（材料学专业论文）壳聚糖及其衍生物与大肠杆菌DNA、蛋白质的作用关系研究.pdf

摘要 摘要 本文制备了多种低相对分子质量的壳聚糖衍生物，考察了其抗菌性能和水溶 性，并选取性能比较好的o 羧甲基壳聚糖和n 甲基亚磷酸壳聚糖，与壳聚糖对 比，进行以下生物实验：采用凝胶色谱和圆二色谱研究不同种类、不同浓度、不 同相对分子质量的壳聚糖及其衍生物在体外对质粒d n a 的结合能力：研究壳聚 糖及其衍生物对m r n a 的结合能力和对大肠杆菌转化的影响：应用圆二色谱初 步观察壳聚糖及其衍生物在不同条件下对蛋白酶结构的影响。 研究表明：壳聚糖及衍生物对d n a 有不同的结合能力，并可以影响大肠杆 菌的转化过程。壳聚糖及其衍生物结合d n a 的能力随着浓度的增大和取代度的 减小而逐渐增强；相对分子质量小于1 0 0 0 0 的o 羧甲基壳聚糖结合两种质粒的 能力受质粒的大小和自身的相对分子质量的影响而改变。就结合m r n a 的能力 而言，o 羧甲基壳聚糖要明显优于纯壳聚糖。相对分子质量为1 0 0 0 0 的壳聚糖与 0 羧甲基壳聚糖，n 甲基亚磷酸壳聚糖可以阻碍大肠杆菌的转化过程，其他衍 生物不具备这种能力。不同条件的壳聚糖和0 羧甲基壳聚糖，n 甲基亚磷酸壳 聚糖可以使蛋白质肽链发生松散，改变其结构。随着浓度的增大和相对分子质量 的减小，以及衍生物取代度的降低，这种影响都会增强。 根据以上实验结果我们认为壳聚糖及其衍生物对细菌生长繁殖的抑制作用 可以通过结合d n a 或m r n a ，改变蛋白酶结构从而阻碍复制，和影响大肠杆菌 转化过程等途径进行影响。 关键词：壳聚糖壳聚糖衍生物质粒m r n a 蛋白质抗菌机理 摘要 a b s t ra c t i nt h i sp a p e r , s e v e r a lc h i t o s a nw a t e r - s o l u b l ed e r i v a t i v e sw i t hl o wm o l e c u l a rw e i g h t s ( m w ) w e r es y n t h e s i z e d t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa n dw a t e rs o l u b i l i t yw e r es t u d i e d 0 一c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ( o - c m c s ) a n dn m e t h y lp h o s p h o r i cc h i t o s a n ( n m p c s ) w e r ec h o s e no u tf o rb i o l o g i c a le x p e r i m e n t sc o m p a r e dw i t hc h i t o s a n b i n d i n ga b i l i t i e s 、加mp l a s m i d sd n ai nv i t r oo fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sw e r es t u d i e dt h r o u g h a g a r o s e - g e le l e e t r o p h o r e s i sa n d c i r c u l a r d i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r u mf r o m f o u r i n f l u e n c i n gf a c t o r s e f f e c t so nm r n aa n de c o l it r a n s f o r m a t i o nw e r ea l s od i s c u s s e d p r e l i m i n a r ys t u d yo fi n f l u e n c e so np r o t e i ns t r u c t u r eo fc h i t o s a n sw a sc a r r i e do a tu s i n g c d t h er e s u l t ss h o w e d ：c h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sh a dd i f f e r e n tb i n d i n ga b i l i t i e sw i t h d n aa n dc