下聚合物的降解速率也是不同的，聚酯在碱性和酸性环境中降 解较快，而在中性介质中降解最慢。 1 1 4 脂肪族聚酯作为药物载体 生物降解性高分子材料的药物释放速度可以通过调节载体材料的降解速度 来控制，合成生物降解高分子比天然的生物降解高分子降解速度更易调控，力学 性能也更好、更全面，正逐渐取代天然的生物降解高分子。在这些合成的生物降 解聚合物中，聚乳酸( p l a ) 和聚( 乳酸羟基乙酸) 共聚物( p l g a ) 是被研究 得最为广泛的药物载体【5 儿6 1 。这两种聚合物都是被美国f d a 批准应用于临床的可 降解吸收材料。作为脂肪族聚酯，这些聚合物可以在体内水解成为生物相容的和 能够代谢的成分( 乳酸和羟基乙酸) ，最终通过柠檬酸循环被排除体外f 引。由于 聚合物的降解产物以非常慢的速率产生，所以它们不影响正常的细胞机能。这些 聚合物的毒性和安全性已经通过大量的动物实验测试，并且已经应用于人体临床 作为可吸收的手术缝合线、骨埋植剂和避孕埋植剂【7 】。另外，它们还被用作人工 器官的移植材料，也被应用于组织工程中的承载装置【8 】。 1 2 纳米粒子血液循环时间及其体内分布 1 2 1 免疫与免疫系统 1 2 1 1 免疫的概念和免疫作用 免疫( i m m u n e ) 是机体识别“自身”和“非己”抗原，对自身抗原形成天然免疫耐 受，对“非己”抗原产生排异作用的一种生理功能【9 】。正常情况下，这种生理功能 对机体有益，可产生抗感染、抗肿瘤等维持机体生理平衡和稳定的免疫保护作用。 在定条件下，免疫功能失调，也会产生对机体有害的反应和结果，可引发超敏 反应、自身免疫性疾病和肿瘤等。免疫功能是免疫系统识别和清除“非己”抗原过 程中所产生的各种生物学作用的总称，主要包括以下三方面的内容。 1 、免疫防御( i m m u n o l o g i c a ld e f e n s e ) 是机体排斥外来抗原性异物的一种免 疫保护功能。免疫防御功能正常的情况下，机体可以抵抗病原微生物及其毒性产 物的感染和损害，此即抗感染免疫；在异常的情况下，免疫防御反应过高会引发 超敏反应，反应过低或缺如可发生免疫缺陷。 3 第一章绪论 2 、免疫自稳( i m m u n o l o g i c a lh o m s e o s t a s i s ) 是机体免疫系统维持内环境相对 稳定的一种生理功能。在免疫自稳功能正常的情况下，机体可及时清除体内损伤、 衰老、变性的血细胞和抗原，抗体复合物等抗原性异物，而对自身成分则保持免 疫耐受。若免疫自稳功能失调，则可发生生理功能紊乱或自身免疫性疾病。 3 、免疫监视( i m m u n o l o g i c a ls u r v e i l l a n c e ) 是机体免疫系统及时识别、清除 体内突变、畸形细胞和病毒感染细胞的一种生理性保护功能。若此功能失调，体 内突变细胞失控，有可能导致肿瘤发生，或因病毒不能清除而出现病毒持续感染 状态。表1 1 概括了免疫系统的三大功能的生理和病理表现。 表l 一1 免疫系统的三大功能和生理病理表现 t a b l ei - lt h r e em i a nf u n c t i o n sa n dp h y s i o l o g i c a l p a t h o l o g i c a lr e p r e s e n t a t i o n so fi m m u n es y s t e m 1 2 1 2 免疫系统 哺乳动物的免疫系统是固有免疫系统( i n n a t ei m m u n es y s t e m ) 和适应性免疫 系统( a d a p t i v ei m m u n es y s t e m ) 叠加的产物。