（发酵工程专业论文）海参cdna文库的构建和序列分析以及组织蛋白酶l基因的克隆.pdf

保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密，保密期至j , v lp 年弓月弓1 日为止。 学生签名：锰斑蕴 导师签名： 跏g 年 j ， 缩略词表 a m p b l a s t c d n a b p d e p c d n a e b i p t g k b n c b i o l 强 p c r r a c e i u - p c r r n a x g a l u t r c l c l a p e s t 缩略词表 a m p i c i l i n b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l c o m p l e m e n t a r yd n a b a s ep a i r d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e i s o p r o p y l t h i o p - d g a l a c t o s i d e k i l o b a s c n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o ne d n ae n d r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - d d g a l a c t o s i d e u n t r a n s l a t e dr e g i o n c a t h e p s i nl c a t h e p s i nl - a s s o c i a t e dp r o t e i n e x p r e s s e ds e q u e n e et a g s 氨苄青霉素 基本局域联配搜索工具 互补d n a 碱基对 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷酸 溴化乙锭 异丙基硫代d d 半乳糖苷 千碱基对 美国国立生物技术信息中心 开放阅读框架 聚合链式反应 e d n a 末端快速扩增 逆转录聚合链式反应 核糖核苷酸 5 溴4 氯3 吲哚p d 半乳糖苷 不翻译区 组织蛋白酶l 组织蛋白酶l 相关蛋白 序列表达标签 - 摘要 摘要 应用g u b l e r - h o f f m a ne d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o n 技术，构建仿刺参e d n a 文库。 测试结果表明，库容量为2 o 1 0 6p f u m l ，利用p c r 方法检测e d n a 文库插入d n a 片段的大小，其长度范围在o 5 - 4 1k b ，插入片段平均长度为1 3k b ，表明该文库达到 建库要求，可用来筛选低丰度m r n a 的基因克隆。随机挑选1 0 0 个lk b 以上的e d n a 克隆进行测序分析，发现有2 6 条e s t 序列和网上公布其它物种的序列相似性较高，这 些基因与刺参能量代谢和蛋白水解相关。其中发现的几个重要基因，如编码遍在蛋白 以及缬酪肽蛋白和组织酶l 相关蛋白等，可能与仿刺参自溶过程的蛋白酶水解和细胞 凋亡事件相关。另有7 4 条e s t 序列相似性较低，推测可能是功能未知的新基因。组织 蛋白酶l 是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种正常组织细胞和肿瘤 细胞中，它不仅参与生物体内各种蛋白水解，还参与许多重要的生命活动，如抗原呈 递、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等。研究表明，组织蛋白酶l 和组织蛋白 酶l 相关蛋白是同一蛋白的不同亚基，组织蛋白酶l 相关蛋白和组织蛋白酶l 以对接 形式存在，组织蛋白酶l 相关蛋白对组织蛋白酶l 的靶向作用和表达及其活性起着重 要的作用。通过对刺参e d n a 文库的部分筛选和序列分析，我们发现了一条组织蛋白 酶l 相关蛋白基因( g e n b a n k ：e u 3 0 6 8 7 8 ) 。全长e d n a 为1 3 3 5b p 5 非编码区( u t r ) 9 1 b p ，3 u t r4 8 9 b ，开放阅读框长度7 5 6b p ，编码2 5 1 个氨基酸。为此我们提取刺参总 r n a ，通过r t p c r 和r a c ep c r 技术，从刺参( s t i c h o p u s a p o n i c u s ) 体壁中克隆得到 全长的组织蛋白酶l 基因( g e n b a n k ：e u l 4 3 7 0 9 ) 。其中全长e d n al1 2 9b p ，5 非编码 区( u t r ) 2 0 2b p ，3 u t r8 7b p ，开放阅读框9 9 9b p ，编码3 3 2 个氨基酸( 砚) ，包 括成熟肽3 1 6a a 和信号肽1 6a a 。 