（发酵工程专业论文）酯合成脂肪酶高产菌的选育及其产酶发酵调控的研究.pdf

摘要 中文摘要 非水相中脂肪酶催化的酯合成反应已广泛用于各种酯的合成，并且也成为近二十年 来脂肪酶催化的研究热点。由于并不是所有的脂肪酶都能催化非水相中的酯化反应，造 成了现有脂肪酶中能有效催化酯合成反应的酶并不多，必须开发新的具有高酯合成活性 的脂肪酶。 本文以获得高酯活性脂肪酶为目标，首先建立了一种能快速筛选具有酯合成能力脂 肪酶的筛选和酶活测定方法，然后以一株根霉r 办忍印獬如f ，2 p 珊西y 9 2 为出发菌，采用离 子束和亚硝基胍进行诱变，以建立的方法进行初筛，最终筛选得到一株脂肪酶高产菌 r 砌f 船p 瑚括y 9 2 m ，并对其培养条件进行了优化。深入研究了影响具有酯合成活性脂肪 酶合成的主要因素，并对该菌所产胞内脂肪酶进行了详细分析，揭示了全细胞脂肪酶水 解与合成活力之间的关系，找到了控制酯合成活性脂肪酶大量合成的手段。针对丝状真 菌形态变化对生产的影响，详细研究了摇瓶和发酵罐中形态变化对酶合成的影响。并将 全细胞脂肪酶用于酯的合成和生物柴油的生产，具体内容和结果： ( 1 ) 为了能筛选得到酯合成活性高的脂肪酶生产菌，本文建立了一种非水相中用于 具有合成活性脂肪酶筛选和活力测定的新方法。该方法的原理是利用脂肪酶在正庚烷中 催化对硝基苯酚棕榈酸酯( p n p p ) 和乙醇之间的转酯化反应，然后用n a o h 溶液快速 萃取生成的对硝基苯酚并在4 1 0 衄检测吸光度。该法与其它已经报道的类似方法相比， 所需仪器简单，底物廉价，操作简单，因此筛选效率得到了有效提高。 ( 2 ) 以r 砌拥p 瑚括y 9 2 为出发菌，采用两轮离子束注入诱变，并结合亚硝基胍诱变， 以所建立的方法作为初筛方法，以气相测定酯合成能力作为复筛方法，筛选得到一株酯 合成活性显著提高的菌株r 幽f ，z p 瑚毋y 9 2 m ，该菌单位菌体的合成活性由2 0 0u g ，提 高到4 0 0u g 。 ( 3 ) 为了进一步提高该菌的产酶能力，对培养条件进行了优化。首先采用田口设计 对培养条件进行了初步优化，对四个培养基组成因素( 麦芽糖、橄榄油、蛋白胨、和 k 2 h p 0 4 ) 和四个环境因素( 摇床转速、接种量、p h 和装液量) 进行了考察，结果分析 表明环境因素对产酶影响更显著。通过响应面对培养条件进一步优化得到最优培养条 件：接种量4 2 5 1 0 8s p o r e s l ，橄榄油2 3 7 ( w ，v ) ，装液量2 1m l 2 5 0 n 儿，蛋白胨4 0 6 ( w v ) ，麦芽糖0 5 ( w ，v ) ，k 2 伸0 40 3 ( 、7 l ，v ) ，摇床转速2 0 0r m i i l ，p h5 5 。预测全细 胞脂肪酶的最大酶活产率为1 4 3 4 9 2l 儿，验证性实验在最优条件下，r 如伽明s 括y 9 2 m 产具有酯合成活性全细胞脂肪酶可达1 3 8 7 5u l 。 ( 4 ) 通过培养基中添加不同类型、不同量的脂肪酸或脂肪酸酯，考察了发酵过程中 全细胞脂肪酶水解活性与合成活性的关系。结果表明，全细胞的水解活性受各种脂肪酸 和脂肪酸酯的诱导作用并不明显，而碳链大于1 8 的脂肪酸或者脂肪酸酯对全细胞合成 活性有显著的诱导作用，最高酶活力是未加油脂的培养基条件的1 7 倍。 ( 5 ) 对细胞各部分的蛋白组分的分析结果表明，胞内脂肪酶具有水解活性而不具备 江南大学博士学位论文 合成活性。膜结合蛋白具有很好的酯合成活性，同时也具有水解活性。该微生物对具有 酯合成活性脂肪酶的调节既表现在酶量的调节，也表现在酶活性的调节。酶量的调节体 现在具有酯合成活性的脂肪酶为典型的诱导型酶：当诱导物三甘酯添加量大于2 0g l 时，能维持酶活在6 5 0u 儋，当诱导物量不足时酶活迅速下降；具有合成活性脂肪酶的 高产的条件除必须有油脂添加外，细胞还必须与油脂充分接触，解除这种接触状态，酶 的合成即停止。酶活性的调节则体现在全细胞水解活力的变化上：具有高合成活性的全 细胞的水解活性并不高，而实际上具有合成活性的膜结合脂肪酶水解活力可达5 6u ，m g 。 对不同培养时间的细胞各部分的蛋白组分的分析，推测造成全细胞表观水解活力和合成 活力不对应的原因是膜结合脂肪酶存在变构调节。 ( 6 ) 研究了不同三油酸甘油酯添加量对产酶的影响，提出了油脂流加策略。摇瓶中 采用油脂流加方式也可以使得酶活力保持在6 5 0u g ，酶活产率1 3 0 0 0 肌左右，而油 脂总添加量只需1 5g l 。发酵罐中的菌体生长与产酶过程和摇瓶相比存在较大差距，油 脂补料发酵并不能达到摇瓶的产酶效果。 ( 7 ) 通过对摇瓶过程和发酵罐过程中菌丝微观和宏观形态的观测和分析，发现菌丝 微观和宏观形态变化对膜结合脂肪酶的合成影响非常显著。摇瓶过程中，聚集状态( 块 状，球状，固定化) 下的菌丝直径稍宽，菌丝生长单位多，菌丝未出现分化现象；而松 散状态下的菌丝直径稍窄，菌丝体到生长后期出现分化现象，并有膈出现。聚集状态细 胞的酶活力是松散状态细胞酶活的3 倍，说明菌丝聚集有利于膜结合脂肪酶的合成。通 过对发酵罐中菌体形态变化以及发酵液流变特性的研究，发现小球状菌丝细胞有利于产 酶，而松散状菌丝细胞不利于产酶。