前者是基础防线，而后者则更为特 异且具有记忆的特点。两个系统互相协作、互补，为机体提供有效的抗感染免疫 防护。 免疫学上的固有免疫的概念主要是指为生物进入机体内部之后所遇到的有 免疫细胞和体液分子所引起的即刻应答。固有免疫系统的可溶性分子以补体 ( c o m p l e m e n t ) 为代表。由数十种血清蛋白组成的补体系统能够直接造成微生物 的外膜穿孔，还能对它们进行“标记”，使之更容易被免疫细胞识别。 固有免疫细胞包括肥大细胞( m a s tc e l l s ) 、巨噬细胞、天然杀伤( n a t u r a lk i l l e r , n k ) 细胞、中性粒细胞。肥大细胞主要分布在皮肤、黏膜下组织和血管壁周围 等微生物进入机体所必经的要道。肥大细胞含有大量的胞质颗粒，识别微生物后 通过释放胞质颗粒中的炎症因子来给免疫细胞发出紧急情况的信号，召集白细胞 到炎症的部位来参加战斗。巨噬细胞是微生物穿过体表之后所遇到的第一道主要 防线。它们能够吞噬并消化侵入机体组织的病原微生物。占外周血白细胞总数 2 3 的中性粒细胞能够在趋化介质( c h e m o t a c t i cf a c t o r s ) 的趋化下穿出血管壁、 迅速抵达发生感染的组织部位，执行吞噬与消化微生物或其他异物的功能。中性 4 第一章绪论 粒细胞和巨噬细胞统称吞噬细胞。 适应性免疫系统也称作特异性免疫系统( s p e c i f i ci m m u n es y s t e m ) ，其主要 特点之一是其能够区分不同微生物或者抗原之间的微细差异。t 和b 淋巴细胞是 适应性免疫系统的主力军。t 细胞和b 细胞通过各自表达的t 细胞受体( tc e l l r e c e p t o r s ) 和b 细胞受体( bc e l lr e c e p t o r ) 识别抗原。适应性免疫应答可以分为 细胞免疫应答和体液免疫应答，分别由t 和b 淋巴细胞介导。 免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。如表1 2 所示： 表卜2 免疫系统示意图 t a b l e1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fi m m u n es y s t e m 免疫系统 1 2 1 3 免疫器官 造血干细胞 造血干细胞 rt 淋巴细胞 粑驰慷娑巍峨景 l 第三群淋巴细剧一二： f 单核吞噬细胞 i 树突状细胞 抗原呈递细胞 l 朗格汉斯细胞 【b 淋巴细胞 其他免疫细胞j 红细胞 。中性粒细胞 免疫分子 蓁垂因子 在人类，骨髓和胸腺是免疫细胞发育、成熟的组织部位。脾脏、黏膜淋巴组 织以及遍布全身的淋巴结等外周免疫器官是免疫应答的主要组织部位。 1 2 2 影响纳米粒子血液循环时间和体内分布的因素 1 2 2 1 纳米粒子的清除机理 5 织组巴 囊 淋 上 的 腔 关 j 、 结 有 髓 腺巴脏膜 制 胸淋删槲 j 弋，刮0 器 器 疫 疫 免 免 枢 周 中 外 ，i蒯广一 器疫免 第一章绪论 载药纳米粒子经静脉注射进入血液循环后可能很快被机体清除，不能到达 效应器官或组织处发挥作用，因此，如何延长纳米载体在血液循环中的流通时问 进而获得针对特定部位的靶向性是设计纳米药物载体需要考虑的重要因素h 】。 纳米载体在血液循环中被清除的机理主要有以下两个方面一是网状内皮系 统的清除作用，二是机体内毛细血管床的滤过作用。 ( i ) 网状内皮系统的清除作用 吞噬细胞( 除粒细胞外) 和血液内的单核细胞以及骨髓和淋巴器官内的网状 细胞和内皮细胞共同熄纳为一个系统，成为网状内皮系统，该系统包括结缔组织 的巨噬细胞、肝的库弗细胞、肺的尘细胞、神经组织的小胶质细胞、骨组织的破 骨细胞、表皮的朗格汉斯细胞和淋巴组织内的交错突细胞等，可吞噬清除进入机 体内的异物。