关键词：e d n a 文库，刺参，组织蛋白酶l 相关蛋白，组织蛋白酶l ，r t p c r ，测序分 析 a b s t r a c t a b s t r a c t e d n al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d 、析t l lg u b l e r - h o f f m a na c c o r d i n gt ot a k a r ae d n a l i b r a r y c o n s t r u c t i o nk i t t h et i t e ro ft h ec o n s t r u c t e dl i b r a r yi s2 0 x1 0 6 p f u m 1 t h ep c r r e s u l t sb y r a n d o m l yi s o l a t e d3 0c l o n e ss h o w e dt h a ta l lo ft h e mc o n t a i nr e c o m b i n a n td n af r a g m e n t sa n d t h ea v e r a g es i z eo fi n s e r t sw a s1 3k b c l o n e sc o n t a i n i n gc d n a l o n g e rt h a n8 0 0b pw e r e s e l e c t e df o rs e q u e n c i n gu s i n gt 7a n dt 3p r o m o t e rp r i m e r s al o to fe x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) w e r eo b t a i n e db ys e q u e n c i n gf r o mt h e5 e n do ft h ee d n ac l o n e sa n dt h e nt h ee s t s w e r ec o m p a r e d 、析t i ls e q u e n c e si nt h eg e n b a n ka n de s td a t a b a s e so fn c b iu s i n gb l a s t s e a r c h a m o n g10 0e s t so b t a i n e d2 6s h o w e ds e q u e n c eh o m o l o g yt op r e v i o u s l yi d e n t i f i e d g e n e s ，7 4m a t c h e dt ou n c h a r a c t e r i z e dg e n e s t h em o s ti n t e r e s t i n gf i n d sw e r eg e n e si n v o l v e di n p r o t e o l y s i sa n dc e l la p o p t o s i sw h i c hm a yb es p e c i f i ct ot h ea u t o l y s i so fs e ac u c u m b e r s , i n c l u d i n gp o l y u b i q u i t i n a n d u b i q u i t i nc a r b o x y l - t e r m i n a lh y d r o l a s e ， f e r r i t i na n d m e l a n o t r a n s f e r r i n o t h e rc h a r a c t e r i s t i cf e a t u r e ss u c ha sg e n e se n c o d i n gr i b o s o m a lp r o t e i n s u b u n i t s ，c o l l a g e n , c y t o c h r o m eco x i d a s e ，n a d hd e h y d r o g e n a s e ，0 【a m y l a s ea n ds oo nw e r e a l s oo b s e r v e dw h i c ha l ee s s e n t i a lt oc e l l u l a ra n de n e r g ym e t a b o l i s m t h es u c c e s s f u l c o n s t r u c t i o no fe d n al i b r a r yf r o ms t i c h o p u s j a p o n i c u sa n df u r t h e ra n a l y s i so fe s t sw i l lg a i n i n s i g h ti n t om o l e c u l a rm a n i f e s t a t i o no fd e v e l o p m e n ta n dm e t a b o l i s mi ns e ac u c u m b e r sa n d a c c e l e r a t ef u n c t i o