o u l dh i n d e re c o l it r a n s f o r m a t i o n b i n d i n ga b i l i t i e so fc h i t o s a na n di t s d e r i v a t i v e sw i t hd n aw o u l db e c o m es t r o n g e rw h i l ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e do rd e g r e e o fs u b s t i t u t i o n ( d s ) d e c r e a s e d 0 - c m c sw i 也 缸l e s s 廿1 a n10 0 0 0h a dd i f f e r e n t a b i l i t i e sw h e nb i n d i n gw i t hd i f f e r e n tp l a s m i d sa n dt h ee f f e c t sw e r ei n f l u e n c e db y v o l u m eo fp l a s m i da n dm wo fd e r i v a t i v e s t u d ys h o w e dt h a to c m c sh a ds t r o n g e r i n f l u e n c e so nm r n at h a nc h i t o s a n c h i t o s a na n di t st w od e r i v a t i v e s ( o - c m c sa n d n - m p c s ) w i t h o fl0 0 0 0c o u l dh i n d e rt r a n s f o r m a t i o np r o c e s so fe c o l ia n do t h e r d e r i v a t i v e sd i dn o th a v et h i sa b i l i t y t h e yc o u l da l s ol o o s e nt h es t r u c t u r eo fp e p t i d e 1 1 1 ea b i l i t yw o u l db e c o m el a r g e ra sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e do rm wa n dd sd e c r e a s e d a sa b o v es h o w s ，i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sc a l lb i n dw i t h d n aa n dm r n a ，r e s u l t i n gi ni n t e r r u p t i n gt h ed u p l i c a t i o n 。t h e ya l s oc o u l dh i n d e rt h e p r o c e s so ft r a n s f o r m a t i o n t h e s ew e r et h ew a y st h e yh a dt or e s t r a i nt h eg r o w t ho f b a c t e r i a k e yw o r d s ：c h i t o s a n c h i t o s a nd e r i v a t i v e p l a s m i d m r n a p r o t e i n a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤变盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：隈一顽举 签字日期： 呻年 f 月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗苤堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：导师签名： 岛、蜥 签字日期：年月e t 签字日期：a 们年 f 月7 c le l 第一章绪论 1 1 抗茵剂综述 1 1 1 抗茵剂研究现状 第一章绪论帚一早三百下匕 抗菌材料是指自身具有杀灭微生物或抑制微生物功能的一类新型功能材料， 如抗茵塑料、抗菌纤维、抗菌陶瓷、抗菌纺织物等。目前，抗菌制品被世界各国 公认为是跨世纪的环保和健康产品【l 】。