微粒进入血液循环以后，可能很快被血液中的单核细胞或巨噬细胞 吞噬并清除，或被网状内皮系统吸收而分布于肝、脾和肺部，这种效应是纳米粒 子的被动靶向性之一。 0 ：； 件物 图i - i 单核巨噬细胞系统的巨噬细胞吞噬异物示意图 e gi - is c h 锄a t i cr e p m l i o no f p h a g o c y m s i sb yr n a c m p h a g co f m p s ( m o n o n u c l 哪 p h a 9 0 c y t i cs y s t e m ) 巨噬细胞广泛分布于机体的各种组织，便于机体识别并清除变异和衰老的细 胞、外来异物等。胶体微粒经静脉注射进八血液循环后，会很快被血液中的单核 细胞或巨噬细胞及肝脏的库弗细胞吞噬巨噬细胞的这种吞噬作用可以帮助药物 载体系统有效地将药物分子传输到这些细胞中， 日是在靶向其他的巨噬细胞类群 或非巨噬细胞部位时，这种作用却成为一个严重的问题。 大量的研究表明外源性药物载体颗粒的清除及组织分布特性受其尺寸大小 及表面特性的影响【1 0 卜【l “。调理作用是指进入血液循环后，异物颗粒能够结合某 些物质( 调理素) ，这些物质又能够与单核细胞或巨噬细胞表面的受体结合，促 第一章绪论 进微粒被这些细胞识别和吞噬。常见的调理作用的分子包括；免疫球蛋白、补体 蛋白、载脂蛋白、血小板凝血酵敏謦蛋白，v w t ! l e b r a 州l 因子等。 在正常的生理情况下，绝大多数补体固有分子均以酶原或活化形式存在于血 清中，只有被某些物质澈活后，补体各固有成分才能按一定的顺序呈现酵促连锁 反应，并在澈活过程中产生多种具有不同生物学活性的蛋白片断，最终形成细胞 溶解破坏的膜攻击复合物。这些补体活化片断和复合物或直接作用或通过补体受 体的介导引发多种生物学效应，如促进吞噬和细胞溶解作用等，从而增强机体免 疫防御功能。 8弋乡 目i菌存啦绑眦细曲 ， 一l 田1 - 2 补体的抗盛染免疫作用 f i g t l - 2 a n 昏m 删h 口岫o f c e m p l e m e m 因此，具有不同表面特性、尺寸和形状的颗粒吸引的调理素或者其他血浆蛋 白的种类不同，因此从血浆中清除的部位和速度也不同。认识不同载体材料对调 理素的反应是设计适当的长效、靶向载体系统的首要步骤。 目前克服巨噬细胞吞噬作用的方法有多种，例如可以预先用大剂量的空白载 体破坏血液中巨噬细胞的吞噬能力，然后注射载药微粒；或者通过暂时地诱导肝 脏或脾脏巨噬细胞凋亡后再使用载药微粒。但这些方法会对机体的免疫系统造 成一定的损害，因此在临床上的应用价值不高。改变纳米微粒的表面性质形状 尺寸等特性，降低它与血液中蛋白质间的相互作用是一种更可行的方法。具体 的表面改性方法将会在下一节中讨论。 ( 2 ) 毛细血管床的滤过作用 纳米载体的尺寸必须足够小，以保证进入血液循环后，不会因为简单的排阻 作用而清除。例如，纳米载体经鼠尾静脉注射后遭遇的第一个毛细血管床是肺毛 第一章绪论 细血管，如果颗粒太大，则大部分药物滞留在肺部。另外，纳米载体的稳定性必 须足够强，否则贮存过程中或进入血液后会因为发生微粒聚集而增大体积，被毛 细血管床排阻，甚至堵塞毛细血管腔。肺毛细血管直径最小的仅为乱8l a r n ，如输 入的微粒直径超过肺毛细血管直径，可直接堵塞肺毛细血管。 由于肺毛细血管数量远远多于气体交换所需的数量。所以部分毛细血管为颗 粒阻塞时，肺循环不受影响。受阻于肺毛细血管的颗粒被吞噬细胞吞噬、特异溶 酶消化而去除，使肺毛细血管重新开放。心脏直视手术时，血液越过肺部经氧合 泵循环，肺的过滤功能便完全缺失。 