对发酵液流变特性的测定结果表明，球状菌体下的 发酵液流动性要明显好于松散状菌体，有利于油脂的分散。载体固定化同时满足了茵体 形态呈聚集状和细胞必须和油脂充分接触两个酶高产的必要条件，因此固定化细胞经发 酵罐培养后酶活能达到4 0 0u g 。 ( 8 ) 为了验证r 如砌p 珊如y 9 2 m 所产全细胞脂肪酶在非水相中的催化能力，将该酶 和两种具有高酯合成活性的商品化脂肪酶n o v 0 4 3 5 和a m a l l op s c 的酯合成能力进行比 较，结果显示y 9 2 m 所产全细胞脂肪酶具有很好的酯合成能力。 ( 9 ) 考察了该酶在正庚烷体系中催化脂肪酸乙酯的能力，当直链脂肪酸浓度为0 6 m 0 1 l 时，该酶对碳链大于6 的脂肪酸有较好的选择性，转化率可达9 0 以上。实验结 果还表明，该脂肪酶与出发菌所产脂肪酶相比，在无溶剂体系中能有效催化辛酸乙酯和 油酸乙酯的合成。还考察了该酶在无溶剂体系中合成生物柴油的能力，结果表明该全细 胞脂肪酶能有效催化地沟油，豆油，麻枫籽油等各种油脂生产生物柴油，转化率均在8 5 以上。固定化细胞也表现出很好的催化能力，摇瓶中转化率可达7 5 ，填充柱中的转化 率可达8 0 ，而载体内部的转化率可达到8 8 。若能对填充柱体系进行更为系统的研究， 有望实现工业化生产。 关键词：r 乃却淞如扬p 珊括，全细胞脂肪酶， 导作用，菌丝形态，流变特性，细胞固定化， i i 筛选方法，离子束诱变，酯合成活性，诱 生物柴油 a b s 仃a c t a b s t r a c t l i p a s ec 删y z e de s t e r i f i c a t i o i l ，缸a 1 1 s e s t e r i 丘c a t i o n 协n o n a q u e o u ss y s t e mh a sb e e nu s e di n m a n ye s t e r ss y n m e s i s ，a n di sa l s o 也em o s ti m r e s t 证gf i e l di i ll i p a s ec a t a l y z e dr e a c t i o n sd u r i n g t 1 1 ep a s t2 0y e a r s m o s to ft 1 1 er e s e a r c hw o r k si i lt m sf i e l df o c u so nt h eo 玛a 1 1 i cs y n t h e s i sb ya k n o w nl i p a s eo ro n 也ei n e c l 僦s mo ft 1 1 ec a t a l 如cp r o c e s si i o l v i n g b e c a u s en o ta uo ft h e l i p a l s e sc o u l dc a t a l y z ee s t e rs y s h t e s i sr e a c t i o ni 1 11 1 0 n a q u e o u ss y s t e m nm a k e sf e wl i p a s e s h a v ep e d e c tc 删如ca b i l 时i nn o n a q u e o u ss y s t e m t h e r e f o r e ，i s 0 1 a t i o na n dd e v e l o p m e n to f n o v e ll i p a s e 谢t l l1 1 i 曲e s t e r s s y n t h e s i sa b i l i t ) rb e c o m ev e 巧i n l p o r t a n t h o w e r ，t oo u r h l o w l e d g e ，f e wr e s e a r c h e r sf o c u so ns c r e e l l i n go fl i p a s ep r o d u c t i o ns 删l 】b a s e do nt h ce s t e r s y n 也e s i sa b i l i 劬a n da l s of e wr e s e a r c h e r sf o c u so nr e g u l a t i o na 1 1 dp r o d u c t i o nt h i sl 【i i l do f 1 i p a s e i nt h i sp a p e r ，l i p a s ew i t hs 蛐e t i ca c t i v i 锣w 嬲c o n c 锄e d s o ，af 瓠ts c r e e i l i n ga n d a c t i v 蚵 d e t e 衄i i 谢i o nm 甜1 0 df o rl i p a s es y n m e t i ca c t i v i t yi 1 1o r g ；狐cs 0 1 v e mh 嬲b e e nb u i l tu pf i r s t l y ， a 1 1 dt h e nt 1 1 es 