国际上抗菌制品的发展起步于2 0 世纪8 0 年代，代表性的国家为日本，美国和德国发展也很快。由于抗菌材料能从根本上 杜绝人与人、人与物、物与物之间的细菌交叉感染，所以在全世界受到了普遍欢 迎。在日本以及欧美发达国家，抗菌材料已得到了广泛的应用。我国抗菌材料的 研究起步较晚，但发展很快并且积极追踪国际材料科学发展前沿。自1 9 9 0 年以 来，我国抗菌材料的研制、开发和产业化进程异常迅速，九十年代末进入了第一 个发展高潮【z 】。 抗菌材料通常是利用添加抗菌剂制备的。日本是研制抗菌剂最早的国家。 1 9 8 4 年品川公司研制出载银沸石抗菌剂，将其应用到塑料材料中制成抗菌塑料， 抗菌效果很好，并被日本及欧美国家推崇。1 9 9 6 年日本东亚合成化学公司又推出 了与银沸石组成不同的载银抗菌剂，商品名n o v a r o n ，对驹皮病菌和霉菌具有很 强的杀灭能力，且它与合成纤维、合成塑料制品的相容性很好【3 】。目前，日本研 制生产的抗菌剂有载银沸石、载银玻璃、载银磷酸锆和载银羟基磷灰石，以及载 氯化银二氧化钛等。美国在抗菌剂的研制上也有很大进展。杜邦公司推出的注册 商标为m i c r o f r e e 的抗茵粉末a m p 3 ，利用独特的核微粒外壳结构，使抗菌涂层包 覆在核微粒外，增大了抗菌活性组分的表面积。美国a r p 公司研制的抗菌剂 b a c t i c l e a n 是一种有机抗菌剂，可在2 7 7 的加工温度下与大多数塑料进行掺混， 对防止革兰氏阴性和阳性菌及真菌和酵母的生长有很好的效果【4 】。 我国对抗菌剂的研究较晚，但成果也相当丰硕。如华东理工大学材料工程学 院所推出的自主研制的抗菌剂f u m a t 系列产品，以银锌铜为主要原料，以无机 填料为载体，具有广谱抗菌性，耐光照不变色，安全无毒，适用于塑料、纤维、 涂料等领域【5 】。江苏泰兴纳米材料厂于1 9 9 7 年研制开发了磷酸复合盐为载体的银 系无机抗菌剂，具有高效广谱抗菌性，且超低毒性【6 】。应用纳米技术开发纳米材 料是材料领域热门的研究方向，国内许多研究单位已将纳米技术应用到抗菌剂的 开发中，研制出了纳米级抗菌粉体。其中，华东理工大学的纤维级纳米抗菌剂， 第一章绪论 具有特殊效应，克服了银变色的不足，提高了整体的抗菌性能。在天然抗菌剂的 研究中，也有很多研究成果的报道。如浙江大学龚金炎等利用竹子的提取物进行 抗菌杀虫研究，发现竹叶，竹醋液，竹皮和竹笋提取物均具有良好的抑菌作用， 可以替代化学食品防腐剂和杀虫剂，有很广的应用前景【7 1 。暨南大学谭绍早等改 性的蒙脱土复合抗菌剂不仅有良好的耐水性能，而且具有高效广谱的抗菌性能 【8 】 o 1 1 2 抗菌剂分类 材料的抗菌功能一般是通过与一定量抗菌剂相复合来实现的，在实际应用中 侧重于在长期使用过程中具有抑制细菌的生长和繁殖的能力。抗茵剂主要是指对 一些微生物高度敏感，少量添加即可赋予良好抗菌性能，能够抑制微生物生长、 繁殖甚至毒杀微生物的化学物质。不同的抗菌剂具有不同的抗茵效果和抗菌机 理，常用抗菌剂作用原理如表1 1 所示。因此，评价和选择抗菌剂应综合考虑各 种因素，如：最低抑菌浓度( m i c ) 、最低杀菌浓度( m b c ) 和抗菌谱；抗菌 持久性；加工适应性；耐候性；稳定性：反应惰性；安全性和经济因素等诸多方 面。应用于与人体接触的材料，还要考虑抗菌剂的毒性、生物活性和生物相容性 等等。 表1 1 常用抗菌剂的作用机理 t a b l e ! - 1a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s mo fs o m ea n t i b a c t e r i a la g e n t s 抗茵剂作用 机 理 醇类 酚类 卤素类 甲醛 戊二醛 环氧衍生物类 p 丙内酯 季胺盐类 双胍类 银 双酚 蛋白质的变性、溶菌、阻碍代谢机能 破坏细胞膜、与蛋白质反应、使蛋白质变性 酶蛋白、核蛋白的巯基的氧化、破坏 酶蛋白其他活性基的还原反应、凝固变性作用 与细胞壁活性巯基、氨基反应、阻碍核酸和蛋白质合成、损伤细胞膜 与核酸成分反应 损伤细胞膜、酶蛋白的变性 细胞酶、细胞壁的损伤、酶蛋白的变性 阻碍酶、损伤细胞膜、酶蛋白和核酸的变性 阻碍电子传递系统、损伤细胞膜、并可与d n a 反应 损伤细胞膜 抗菌剂的发展由早期矿植物中的提取物到新型合成抗菌剂的出现，历经了几 第一章绪论 千年的历史。随着人们安全意识的提高，以及新型抗菌剂的出现，一些重金属化 合物和一些有机抗菌剂如卤代二苯醚类、抗生素磺胺药类由于其潜在毒性，已经 逐渐被淘汰【9 d0 1 。目前活跃在市场上的抗菌剂产品按其化学组成可分为无机系、 有机系和天然类以及它们的复合制品。 