n a la n dr e g u l a t i o ng e n ed i s c o v e r y c a t h e p s i nli st h em o s ta b u n d a n tc y s t e i n e p r o t e a s e 埘t lo n l ye n d o p e p t i d a s ea c t i v i t y ，t h ec a t h e p s i nli sr e s p o n s i b l ef o ri n t r a c e l l u l a r p r o t e i nd e g r a d a t i o n , a n di ti sa l s oi n v o l v e di nm a n yo t h e ri m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lr o l e ss u c h a sa n t i g e np r e s e n t a t i o n ，t u n l o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i s ，b o n e r e s o r p t i o na n da p o p t o s i s p r e v i o u sd a t as h o w e dt h a tc a t h e p s i nl l i k e p r o t e a s ei sah e t e r o d i m e r i cc o n s i s t i n go fa c a t a l y t i cs u b u n i t ( c l ) a n dt h en o n - c a t a l y t i cs u b u n i t ( c l a p ) ，c a t h e p s i nl - a s s o c i a t e dp r o t e i n ( c l a p ) i sam e m b e ro ft h ef a sif a m i l yo fc e l la d h e s i o np r o t e i n s ，c l a pc o n f e r sc o n s i d e r a b l e s t a b i l i t yo nc la tp ha n dt e m p e r a t u r e sn o r m a l l yi n c o m p a t i b l e 、析t hc la c t i v i t y r e c e n td a t a h a v ed e m o n s t r a t e dt h a tc l a p p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt a r g e t i n ga n de x p r e s s i o nr e g u l a t i o n o fc a t h e p s i nla c t i v i t y ac y s t e i n ep r o t e a s eg e n eh o m o l o g o u st ot h ec a t h e p s i nl a s s o c i a t e d p r o t e i n ( c l a p ) g e n e sw a si s o l a t e df r o me d n al i b r a r y ( g e n b a n k ：e u 3 0 6 8 7 8 ) t h ef u l l - a b s t r a c t l e n g t he d n aw a s1 3 3 5b p ，c o n s i g i n go f a5 - t e r m i n a lu n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) o f9 1b p a n d4 8 9b p3 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw i t ha l lo p e nr e a d i n gf l a m eo f7 5 6b p ，t h eo r fe n c o d e d 2 51a m i n oa e i d s ( a a ) t h ec d n a se n c o d i n ge a t h e p s i nli nt h ei n t e s t i n a la n db o d yw a l lo ft h e s e ac u c u m b e rs t i c h o p u sj a p o n i c u sh a v eb e e na m p l i f i e db yp c ru s i n gd e g e n e r a t e d o l i g o n u e l e o t i d ep r i m e r sa n d5 a n dy - r a c e ，c l o n e da n ds e q u e n c e d t h ef u l l - l e n