纳米粒子的大小和变形能力在脾脏窦状隙的清除作用中起着关键的作用。脾 静脉窦中的内皮细胞间隙( i e s ，i n t e r e n d o t h e l i a lc e l ls l i t s ) 很少超过2 0 0 5 0 0 n l i l ， 长效纳米粒子的粒径最好不要超过2 0 0i l m ，如果体积更大，则要求微粒有足够 的变形能力可以绕过i e s 的过滤作用。大于2 0 0r i m 的微粒可以作为脾脏局部释 药的长效载体。 ，t 图1 3 脾血窦结构示意图( 1 ) 收缩状态；( 2 ) 扩张状态 f i g 1 3s k e t c hm a po fs p l e e na n t r u ms t r u c t u r e ( i ) f o l d e ds t a t e ；( 2 ) u n f o l d e ds t a t e 然而纳米粒子的尺寸也不能太小。肾脏肾小球内皮细胞问的间隙约在4 0 - 6 0 1 0 1 1 之间，过小的纳米粒子可能被滤出。 而在肝脏窦上皮等的位置，由于毛细血管开窗，纳米载体可能穿出血液循环 系统而进入组织内。因此，要使纳米载体在血液循环中的流通时间增加，必须控 制载体的大小范围。例如，有实验证明，脂质体粒子越小，如直径小于1 0 0i i l t i ， 则在肝细胞中的分别越多。 如果载体的变形能力很强，则更大的粒子也可能穿过窦上皮进入组织。对于 具有刚性结构的载体而言，大小在1 2 0 2 0 0n m 时，可以有效地防止它进入d i s s e 腔和肝实质。 8 第一章绪论 图l 一4 肾小球微细结构模式图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h em i c r o s t r u c t u r eo fg l o m e r u l u s 1 2 2 2 循环时间和体内分布的影响因素 从上面的讨论可以得出，纳米粒子在体内循环时问和体内分布的影响因素可 以归结为以下几个方面【1 3 】： 一、纳米粒子的理化性质 1 纳米粒子表面的亲水性和亲脂性 纳米粒子表面的亲水性与亲脂性影响到纳米粒子与调理蛋白吸附结合力的 大小，从而影响到吞噬细胞对其吞噬的快慢。一般而言，纳米粒子的表面亲脂性 越强则其对调理蛋白的结合力越强，吞噬细胞对其吞噬作用也就越强。故要延长 纳米粒子在体内的循环时问，则需要增加其表面的亲水性，这是对纳米粒子进行 表面修饰时选择材料的一个必要条件。 2 纳米粒子的表面电荷 纳米粒子的表面电荷影响到纳米粒子与体内物质( 如调理素等) 的静电作用 力，由于体内的因素较为复杂，经典胶体科学中的扩散双电层力量很难描述纳米 粒子与体内物质的吸引与排斥。较为一致的看法是，负电荷表面往往使纳米粒子 相对于正电荷或中性表面更易被清除，而中性的表面最适合用于延长纳米粒子在 体内的循环时间。 例如，s e n i o r 等人用等摩尔量的饱和磷脂和胆固醇制备的小于1 0 0l l n l 的中 性单层脂质体载体在大鼠体内的半衰期可达2 0h 。而相应的阴离子脂质体对照， 半衰期不到lh 。增大脂质体的尺寸，其清除速率也很快增大。因为进入机体后， 脂质体主要是在补体的调理作用下被吞噬，相对于阴离子脂质体，中性脂质体激 活补体的能力更差，小尺寸的中性脂质体不能有效地被补体蛋白所包被，从而不 9 第一章绪论 易被库弗细胞等吞噬细胞识别。而随着尺寸的增加，其激活补体的效率也增加了。 3 纳米粒子的粒径 粒径是决定药物载体传递系统亚微粒体内过程的最重要的因素之一。作为动 脉栓塞的微球，其粒径一般应在5 0i n n 以上。要使亚微粒能够顺利地通过体内的 毛细血管( 如前面讨论的肺部毛细血管床) ，则其粒径至少要小于5 眦。