1 1 2 1 无机类抗菌剂 无机抗菌剂的种类繁多，性能各异，分类方法也不同。按抗菌剂的原料不同 可分为抗菌金属、金属氧化物以及过碳酸钠盐、h c l 0 等非金属氧化物。按抗菌 剂的相态可以分为气相、液相和固相三大类。按其组分分为氯制剂和非氯制剂两 大类。按作用的途径又可分为离子溶出型及接触型两类。目前工业化较好的有银 系无机抗菌剂( 如日本东亚合成公司推出的银系无机抗菌剂n o v a r o n ) 和光催化 抗菌剂( 如t i 0 2 系列抗菌剂) 。 1 1 2 2 有机类抗菌剂 有机系抗菌剂的开发应用较早，生产工艺也相对成熟。合成有机抗菌剂一般 根据其分子结构可分成2 0 余类，主要包括季胺盐类、双胍类、醇类、酚类、醛 类、有机酸类、酯类、醚类、过氧化物类、卤素类等。有机抗茵剂是通过化学反 应与细菌和霉菌的细胞膜表面阴离子相结合或与硫基反应，破坏蛋白质和细胞膜 的合成系统，使蛋白质变性、代谢受阻，起到杀菌、防腐及防霉等作用。有机抗 菌剂的优点是：杀菌力强，灭菌速度快，抗菌范围广。代表性的物质有：季铵盐 类抗菌剂( 如，以n 苄基- n ，n 二甲基- n 烷基氯化铵为主要成份的抗菌防臭剂) ； 有机硅季胺盐类 如，3 ( 三甲氧基硅烷基) 丙基二甲基十八烷基季铵氯化物【1 1 】 酚类抗菌剂( 如，2 ，4 ，4 三氯2 一羟基二苯醚、5 ，5 二羟基5 ，5 二氯二苯基 甲烷和4 异丙基环庚二烯酚酮等) 。 1 1 2 3 天然抗菌剂 天然抗菌剂是人类最早使用的抗菌剂，我们的祖辈们很早就从实践中得知香 辣料、蓖麻油、桧醇等都对食物具有防腐保鲜功能。这种抗菌剂是利用各种天然 物质特有的抗菌性能制造和使用的抗菌剂，主要是从动植物中提炼精制而成的， 例如山奇、孟宗竹、薄荷、柠檬叶等的提取物，蟹和虾中提炼的壳聚糖、鱼精蛋 白、挂皮泊和罗汉柏油等。天然抗菌剂的优点是，它不属于化学制品，完全是从 天然食物或动植物中提取或直接使用的；在生产和使用过程中，对人畜和环境不 产生污染危害。天然抗菌剂在纺织品抗菌加工中的使用很多，已经被采用的纺织 品抗菌剂有芦荟、丁香子、甘草等中草药萃取物等【l2 1 。天然高分子壳聚糖以其 优异的抗菌性能成为近几年抗菌产品开发和研究的重点。壳聚糖类抗菌剂经验证 对人体无任何危害，没有原发致病性，具有耐候性优良、毒性低、使用安全等优 第一章绪论 点。用壳聚糖改性纤维制造抗菌织物的报道层出不穷，目前已有壳聚糖改性棉纤 维、聚氨酯、尼龙和粘胶纤维等研究出现【1 3 1 6 1 。 1 2 壳聚糖及其衍生物 1 2 1 壳聚糖概述 甲壳素( c h i t i n ) ，化学名称：( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧b d 葡聚糖，是一 种白色无定形半透明的氨基多糖生物聚合物，是许多低等动物特别是节肢动物如 虾、蟹和昆虫等外壳的重要成分，还广泛存在于低等植物如菌、藻类的细胞壁中。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是由甲壳素经质量分数为4 0 0 0 , - - 6 0 浓碱加热至8 0 1 2 0 处理数小时，脱去n 乙酰基得到的衍生物。化学名称：聚葡萄糖胺【( 1 ，4 ) 2 氨基2 脱氧一f l - d 葡聚糖 。壳聚糖化学结构式为如图1 1 所示。 0 图1 - 1 壳聚糖的结构式 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo fc h i t o s a n 随脱乙酰化度的不同，其分子链中存在含量不同的2 - n 乙酰基葡萄糖和2 氨基葡萄糖两种结构单元。壳聚糖是白色或淡黄色片状固体，不溶于水、乙醇和 丙酮，能溶于无机酸和水杨酸、酒石酸及抗坏血酸等有机酸，也能溶于许多稀酸 溶液中，如盐酸，醋酸和磺酸【1 7 】。在酸性介质中，壳聚糖的分子中的- n h 2 基团 被质子化为n h 3 + 离子，产生酸性溶解：而未脱n 乙酰基的甲壳素无溶解性。因 此，壳聚糖的溶解性与脱乙酰化度密切相关：脱乙酰化度在6 0 以下的壳聚糖只 有部分离析溶解于稀醋酸溶液中；脱乙酰化度为6 0 - 8 0 的壳聚糖呈絮凝悬浮 于稀醋酸溶液中；脱乙酰化度为8 0 以上的则以油状清澈地溶于稀醋酸溶液中。 壳聚糖具有广谱抗菌性，对多种细菌和真菌的生长都有明显的抑制作用【l 引。 a l l a n 早在1 9 7 9 年就对壳聚糖的抗菌性作了系统的研究，他提出壳聚糖具有广谱 抗菌性【1 9 】。壳聚糖的抗菌性受相对分子质量、脱乙酰化度、浓度和p h 值等因素 的影响。