g t he d n a w a s1 2 8 7b p ( g e n b a n k ：e u l 4 3 7 0 9 ) ，c o n s i s t i n go fa5 - t e r m i n a lu n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) o f 2 0 1b p ，ay - t e r m i n a lu t ro f8 7b pw i t hac a n o n i c a lp o l y a d e n y l a t i o ns i g n a ls e q u e n c e a a t a a aa n dap o l y ( a ) t a i l ，a n d8 1 1o p e nr e a d i n gf r a m eo f9 9 9b p t h eo r fe n c o d e d3 3 2 a n l i n oa c i d s i n c l u d i n gas i g n a lp e p t i d eo f16a aa tt h en - t e r m i n u sa n dam a t u r ep e p t i d eo f 31 6i l i a t h ep u t a t i v es i g n a lp e p t i d ei sc l e a v e da tc y s 2 1 k e yw o r d s ：c d n alib r a r y 。c a t h e p s inl - a s s o cia t e dp r o t ein c a t e p sin sl r t p c r s e q u e n c i n ga n a i y s i s 一 ， 1 7 研究手段1 2 第二章实验材料与方法13 2 i 实验材料1 3 2 1 i 实验原料1 3 2 i 2 实验仪器1 3 2 i 3 实验主要试剂1 3 2 i 4 生物信息学分析的主要软件与数据库1 5 2 2 实验方法1 6 2 2 i 文库构建以及文库筛选和序列分析1 6 2 2 2c l 基因的分离2 2 第三章实验结果和讨论3 6 3 1 仿刺参c d n a 文库构建、e s t 序列分析3 6 i v l 第一章文献综述 1 1 刺参简介和功效 第一章文献综述 仿刺参a p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s ( s e l e n k a ) ，属棘皮动物门( e c h i n o d e r m a t a ) ，海参纲 ( h o l o t h u r o i d e a ) ，楣手目( a s p i d o c h i r o t a ) ，刺参科( s t i c h o p o d i d a e ) ，仿刺参属 ( a p o s t i c h o p u s ) 。刺参含有丰富的蛋白质、黏多糖和多种微量元素，具有很高的营养和 药用价值，一向被人们视为名贵的滋补食品和佐膳佳肴。国内外研究表明，仿刺参含 有许多具有重要生物学活性的物质，如多糖、皂苷、脂肪酸、多肽、仿刺参毒素、仿 刺参神经节苷酯掣1 1 ，具有增加免疫力 2 1 、抗癌【3 1 、抗凝血【4 1 、抗肿瘤【5 】等作用。市场 对刺参的需求量日益增大，促进了刺参养殖业的迅速发展。我国的海参分布于温带区 和热带区，温带区经济价值高的食用海参只有刺参一种，主要分布于黄海、渤海。热带 海参的种类多，资源量大，但由于近年来的滥捕，捕捞个体趋于小型，自然资源量日 减。因此，对现有群体进行遗传多样性监测和评价是进行种质资源的管理和保护的前 提之一，也是养殖业可持续发展和对养殖种类遗传改良的需要。但与此同时，养殖刺 参的病害频发，野生刺参的资源也因过度捕捞而受到严重破坏 6 1 ，因此，对刺参种质资 源的遗传多样性及分子遗传标记的研究迫在眉睫。近年来，对仿刺参的研究主要集中 在养殖和药物功能上，而对其基因水平的报道较少，而且多数集中在仿刺参微卫星 d n a 上【7 - 9 1 。本研究构建了仿刺参e d n a 文库，并对部分阳性克隆的c d n a 插入片段进行 测序和序列分析，为从基因水平研究仿刺参提供重要的序列信息，为进一步研究仿刺 参的生长、发育和代谢规律奠定了基础。 1 2 基因文库 ， 1 2 1 构建基因文库的方法和进展 由于e d n a 是由m r n a 反转录而来的，因此它代表特定的组织材料在特定阶段所表 达的基因，排除了基因组文库中内含子序列对筛选相关性状基因的影响，使筛选相关 基因的工作更加简单、直接。最初的c d n a 克隆技术主要适用于获得高丰度m r n a 的拷 ， 第一章文献综述 贝，即通过使用相应的核酸或抗体探针来筛选富含该m r n a 组织c d n a 文库的方法来克 隆目的c d n a 。而对于那些低丰度r n r n a 拷贝，通常需要筛选文库的大量克隆才有可能 获得相应的c d n a ，有时即使筛选的克隆量很大也不能奏效。为了更有效地克隆到未知 的低丰度m r n a 的c d n a ，近年来己发展了一些c d n a 文库构建的新方法和新技术。