饥l i i l 沛p r o n e n tf o rr c 办切p 凇括y 9 2b yc o m b i l l a t i o no fn + i m p l a n _ t a t j o na 1 1 d 1 1 i t r o s o g u a l l i d i n e ( n t g ) m m a t i o nw 嬲c a r r i e do u t ak g hp r o d u c i n gs 仃a i nr 如砌p 埘括 y 9 2 一mw a ss e l e c t e db a s eo n 协en e ws c r e e nm 酬的d t 1 1 eo p t i i i l i z a t i o no fc u h u _ ec o n d i t i o n s 、e r ea l s o 咖d i e df o r1 i p a s ep r o d u c t i o n 谢t 1 1s y m h e t i ca u c t i v i 劬a 1 1 dt l l em a i ne 虢c tf a c t o r so n t 1 1 e1 i p a s ep r o 山l c t i o n 、a si n v e s t i g a t e dd e t a i l e 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t w o r e q u i r e m e m sm u s tb em e ta ts 跚et h ef o rh i 啦q 啦m t i 够o fe n z y m ep r o d u c t i o n ：o n ei st 1 1 a t a b s t r a c t 也e l e d i u mm u s tc o n t a i 】舱do l e i ca c i do ri tc o r r e s p o i l d i i l ge s t e r ；a n o t h e ro n ei s 也a tt h el i p i d s n m s ta d h e r et o 吐1 e 矗培ic e l l b i o s y l l t l l e s i so ft k se n z y m e 、v o u l db es t o p p e do n c et h e 础1 e r e n c ew a se l 砌n a t e d t h er e g u l a t i o no fe 玎z y 瑚ea c t i v i 哆w a l sr e f l e c t e db y 也ec h a i l g eo f h y d r 9 1 皿ca c t i v 时f o r1 i j m o l ec e nl i p a s e t h e 、) i 怕1 ec e l l 、析t 1 1m 曲s y n t h e t i ca c t i v 时e x m i t e d l o wh y d r o l ”i ca c t i v 吼w h e r e a s ，h y d r o l ”i ca c t i v i 锣w a s5 5u m gf o rt h em e m b r a n eb o u n d 1 i p a s ew i l i c h 谢t h1 1 i 曲s 弘油e t i ca c t i v 哆b a s e do nt l l e 锄m y s i so fp r o t e i nf o r t h ei n 仃a c e l l m a r e n z y m e so b t a i l l e db yd i f 王e r e mf e n n e m a t i o nt i m e s ，t 1 1 ea | l o s t e r i cr e g u l a t i o nf o rm em e m b r a n e l i p a s ew 嬲s u g g e s t e dt oe x p l 血也ed i 髓r e n tb e t v v e e ns y n 也e t i ca c t i v 遗孤dh y d r 0 1 舛ca c t i v 埘 f o rt h e ，h o l ec e l ll i p a s e ( 6 ) f e db a t c hc u l t i v a t i o nw 髓d e v e l o p e db a s eo nm es t u d yo fe 金 e c to ft r i o l e i ni 1 1 i t i a l c o n c e n 仃a t i o no nm el i p a s ep r o d u c t i o n t h cs y n t b e t i ca c t i v 时c o u l dr e a c h6 5 0u g ，a 1 1 dt 1 1 e a c t i v i t yy i e l dw 硒a b o u t13 0 0 0u g ，w h e nt r i o l e i i lw 粥f e da tc