本课题组的研究结果表明：随脱乙酰化度的增加抗菌性出现极值：相对 分子质量对抗菌性的影响表现为先增强后减弱，在m 。约为9 1 6 x 1 0 4 时表现出最 优的抗菌性，在p h 值为5 5 6 5 范围内抗菌性最吲2 0 】。 但是壳聚糖仍不能直接溶解于水和普通有机溶剂，其应用受到很大限制。因 第一章绪论 此，改善壳聚糖的溶解性能，尤其是水溶性，是开拓壳聚糖应用领域的重要环节。 因而人们对壳聚糖进行各种化学改性，寻求溶解性更好尤其能溶于水的衍生物， 以扩大其应用范围。 1 2 2 壳聚糖衍生物概述 壳聚糖分子内的羟基o h ，氨基- n h 2 易进行化学反应，如：酰基化、磺化、 羧甲基化、羟乙基化、烷基化、酯化、季铵化等，通过上述化学改性，分子链中 引入多种官能团，一方面改善了壳聚糖的溶解性能，增加了水溶性：另一方面， 提高了壳聚糖原有的特性，使其作用效果更高更好：更重要的是可制得新的衍生 物，开发出更有魅力的新产品。 1 2 2 i 羧甲基壳聚糖 在众多的壳聚糖衍生物中，羧甲基壳聚糖的研究较早，也最令人注目。羧甲 基壳聚糖是用氯代烷酸或乙醛酸，在壳聚糖的羟基、氨基上引入羧甲基基团，根 据羧甲基的取代位置不同，可将壳聚糖羧甲基衍生物分为三类：o 羧甲基壳聚糖 ( o - c m c s ) ，n 羧甲基壳聚糖( n c m c s ) ，n ，o 羧甲基壳聚糖( n ，o c m c s ) 。 壳聚糖经羧甲基化改性以后，由于羧甲基的引入使之成为一种既含有氨基又 含有羧基的两性聚电解质，破坏了壳聚糖原有的晶体结构，提高了其溶解适应性， 其亲水性大大提高，使之具有成膜、增稠、保湿、絮凝、螯合、胶化和乳化等特 性【2 。它的大分子链节上含有两个质子移变基团氨基和羧基，类似于氨基酸， 能在较宽的p h 值范围内溶解。它们在日化，食品，造纸，制药等方面都有着重 要的用途，这主要是因为羧甲基壳聚糖具有如下优良性能：( 1 ) 水活性，取代度 大于0 6 的羧甲基壳聚糖易溶于水，取代度愈高，水溶性愈好，其溶液的透明度 也愈好。( 2 ) 保湿性，羧甲基壳聚糖上的羧基及氨基都是亲水基因，有着较强的 吸水性，且溶液的粘度恒定。o 羧甲基壳聚糖用于化妆品能使化妆品具有润滑作 用和持续的保温作用，还能使化妆品的贮藏性能、稳定性能良好。( 3 ) 成膜性， 羧甲基壳聚糖有较好的成膜性，其膜有光泽，透明而柔韧，并有较好的透气性。 利用其制成的膜对氧气、二氧化碳、乙烯都具有一定的选择渗透性，是一种良好 的保鲜剂，应用于水果、蔬菜的保鲜，可保持营养成分。( 4 ) 高分子性能，对胶 体有稳定作用，有增稠、凝胶和气泡稳定作用。( 5 ) 安全无毒性，羧甲基壳聚糖 安全，无毒无害【2 2 】。 控制条件使羧甲基化只发生在6 位的一o h 上，即生成o 一羧甲基壳聚糖，如 图1 2 。研究表明，o 羧甲基壳聚糖的合成中并未破坏或取代c 2 位置上的氨基 基团，c o o h 基团可以电离出部分c o o 粒子，通过诱导、静电引力作用加大了 一n h 2 基团的碱性，因而其表现出优良的抗菌性。影响o 羧甲基壳聚糖的抗菌性 第一章绪论 的主要因素有：羧甲基化度和环境p h 值。羧甲基化度在0 3 时，其抗菌性最强， 大于或小于o 3 时，抗菌效果均有所下降；在p h = 5 7 的范围内，o 羧甲基壳聚 糖显示了较强的抗菌活性；而相对分子质量对o 羧甲基壳聚糖的抗菌活性影响 不大【2 引。o 羧甲基壳聚糖为壳聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性和 生物降解性，对人体无毒无害；o 一羧甲基壳聚糖与n 羧甲基壳聚糖的最大区别 在于，o 羧甲基壳聚糖是一种既含有活性氨基又含有羧基的生物可降解性阳性多 糖，可与多种生物活性物质连接，可以大大提高其承载性能，因此有可能成为新 一代的基因和药物靶向控释载体材料【2 钔。 0 图1 - 20 习唆甲基壳聚糖结构式 f i g 1 - 2s t r u c t u r eo f o - c m c s 1 2 2 2 壳聚糖季铵盐 用缩水甘油三甲基氯化铵对壳聚糖进行化学结构修饰，可在壳聚糖分子中引 入季铵盐基团，制得壳聚糖季铵盐，常见的有羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和o 2 - 羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。生成壳聚糖季铵盐的反应也主要发生在壳聚糖分 子中亲核中心位的氨基上。通过s c h i f f 反应将氨基保护，也可将季铵盐接在6 位 的羟基上。在壳聚糖中引入位阻大、水合能力强的季铵盐基团，也能大大削弱壳 聚糖分子间的氢键，增大壳聚糖衍生物的水溶性。 