通 过构建c d n a 文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码 的蛋白质的相互作用关系。c d n a 文库构建的方法大致可分为以下几种。 ( 一) 经典c d n a 文库 ( 1 ) 提取研究对象基因组d n a ，制备合适大小的d n a 片段，或提取组织或器官 的m r n a 并反转录成c d n a 。 ( 2 ) d n a 片段或c d n a 与经特殊处理的载体连接形成重组d n a 。 ( 3 ) 重组d n a 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌。 ( 4 ) 阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 随着分子生物学的发展，c d n a 文库的构建方法有了很大的改进，但经典c d n a 文 库仍存在不足：第一，低丰度表达序列在文库中出现的机率很低，因此，要想得到低 丰度表达基因，至少要筛选1 0 8 个克隆；第二，构建经典c d n a 文库所需要的m r n a 量 大，达数微克；第三，筛选经典c d n a 文库工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆 的速度。 ( 二) 标准化c d n a 文库 标准化c d n a 文库( n o r m a l i z e dc d n al i b r a r y ) 又称等量化c d n a 文库，即某特定组织 或细胞的所有表达基因均包含其中，且含量相等的c d n a 文库。基本方法：一种是用基 因组d n a 做选择杂交，所捕获的c d n a 丰度与对应的基因组d n a 丰度一致，其缺点是 约2 0 的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高，另一种是根据c d n a 退火的二级动 力学特性，即稀有拷贝的c d n a 较丰富拷贝的c d n a 复性或杂交慢，使未复性部分的单 链c d n a 渐趋等化。标准化c d n a 文库增加了克隆极低丰度r n r n a 的机会，特别是经过 减数和选择杂交仍难以克隆的转录样本，适用于分析分化发育阶段的基因表达及突变 检查。等量化的c d n a 可作为探针来发现基因组顺序中的转录区，尤其是普通探针所不 能发现的稀有转录区，将原始丰度m r n a 拷贝数相对应的c d n a 探针与标准化的c d n a 文库进行杂交，可估出大多数基因的表达水平，并可发现一些组织表达特异性的基 因。 2 第一章文献综述 ( 三) 消减c d n a 文库 消减c d n a 文库( s u b s t r a c t c dc d n al i b r a r y ) 又称差示文库。在一定条件下用大大过量 不含目的基因的驱动方( d r i v e r ) 与含有目的基因的试验方( t e s t e r ) 进行杂交，选择性地去 除相同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后装入载体形成文 库。由于消减c d n a 文库的富集作用，使所需筛选的克隆数从几十到上百倍。这种文库 常用于克隆不同组织或同一组织在不同生理或病理状态下的差异表达基因。具有三大 突出优点：( 1 ) 高度特异性。该技术经过两轮消减杂交及两步p c r ，使t 中代表差异表达 基因的c d n a 片段得到大量扩增，同时抑制了非特异性。d n a 片段的扩增，使各种消减 文库的特异性得到极大地提高；( 2 ) 高敏感性：c d n a 消减杂交、m r n a 差异显示等方法 的一个共同缺点，即不能分离到低丰度的差异表达基因，对单链t e s t e rc d n a 的均等化 过程，使高、低丰度的差异表达基因都能有效分离，是一项很有发展前途的技术，可 望在研究基因表达及新基因分离中得到广泛应用；( 3 ) 高效率：一次反应可以分离出成 百个差异表达的基因。 ( 四) m r n a 差异显示文库 m r n a 差异显示文库是根据m r n a 差异显示技术构建的c d n a 的文库。基本过程： 以一组对应的细胞的总r n a 或m r n a 为模板，合成上、下游引物，5 端引物含有h i n d i 内切酶位点，每个引物由1 3 个碱基组成，共有8 种，3 端引物含有h i n d i i l 内切酶位点， 每个引物由1 8 个碱基组成，共有3 种。反转录合成。d n a 有2 4 种产物，经计算机同源分 析表明，它们覆盖所有m r n a ，在进行p c r 反应中，d c t p 或d a t p 标记底物以便随后检 测。将对应的两组或更多组p c r 产物，在4 测序凝胶上进行电泳，样品内c d n a 单链 均按分子量大小依次排列在凝胶泳道内，通过放射自显影从胶上两组产物对比中发现 c d n a 差异，回收差异条带的。d n a ，再经二次p c r 扩增获得足量p c r 产物，可供序列 分析、基因表达研究之用或制备各种探针、s o u t h e r n 或n o r t h e r n 杂交分析。李海英等【1 0 l 用m r n a 差异显示技术分离甜菜m ( 1 4 ) 品系特异表达基因的c d n a 片段。 ( 五) 染色体或区域特异性e d n a 文库 用某一染色体或基因组区d n a 与合成的c d n a 池或己构建的c d n a 文库杂交，将捕 获的c d n a 进行p c r 扩增便可用于构建染色体或区域特异性c d n a 文库。其中的c d n a 或 定位于该染色体上或与之有同源性。这类文库有效地用于分离与染色体相关的疾病基 因，基因的定位，以及种、属间同源保守区基因的筛查。染色体显微切割技术的发展 3 ， l 第一章文献综述 使得构建的文库更狭窄，更具特异性。 1 2 2e d n a 文库的应用 c d n a 文库的应用主要有以下几个方面： 1 获得目的基因的全长c d n a 。通过各种方法( 如差异显示、抑制差减杂交等) 所 获得的e s t 片段可以直接作为筛选。d n a 文库的探针，利用菌落s o u t h e r n 杂交，从相应 c d n a 文库中筛出完整的c d n a 克隆。 2 以外源物种的d n a 为探针，通过d n a 文库筛选得到相应的同类基因，这是同 源基因克隆的最常用手段。 3 用于差异筛选技术c d n a 微阵列技术。差异筛选是早期的功能基因研究方法， 即分别用不同时期或不同处理条件下的总d n a 为探针，与c d n a 文库的影印滤膜杂交， 选择表达差异的阳性克隆进一步研究分析，c d n a 微阵列的原理类似，只是将c d n a 文 库中的克隆机器点样于特定的玻璃或硅片，c d n a 克隆的集成度更高，分析更加自动 化，是目前功能基因组学研究的一大热点。 4 获得r f l p 分子标记。因为e s t 在染色体上大多是单拷贝，位置数目有限，是很 好的r f l p 标记来源。 5 应用于特定时期的基因表达分析，如大规模e s t 测序，是功能基因组学研究和 发现新基因的重要手段。此外，通过c d n a 文库筛选目的基因还可以用于基因的结构分 析、获得多个基因家族成员等。 1 2 3c d n a 文库技术的局限性 c d n a 文库源于细胞中基因组基因转录出的m r n a 模板，因此，从c d n a 文库中只 能获得这些m r n a 模板的序列信息及其编码产物的功能信息。而在基因组中，一个完 整的基因功能结构除了转录本m r n a 的编码序列外，还包括了决定该基因表达活动的 调控元件序列。用于转录的分子机制及转录后的剪接机制，这些重要的基因调控元件 并不存在于成熟的m r n a 分子中。因此也就无法通过c d n a 文库技术来获得这些调控元 件，研究在基因组水平上的基因的表达调控机制。这些调控元件只能通过基因组文库 技术来获得。 4 第一章文献综述 1 3e s t 技术及其应用 e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) ，表达序列标签是指通过对e d n a 文库随机挑取的克 隆进行大规模一步法测序所获得的e d n a 的5 或3 端序列，长度一般2 0 7 0 0 0k b 不等。 e s t 是基因的“窗口”，可代表生物体组织某一时空的表达基因，故称之为“表达序列标 签”。e s t 技术是将所获e s t 序列与基因数据库中己知序列比较，进行各种数据分析， 从而获得对生物体生长、发育、代谢、衰老、死亡等一系列生理生化过程认识的技 术。以c d n a 钡t 序为基础的e s t 是c d n a 文库更进一步的应用，而e s t 计划则是相应物种 全基因组测序计划的重要补充。e s t 序列的获得可以相对快速并有效的发现没有遗传背 景或遗传背景知识很少的各物种中的大量基因。e s t 技术使基因克隆发生了革命性改 变，以e s t 为重要来源的染色体物理图谱进一步方便了对侯选基因的连锁分析，可将其 确定在更狭小的染色体区段内，缩小了基因的筛选范围。e s t 本身为表达基因的产物， 用其取代c d n a 全长的筛选、基因组的鉴定等繁琐的实验操作，可大大提高分离基因的 效率。将所获e s t 用生物信息学的方法与各公共数据库中已知序列进行比较，可迅速而 准确地确定基因功能，一旦发现有价值的e s t ，就可以找到对应的克隆，获得的全长 c d n a 可以直接用于如转基因等的研究。随着基因功能鉴定工作的不断进行，以e s t 序 列为基本工具，利用同源比较进行基因功能分析将成为未来规模化鉴定基因功能的主 要方式之一。 1 4 组织蛋白酶 1 4 1 组织蛋白酶简介 组织蛋白酶( c a t h e p s i n ) 是1 9 2 0 年才定义的酶，是溶酶体内的蛋白水解酶。根据其活 性部位所含的氨基酸的不同，组织蛋白酶可以分为丝氨酸组织蛋白酶( 如组织蛋白酶a 和g ) 、天冬氨酸组织蛋白酶( 如组织蛋白酶d 和e ) 和半胱氨酸组织蛋白酶( 如组织蛋白酶 b 、l 、h 、s 、k 、f 、v 、x 、w 、o 和c ) ：根据其底物特异性分类，组织蛋白酶又包括 肽链内切酶组织蛋白酶b 、f 、h 、k 、l 、s 、v ，肽链端解酶组织蛋白酶b 、c 、 h 、x ，氨基肽酶组织蛋白酶c 、h ，羧肽酶组织蛋白酶b 、x 。半胱氨酸组织 蛋白酶因其含有巯基又被称为巯基蛋白酶，其活性中心含有活性必需的半胱氨酸残 基，与底物形成共价中间复合物，具有普遍的蛋白水解活性。