纳米粒 子的粒径一般要小于l1 t m ，但要使纳米粒子不被肝脏和脾脏的窦状小管截流， 其粒径最好要小于2 0 01 3 1 1 1 。但并不是纳米粒子的粒径越小越好，粒径小于7 0n l y l 时，胶体微粒在肝脏的聚集现象已经较为明显。总之，构建体内长循环纳米粒子 时较好的粒径范围是7 0 2 0 0n n l 。 4 化学组成 纳米粒子的化学组成尤其是表面的化学基团对纳米粒子与调理蛋白的作用 有选择性的影响。一般而言，纳米粒子的表面不应含有以下基团：羟基，羟基 易被免疫系统的补体c 3 选择性识别，因此具有羟基的物质不适于对纳米粒子进 行表面修饰。氨基，氨基易被免疫系统的补体c 4 选择性识别，因此具有氨基 的物质也不适于对纳米粒子的表面进行修饰，如多熔素。然而这一因素并不绝对， 有文献表明以富含羟基的多糖修饰的氧化铁纳米微粒具有较长的血液循环时间。 二、纳米粒子表面分子的空间位阻作用 纳米粒子的空间位阻作用对于纳米粒子的稳定性及其循环时间与体内分布 有显著地影响，也是对纳米粒子进行表面修饰的最主要原因。纳米粒子与纳米粒 子之间以及纳米粒子与体内环境之间有着复杂的作用，空问位阻排斥力相对于静 电排斥力能更有效地克服范德华力的吸引。如果纳米粒子表面有较好的空间位阻 作用，则其与体内调理蛋白的吸附作用就会减弱，从而延长血液循环时间。 对纳米粒子的表面用亲水性长链进行修饰是使纳米粒子具有空间位阻的有 效方法。其表面修饰的效果受以下因素的影响。 1 纳米粒子表面修饰长链的柔韧性 长链的柔韧性使纳米粒子的空间结构时刻发生着变化，从而使免疫系统难以 对其产生有效的识别。长链的柔韧性能有效地减少体内调理蛋白对纳米粒子的吸 附。 2 纳米粒子表面修饰长链的长度 胶体理论可以用来解释纳米粒子表面修饰长链的长度与纳米粒子稳定性的 关系，链的长度对链的柔韧性也有显著的影响，链的长度越长，其柔韧性越好， 但是当链过长时易产生重叠结构而影响空间位阻的作用。对于粒径为1 0 0 衄的 纳米粒子而言，最适宜的链长度为5 1 0n l r l 。 3 纳米粒子表面修饰长链之间的距离 l o 第一章绪论 对纳米粒子进行表面修饰的链之间有适宜的距离，即有一定的密度才能有效 地阻止调理蛋白通过长链间的空隙与纳米粒子的核发生作用。人体的调理蛋白粒 径多在6 8n m 左右，而较小的只有2n m ，对纳米粒子进行表面修饰的长链之问的 距离应在1 1 5n m 。 1 2 3 延长纳米粒子体内循环时间的方法 早期避免纳米粒子在体内被m p s 快速清除而延长其在体内的循环时间的方 法有以下几种：提前给予“致哑”剂量的胶体微粒使m p s 饱和。使用m p s 抑 制剂。这两种方法都易使m p s 本身受到损伤，有加重病情的可能，因此不适合 于临床应用。物理靶向的方法，如在纳米粒子中加入磁性物质，通过外加磁场 将其导向靶位，这种方法对于浅表病灶而外加磁场容易触及的部位具有一定的可 行性，对于深部病灶则不适用。使纳米粒子具有免疫学活性，如将单克隆抗体 ( m c a b ) 共价交联或吸附到纳米粒子的表面。免疫活性纳米粒子在体外有良好 的避免r e s 吞噬的作用，在体内不能清除r e s 对其快速的摄取。这是因为m c a b 中的f c 片段易被r e s 识别，如果仅以f a b 片段制备免疫活性纳米微粒可能改变 这一现象。提前静脉给予一定量的表面活性剂( 如p o l o x a m i n e 9 0 8 ) ，再静脉注 射纳米粒子。这样可以使纳米粒子的体内循环时间加长，其结果与纳米粒子在体 外被p o l o x a m i n e 9 0 8 表面修饰的效果相似。 上述各种方法在某些方面有一定的实用价值，但在延长体内循环时间方面都 不具有广泛的代表性，在制备上也有一定的难点。