有报道称壳聚糖季铵盐除直接溶于水外，还能与某些有机溶剂以任意比例混 合，如许晨、卢灿辉等将1 0 的壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵溶液与乙醇、丙二醇、 甘油以任意比例混合，均未观察到沉淀或浑浊现象发生【2 5 】。羟丙基三甲基氯化 铵与壳聚糖反应制得的壳聚糖季铵盐，与椰油酰胺，甜菜碱的配位性良好，可用 作阳离子表面活性利2 4 1 。 壳聚糖季铵化后不但水溶性增强，其抗菌性能也增强。j i a 等发现n ，n ，n 三 甲基壳聚糖季铵盐有抗大肠杆菌a t c c2 5 9 2 2 和葡萄球菌属a t c c l 4 9 9 0 9 的活性 2 6 1 o 1 2 2 3 其他壳聚糖衍生物 壳聚糖磺化衍生物，对细菌、霉菌和酵母菌均有较强的抑制作用1 2 7 1 ，对大 第一章绪论 肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉有更强烈的抑制作用【2 引。与羧甲基反应类似，在甲 壳素和壳聚糖羟基上可以制备形成相应的醚类衍生物，甲壳素醚类衍生物经脱乙 酰化反应后可得到壳聚糖类衍生物，具有良好的保水性能，几乎与透明质酸相当， 可使化妆品不发粘，保湿性好，用于护发品中使头发具有自然光泽。 此外，还可以通过水解反应、降解反应、氧化反应、接枝共聚、交联反应、 重氮化反应、螯合反应制各不同特性的壳聚糖衍生物。 1 3 壳聚糖及其衍生物的抗菌性能 1 3 1 壳聚糖及其衍生物的抗菌活性 壳聚糖的抗菌性是其众多优秀特性中最能吸引人的性能之一，它对多种细菌 和真菌的生长都有明显的抑制作用 2 9 - 3 1 】。早在1 9 7 9 年，a l l a n 等就对壳聚糖的抗 菌性进行了系统的研究，并提出壳聚糖的广谱抗菌性。 1 3 1 1 一般抗菌活性 对于壳聚糖的抗菌活性，国内外已有文献进行了报趔3 2 0 7 】。1 9 9 5 年，蒋玉燕 等人系统地研究了壳聚糖的抗菌性【3 8 】，他们通过测定2 7 5 株临床分离的病原菌对 壳聚糖的敏感性，指出当壳聚糖浓度y 寸l o m g m l 时，对革兰氏阴性菌的抑菌率达 6 0 旷1 0 0 ，对革兰氏阳性菌及白色念珠菌的敏感性更高；当壳聚糖浓度为 5 m g m l 时，对革兰氏阳性菌的抑菌率达7 5 - , 1 0 0 ；当浓度为6 m g m l 时，临床上 常见的致病菌金黄色葡萄球菌能1 0 0 地被抑制和杀灭；当壳聚糖浓度为8 m g m l 时，对三株质控标准株( 大肠杆菌a t c c 2 5 9 2 2 、绿脓杆菌a t c c 2 7 8 5 3 及金黄色 葡萄球菌a t c c 2 5 92 3 ) 均显示了强大和快速的杀菌作用，一般在2 8 小时内即可 杀灭9 9 9 的接种细菌，其中杀灭大肠杆菌速度最快( 2 小时) ，绿脓杆菌为4 d , 时， 金葡菌为8 小时，但壳聚糖对金葡菌的杀菌作用最强，2 4 d 时能1 0 0 杀灭。 1 3 1 2 在食品中的抗菌活性 壳聚糖用作食品的保鲜剂，由于其来源广泛，天然、无毒副作用，涂膜保鲜 简单易行等优点，受到国内外的广泛研究。刘青梅用1 5 壳聚糖及0 5 苯甲酸 钠涂被保鲜纸包装的冬笋，在7 左右的室温下可保鲜3 0 天，笋壳笋肉色泽基本 不变，好笋率达8 5 ，优于其它保鲜剂f 3 9 】。当壳聚糖涂到表皮受损的新鲜草莓时， 能有效抑制孢子发芽及胚芽的管形伸长和径向生长【4 0 】。唐雪蓉等报道，壳聚糖 乙酸混合液对猪肉中的各种腐败菌( 如假单胞杆菌、肠杆菌科菌、乳酸杆菌和葡 萄球菌等) 及致病菌( 如金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙仃氏菌和李斯特单核增生菌 等) 均有一定的抑制作用，且抑制作用比相同浓度的乙酸溶液好【4 1 1 。 第一章绪论 1 3 1 3 在织物中的抗菌活性 陆淼泉等用改良娜i i l n 法对用壳聚糖处理过的织物做抗茵实验，证明壳聚糖 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抗菌率为1 0 0 ，经皂洗5 0 次后， 对上述3 种菌的抗菌率仍在7 5 以上，显示出良好的抗细菌和抗真菌作用。此外， 对抵抗力较强的枯草杆菌( 芽胞菌) 也有一定的抗菌作用【4 2 1 。 本课题组以n ，o 羧甲基壳聚糖为增溶剂，将微晶壳聚糖水分散体与粘胶纺 丝液混合，分别在南京化纤股份有限公司和保定天鹅化纤集团有限公司的生产线 上进行纺丝实验，结果表明这种改性纺丝液可纺性良好，可进行连续纺丝。纤维 具有优良的力学性能和抗菌性能。 