主要存在于细胞质和溶 5 第一章文献综述 酶体中【1 ，属于胞内蛋白酶，弱酸性环境中易被活化，是一类在碱性和中性溶液中不 稳定的糖蛋白( 除组织蛋白酶d 、e 、s j b ) 。人体中主要存在1 1 种，它们与人类肿瘤、 骨质疏松、关节炎等多种重大疾病密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。 1 4 2 组织蛋白酶结构 组织蛋白酶都是由体内先合成的无活性的前体酶原( p r e p r o c a t h e p s i n ) 水解而成，其 在体内的合成途径为：首先在体内核糖体上以前体酶原的形式合成，经转铁蛋白进入 内质网，然后进入高尔基体，同时通过糖基化及磷酸化作用形成甘露糖6 磷酸蛋白， 最后通过溶酶体甘露糖一6 磷酸特异性受体的识别作用，间接转运到溶酶体 t 1 2 , 1 3 l 。组 织蛋白酶的前体酶原由信号肽( s i g n a l - p e p t i d e ) 、前体肽( p r 0 1 ) e p t i d e ) 和含有催化活性中心 的成熟肽( m a t u r e p e p t i d e ) 构成。信号肽的长度在l o 2 0 个氨基酸残基之间，它负责将核 糖体表达的前体酶原蛋白转运至内质网，在内质网被水解掉后形成只含前体肽和成熟 肽的酶原( p r o c a t h e p s i n ) 。前体肽氨基酸残基数差别较大( 3 6 3 1 5 之间1 ，它占据了酶的活 性中心，使酶原没有催化活性，并随之转运入胞内溶酶体，在溶酶体的酸性条件下自 动水解，去掉前体肽，产生有活性的成熟的组织蛋白酶。所以前体肽又是能阻止酶原 活性的高亲和性可逆抑制剂。成熟肽长度在2 1 0 2 6 0 个氨基酸残基之间，它具有高度的 保守性1 1 2 , 1 4 。组织蛋白酶在氨基酸序列上存在保守性，都具有i 刍c y s 2 5 ，h i s l 5 9 和a s n l 7 5 残基( 木瓜蛋白酶编号) 组成的保守活性位点，其他的一些氨基酸序列区域也表现出一定 程度的保守性，其中包括形成二硫键的多个半胱氨酸残基，组织蛋白酶通常都是由二 硫键连接的轻链和重链两条多肽链组成。在空间结构上组织蛋白酶也表现出高度保守 性，成熟的组织蛋白酶除了组织蛋白酶c 为分子量约2 0 0k d a 的低聚体( 人的组织蛋白酶 c 为四聚体) 外，其余的为分子量2 0 3 5k d a 之间的单休，它们都包括几乎同样大小的两 个结构域叫。( 1 e 哟域和r ( r i g h t ) 域( 图1 ) 。l 域包含3 个a 螺旋区，其中最长的一个a 螺 旋( 中心螺旋) 由约4 0 个氨基酸残基组成，其n 末端含有保守位点c y s 2 5 。r 域为主要由5 6 复k r - 链形成的桶状结构，其中含有保守位点h i s l 5 9 、a s n l 7 5 。在大部分酶的l 域中至 少形成了两个二硫键，从而增加了该结构域的稳定性，而在r 域中只发现了一个二硫 键( 图1 ) t 1 2 , 1 5 1 。由于l 域和r 域的存在，使得该酶结构上形成明显分界，它们之间也因此 形成了一个v ”形的活性位点沟槽( w - s h a p e da c t i v es i t ec l e f t ) ，l 结构域中的c y s 2 5 和r 结构域中的h i s l 5 9 、a s n l 7 5 活性残基就位于该“v ”形沟槽中【1 2 1 。在中性或弱酸性的环境 中，h i s l 5 9 残基中的咪唑基能使c y s 2 5 残基中的巯基极化而使其失去质子，形成c y s 2 5 6 1 4 3 组织蛋白酶的功能 组织蛋白酶在产生生物活性分子和清除生物活性分子方面起重要作用，包括降解 各种蛋白为机体提供营养，清除细胞中残缺、不正常的多肽，控制细胞内各种酶和活 性肽的潜在浓度，水解某些前体蛋白( 酶原和激素原) 生成其活性形式，或激活其他 蛋白水解酶系统而使其发挥作用，参与生长因子、血管增殖调节及协助其它细胞因子 调节等，有助于细胞迁移、增殖及凋亡等的调节。 1 4 4 组织蛋白酶l 1 4 4 1 组织蛋白酶l 生理功能 组织蛋白酶l ( c a t h e p s i nl ，c l ：e c 3 4 2 2 1 5 ) 属于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋 白水解酶，以酶原的形式贮存于溶酶体中，相对分子质量为3 0k d a 。在正常情况下， 大约1 0 的酶原被生理性分泌至胞质，然后可被其他的蛋白水解酶水解或自身激活， 切除n 端和c 端多余的氨基酸残基形成相对分子质量为2 4k d a 的活性形式，参与许多特 殊的生理过程，如激素原的激活、抗原呈递、组织器官的发育等。但在病理状态下， 各种原因所致的细胞损伤( 如病原微生物、炎症因子、氧化应激等) ，导致溶酶体膜稳定 7 一 审 第一章文献综述 性降低，通透性增高甚至破裂，大量c l 释放到胞质或组织间隙，并被激活，可降解细 胞成分或细胞间质基质成分，包括层粘素、型胶原纤维及纤维连接素等，与人类许 多疾病如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、阿尔茨海姆病、多发性硬化症及其 他慢性炎症性疾病有关。 