e r t a i l 】t i i l l e si nt h es h a k ef l a s k t h ef i n a lo i lc o m s u p t i o ni s15 l ，恤c hi sl o wt h a i l2 0g l c e l l 伊o w t l la n de n z y m e p r o d u c t i o nw e r ed i 丘e r e mb e m e e n 也es h a l ( en a s ka n df e m l e m o r ，l i p a s ep r o d u c t i o ni i l f e n n e n t o rb yt l l et r i o l e i i lf e e d i n gc o u l dn o tg e tt h es a m el e v e la si 1 1t 1 1 es l 通k 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h a tt h em y c e l i aa g g r e g a t i o nw a sf - a v o ro fm e m b r a l l e b o u 】1 dl i p a s ep r o d u c t i o n e x c e p tf o r 也ee 丘i e c to nl i p a s eb i o s y n t l l e s i sa 1 1 ds e c r e t i o nd i r e c t l y ， t 1 1 ec h a 工l g e si 1 1m y c e l i w nm o 印h o l o g ya l s o 赶r e c t e dt 1 1 em a s st r 趾s f i e ra i l d1 1 0 t 仃a 1 1 s f e ri n 恤e f e m e n t a t i o ns y s t l 锄d u r i n g 血ef e 加1 e m o rp r o c e s s ，p e l l e tm o 印h o l o g yb e n e f i t e dt h el i p a s e p r o d u c t i o i l ，趾dd i s p e r s e dm o 印h o l o g yw a sn o t r e s u l to fb r o t hr h e o l o g ys t u d yi i lf e m l e n t o r r e v e a lt 1 1 a t p e l l e t e dm o 印h o l o g yc o u l dd e c r e a s e dt h ev i s c o s i t yo ft h ec u l t l l r cf l u i d ，a n d 蛔p r o v e dm i x i i l ga n dm a s s 仃缸s f e rp r o p e n i e s o i lc 锄d i s p e r s e dc o n l p l e t e l yu n d e rt h i s c o i l d i t i o n c e ui i i 】吼o b i l i z a t i o no nb i o m a s ss u p p o r tp a n i c l e sc o u l di i l l p r o v et h el i p a s e p r o d u c t i o ne a e c t i v e l y ，4 0 0u 儋a c t i v i 够c o u l db ea b t a m e di nf e m e m o ru s i n gi m m o b i l i z a t i o n ( 8 ) i no r d e rt ov a l i d a t et h ec 砌如cd b i l i 锣o fw h o l ec e l ll i p a s ep r o d u c e db yr c 办伽p 凇括 y 9 2 mi nn o n a q u e o l l ss y s t e m c o m p a r i s o no fe s t e rs y n ：t 1 1 e s i sd b i l i 够b e t 、e e nt h ew h o l ec e l l 1 i p a s ea n d 锄帕c o m n l e r c i a ll i p a s e sn o v 0 4 35a 工l da m a l l op s c 、r ep e r f 0 册e d t h er e s u h i 1 1 d i c a t e dt 1 1 a tw h o l ec e ul i p a s ep r o d u c e db y 兄c 乃加p 珊括y 9 2 mh a de x c e l l e n c ee s t e r s y n t h e s i sa b i l 时i i lo r g a m cs o l v e n t c o r n p