1 3 1 4 低相对分子质量的壳聚糖的抗菌活性 许多资料表明壳聚糖的抗菌活性与其相对分子质量大小有关。夏文水等以实 验证实，随着相对分子质量的下降，壳聚糖的抗菌活性增强：在5 0 0 x 1 0 击的浓 度下，相对分子质量为1 3 0 0 0 的低聚糖抑菌效果为( + ) ，5 0 0 0 的抑菌效果为( + + ) ， 3 0 0 0 的抑菌效果为( 十h ) ，1 5 0 0 的抑菌效果为( 抖* ) 4 3 1 。另外，杜昱光等报 道，几丁六糖使携带肿瘤的小白鼠对绿脓杆菌、白假丝酵母等感染有防治作用， 而一些较高聚合度的寡糖具有阻碍病原菌生长繁殖的功能【矧。另有研究表明， 在相对分子质量3 0 5 万以下的范围内，随壳聚糖浓度的增加，其抗菌作用的效果 增强，浓度为1 0 时，对革兰氏阳性菌和对革兰氏阴性菌，其抗菌率均达到1 0 0 。 对革兰氏阳性菌，随壳聚糖的相对分子质量增大，抗菌作用逐渐增强；对革兰氏 阴性菌，随壳聚糖的相对分子质量减小，抗菌作用逐渐增强，相对分子质量为5 0 0 0 以下，抗菌作用最强【4 5 1 。 1 3 2 壳聚糖衍生物的抗菌活性 壳聚糖分子内的羟基o h ，氨基n h 2 通过酰基化、磺化、羧甲基化、羟乙基 化等化学改性，分子链中引入多种官能团，一方面改善了壳聚糖的溶解性能，增 加了水溶性：另一方面，提高了壳聚糖原有的特性，使其作用效果更好；更重要 的是可制得新的衍生物，开发出更有魅力的新产品 4 6 - 4 7 】。 壳聚糖的磺化衍生物是非常引人注目的，因为磺化壳聚糖具有与肝素相似的 分子结构，且具有抗凝血作用。壳聚糖磺化试剂主要有浓硫酸、二氧化硫一三氧 化硫、氯磺酸等，反应一般是非均相进行的，但也有以偶极离子存在的s o ，d m f 的络合物在d m f 中进行均相反应制得。抗菌实验结果表明，磺化壳聚糖的抗菌 性不及壳聚糖，且这种趋势随取代度的提高更加明显。而苯磺酸壳聚糖不但具有 良好的水溶性，其抗菌性能也得到一定程度的增强。而黎碧娜等以黑曲霉、假丝 第一章绪论 酵母为菌株，研究表明磺化壳聚糖和磺化羟丙基壳聚糖对其生长均有抑制作用， 且强于壳聚糖1 2 。 羧甲基壳聚糖( c m c s ) 是壳聚糖经羧甲基化反应后的产物。陈凌云等利用 微量热法研究了n ，o - 羧甲基壳聚糖对金黄葡萄球菌的抗菌性能，发现其抗菌性 能受相对分子质量的影响，当相对分子质量大于1 0 5 时，几乎不体现出抗菌性， 而当其相对分子质量小于4 x 1 0 3 时，样品在5 m g m l 浓度下能完全抑制金黄色葡 萄球菌的生长【4 8 】。我们对0 一羧甲基壳聚糖( o c m c s ) 的抗菌性进行了系统的 研究，由于o - c m c s 的侧基一c o o h 可以电离出部分电负性较强的c o o 基团， 通过诱导、静电引力作用加大了心m 2 的碱性，有利于对细菌的吸附和絮凝，因 此o c m c s 的抗菌性明显优于壳聚糖。羧甲基化度的提高有利于增强o c m c s 的抗菌性，而o c m c s 抗茵性对相对分子质量的依赖性与壳聚糖相似，只是相 对分子质量较大时具有良好的抑菌效果【4 9 1 。k i m k m 等对比了分别由原始壳聚 糖和降解壳聚糖制备的o c m c s 的抗菌性，表明后者的抗菌性较强【5 们。 用4 - 氯丁酸或5 氯戊酸在碱性环境下与壳聚糖反应得到羧烷基壳聚糖，在 多种溶剂中均有很强的溶解性能。菌落数法测定其抗菌性能表明其抗菌性较壳聚 糖有明显的提高【5 l 】。 x i e w m 将马来酸钠接枝到羟丙基壳聚糖上得到h p c t s g m a s 接枝产物， 具有较强的抗菌性能，浓度为1 0 0 m g m l 的溶液即可在3 0 分钟内将9 9 9 的大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌杀死【5 2 】。同样，将丙烯酸钠与羧甲基壳聚糖钠进行接枝 反应也得到了具有良好抗菌性能和溶解性能的衍生物【5 3 】。 1 - 3 - 3 壳聚糖抗菌活性的影响因素 壳聚糖的抗菌性能受到很多因素的影响，如相对分子质量、脱乙酰化度、浓 度和作用环境的条件( p h 、温度等) ，甚至壳聚糖原料的来源也会影响其抗菌性 能。 通常随着脱乙酰化度的提高，壳聚糖的抗菌性能也增强。尽管对于壳聚糖的 抗菌机理尚不明确，但各国学者都公认壳聚糖的聚阳离子氨基是其有效抗菌基 团。因此，壳聚糖分子中氨基含量的大小影响着其抗菌性能。相对分子质量是影 响壳聚糖抗菌性能的另外一个重要因素【州。u c h i d a 等认为相对分子质量的降低 有利于提高壳聚糖的抗菌性能【5 5 】。在浓度对壳聚糖抗菌性的影响方面，w a n g 等 的研究表明随着浓度的提高，壳聚糖对多种致病菌的抗菌效果均发生了变化【5 6 】。 