其他的研究则集中于对胶体微 粒物理化学性质的调整上，如表面电荷、表面亲水性、粒径、粒形等。 近年来，对纳米粒子进行表面修饰的研究日益活跃，概括起来包括以下几个 方面： 用表面活性剂进行包衣处理。主要是增强了n p 表面的亲水性，还可能产 生较好的空间位阻作用。般认为包衣厚度在1 0n l n 以上时能够有效地发挥其空 间位阻作用。 在n p 表面交联p e g 或聚丙烯酰胺等。一般是通过联结有p e g 的高分子 材料来制备n p 。p e g 具有很好的亲水性，p e g 长链还可以产生较好的空间位阻 作用和表面柔韧性，使血液中调理蛋白对胶体微粒的黏附性下降，从而降低r e s 吞噬细胞对胶体微粒的识别。 对补体系统的抑制。如前所述，补体系统在吞噬细胞对n p 的摄取过程中 具有重要的作用，因此利用肝素或神经节苷脂等抑制补体系统的活性，也可以延 长n p 在体内的循环时间。 利用n p 表面电荷的作用。目前认为负电荷的纳米微粒具有较强的淋巴系 第一章绪论 统亲和力，相反，表明带阳离子和中性粒子的微粒相对不易被r e s 识别。总之， 降低调理蛋白对胶体微粒的黏附性，是减弱r e s 吞噬作用、增强其体内循环时 间的主要方式。 下面就纳米粒子的表面修饰进行讨论： 1 2 3 1 纳米粒子的表面修饰 目前对纳米粒子的表面修饰有很多策略1 1 4 ，大部分是利用物理吸附作用在疏 水粒子表面覆盖一层亲水性聚合物。用来得到亲水性表面最常用的聚合物之一就 是p o l y ( e t h y l e n eo x i d e ) ( p e o ) 和p o l y ( p r o p y l e n eo x i d e ) ( p p o ) - - 系列的线性和接枝共 聚物( p l u r o n i c t e t r o n i c t mo rp o l o x a m e r p o l o x a m i n e t m ) t 1 5 】【】6 】。另外一种方法就是 合成双亲性共聚物，其中，疏水的部分位于粒子内部，形成固相：而亲水部分保 持在表面形成保护层。例如p e g 和p o l y ( 1 a c t i d e g l y c o l i d e ) 的双嵌段共聚物 p e g p l a g a 1 7 1 ，或p e g 和 n h e x a d e c y l c y a n o a c r y l a t e 的双亲段共聚物 p e g p h d c a 18 1 。另外，t r i l e y 1 9 1 等利用小角中子散射( s a n s ) 专门研究了作 为药物载体的p l a p e g 纳米粒子的核壳结构。p l a - b p e g 嵌段共聚物的制备通常 是采用聚乙二醇单甲醚与乳酸或丙交酯缩聚方法制备，或采用末端带有反应基团 的p e g 与丙交酯共聚，末端带有反应基团的p e g 是通过带有保护功能基团的烷氧 基钾引发环氧乙烷聚合来制备，整个反应可在同一反应器内完成。 t r o s t e r 2 0 j 等研究了聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 和表面活性剂包被的p m m a 的体内分布，所有的表面活性剂都降低了肝对粒子的摄取，并且增加了机体其他 部位的分布。 p a s s i r a n i 2 l 】等利用肝素( h e p a r i n ) 和葡聚糖( d e x t r a n ) 合成- j h e p a r i n p m m a 、 d e x t r a n p m m a 的双亲性共聚物，并考察了其血液循环时间。结果表明，两种双 亲性共聚物都获得了较长的血液循环时间，两