i 免疫作用 巨噬细胞、树枝状细胞及b 淋巴细胞能够合成i i 型组织相容性复合物( m h ci i ) ，并 调节产生抗原呈现作用，通过产生相应抗体对抗异种蛋白是机体免疫的一种机制。研 究表明组织蛋白酶s 、l 、b 、h 、f 、v ( 尤其是c a t s ) 都参与m h ci i 调节的抗原呈现作 用。根据所在细胞类型的不同，它们有的能够降解胞内蛋白，产生用于呈现的抗原 肽；有的能降解i i ( i n v a r i a n tc h a i n ) ，促进m h ci i 的成熟，导致抗原呈现作用，从而参与 机体的自身免疫系统反应 1 4 , 1 6 , 1 7 1 。 2 溶骨作用 人体正常骨骼代谢依赖于成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间的动态平 衡。在破骨细胞的溶骨作用过程中，破骨细胞首先附着于骨表面，并分泌质子形成封 闭的酸性骨吸收微环境，然后依次降解骨矿物质和骨基质。而在骨基质的降解过程 中，组织蛋白酶k 、l 等( 尤其是c a t k ) 发挥了重要的作用【1 6 , 1 8 。 3 其他作用 细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在生物体发育过程中发生的程序化事件， 是导致最终自我消亡的一种生命活动。近年来研究表明，组织蛋白酶与细胞凋亡关系 密切，已发现组织蛋白酶b 、c 等能直接或间接地激活细胞凋亡的主要蛋白酶c 嬲p a s e 【1 2 】。另外，实验研究还发现组织蛋白酶与其它多种生理功能相关，如组织蛋白酶l 除了 与角质细胞分化、毛囊循环作用密切外，还与生殖过程中精子和卵子的发生有关；组 织蛋白酶b 、l 等在机体出生后的中枢神经系统的成熟和发育完整过程中作用重大。 1 4 4 2c l 与病理过程的关系 组织蛋白酶分子主要存在于溶酶体中，发挥其生理状态下的蛋白水解作用。但在 某些特定条件下，胞外也可以检测到它的存在。胞外酶的存在会导致胞外蛋白的水 解，多与恶性病变有关f 挖】。近年来研究表明组织蛋白酶越来越被认为是在病变、肿瘤 入侵、免疫系统相关疾病以及各种寄生虫感染疾病中起作用的一类关键酶【1 9 1 。 1 肿瘤 肿瘤的发生是一多因素、多阶段的过程，其侵袭转移包括以下3 个步骤：( 1 ) 粘附， 8 第一章文献综述 即肿瘤细胞内的整合素与胞外基质( e c m ) 成分结合；( 2 ) 降解，即肿瘤细胞或其周围的 基质细胞分泌蛋白酶降解细胞外基质成分；( 3 ) 穿透，即肿瘤细胞通过细胞外基质降解 处移行【2 0 】。肿瘤病人的主要死因就是因为胞外基质、基底膜被降解，使得肿瘤细胞能 够离开肿瘤组织而进行转移。研究表明多种人类肿瘤组织中如：肾癌、肺癌、大肠 癌、乳腺癌、及卵巢癌等均有c l 的高表达。c l 可以通过催化降解基质膜，促进肿瘤的 侵袭、转移，已经在肾癌、睾丸癌、肺非小细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱 癌和甲状腺癌等多种癌症中发现c l 高表达【1 4 1 。它还可以激活组织蛋白酶b ，从而触发 链式反应，诱导产生活化的尿激酶血纤溶酶原激活剂( u - p a ) ，它们的协同作用可以加 快恶性细胞的侵袭与转移；此外c l 也参与肿瘤细胞的有丝分裂活动，这也是其影响肿 瘤转移的可能机制之一。 2 骨质疏松症( 0 s t e o p o r o s i s ，o p ) 人体正常骨代谢依赖于骨形成及骨吸收之间的动态平衡，o p 是骨吸收与骨形成代 谢失衡，骨吸收大于骨形成所造成的一种疾病，是老年人尤其是绝经期及绝经后妇女 中的一种常见病、多发病。骨吸收过程中，破骨细胞首先附着于骨骼表面，形成相对 封闭的骨吸收微环境，分泌质子和蛋白水解酶，先溶解骨矿物质，继而降解骨基质， 导致骨空洞形成。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种半胱氨酸蛋白酶 和基质金属蛋白酶( m m p s ) ，其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的c a t - k ，它选 择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达9 5 的i 型胶 原，除此之外它还能降解骨基质中的骨桥接素( o s t e o p o n t i n ) 和骨连接素( o s t e o n e c t i n ) ， 是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的一种半胱氨酸蛋白酶，它对成骨胶原的降 解能力远远高于其他各种m m p s ，是骨吸收过程中的一个关键酶 1 4 , 1 6 , 2 1 , 2 2 ，2 3 1 ，也是近年 来骨质疏松研究中的一个热点。除c a t k p f ，在破骨细胞形成的吸收微环境中还存在 c l ，它具有很强胶原溶解作用，也直接参与了骨基质降解。c l 的小分子抑制剂能有效 地抑制骨吸收，抗骨质疏松作用明显。 3 抑制s a g s 病毒 美国科研人员发现c l 抑制剂可以阻止s a r s 病毒进入靶细胞，这一研究为病毒蛋 白在宿