其他研究人员如s e o ，j e o n 等则发现浓度会影响壳聚糖的m i c ，提出对于不同的 菌种，壳聚糖的m 1 c 均不同【5 7 - 5 9 。如对于大肠杆菌，其m i c 一般在0 0 2 左右； 而浓度在0 1 左右时则对葡萄球菌有很强的抑制作用。环境条件也是影响壳聚 第一章绪论 糖抗菌性的重要因素之一。温度的提高，有利于壳聚糖的抗菌作用；而h o n g 等 发现环境p h 的变化，对壳聚糖的抗菌性具有明显的影响【5 4 1 。当p h 为7 时，由 于氨基无法质子化且此时溶解性变差，壳聚糖几乎不表现抗菌性【删。我们的研 究表明在p h 为5 5 6 5 时壳聚糖抗茵性表现最型2 0 1 。 1 4 壳聚糖与d n a 的作用研究 1 4 1 壳聚糖抗菌机理研究 各国学者对壳聚糖的抗菌性进行了大量的研究，但到目前为止，壳聚糖的结 构对其抗菌活性的影响和壳聚糖的抗菌机理尚无统一的说法。综合各种研究的结 果，可以分为以下几类： ( 1 ) 以带负电荷的细菌细胞膜为作用靶，根据壳聚糖的聚阳离子本质，可以 和细菌表面产生的酸性物质如磷壁质酸、荚膜多糖等相互作用，形成复杂的高分 子电解质，使其膜功能发生紊乱，从而产生抗菌效果。属于这类模型的有：y o u n g 于1 9 8 2 年提出壳聚糖可吸附于细菌表面，与细菌细胞膜作用，从而改变其通透 性。他们通过紫外分析对细菌培养液进行研究，发现在2 2 0 n m 处，有大量的紫 外吸收，认为是由于壳聚糖破坏了细菌的细胞膜，从而导致了大量氨基酸、蛋白 质等可在此处发生紫外吸收的物质泄露【4 6 6 1 】；y a j i m a 则认为壳聚糖吸附细菌后， 壳聚糖分子包埋了整个细胞，从而抑制了细菌的呼吸和营养物质的进入而导致细 菌死亡【6 2 】。 ( 2 ) 以细菌分子内的d n a 为作用靶，壳聚糖分子进入细菌细胞内，并与其中 的d n a 作用，阻碍了m 刚a 的合成。h a d w i g e r 等人观察了壳聚糖与以植物水解酶 为宿主的真菌病原体间的作用，发现壳聚糖渗透到了真菌细胞核内，并影响了 r n a 和蛋白质的合成【6 ”。日本的栗田公司经研究发现，少量壳聚糖即可除去菌 体提取液中的大部分核酸，如在大肠杆菌和枯草杆菌提取液中分别加入0 1 m l5 的壳聚糖溶液，则可除去菌体内9 9 1 的d n a 、9 0 的r n a ，从而说明壳聚糖与 d n a 和r n a 可以相互作用l ”j 。 在本课题组以前的研究工作中，我们发现壳聚糖吸附大肠杆菌并使其发生了 凹陷和溶解，低相对分子质量的壳聚糖齐聚物可以进入到大肠杆菌细胞的内部， 抑制细菌的生长，推测了两种抗菌机理的模型【4 9 】： 模型l ：在酸性条件下，壳聚糖分子中正电性的质子化铵，吸附带有负电荷 的细菌，使细菌细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均，干扰细胞壁的合成，打破 在自然状态下e ：c o l i 的细胞壁合成与溶解平衡，使细胞擘趋于溶解，细胞膜因不 能承受渗透压而变形破裂，细胞的内容物如水、蛋白质等渗出，发生细菌溶解而 第一章绪论 死亡。 模型2 ：壳聚糖齐聚物吸附细菌后，穿过大肠杆菌的多孔细胞壁进入到细菌 细胞内，可能与d n a 形成稳定的复合物，干扰d n a 聚合酶或r n a 聚合酶的作 用，阻碍了d n a 或r n a 的合成，从而抑制了细菌的繁殖。 1 4 2 壳聚糖及其衍生物与d n a 作用 目前普遍接受的壳聚糖与d n a 以静电络合的方式形成复合物。因为壳聚糖 上的游离氨基质子化使得壳聚糖分子带正电荷，可以与带负电荷的d n a 以静电 作用结合在一起而形成壳聚糖d n a 复合物。用溴化乙锭( e m r ) 进行荧光扫描再进 行凝胶电泳可以证明复合物之间的静电作用。l e o n g 等 删把壳聚糖加入经溴化乙 锭( e t b r ) 染色的d n a 溶液中，随着阳离子壳聚糖竞争键的作用，用荧光光度计 检测发现荧光强度明显减小，利用激光粒度仪检测出复合物表面电势的变化也证 明壳聚糖与d n a 之间静电作用的存在。 目前，国内外对壳聚糖及其衍生物与d n a 的研究主要是向基因治疗方向进 行的。自1 9 9 5 年，m u m p e r 等人首次报道壳聚糖d n a 复合物的制备之后【6 5 】，近1 0 年来，壳聚糖除了用作口服药物的辅料外，将其作为局部药物释放系统载体的研 究也引起了人们的重视。r i c h a r d s o n 等【6 6 】以d n a s e i i 作为标准酶，在不同酶浓度 下通过凝胶电泳来检验载体的保护能力，发现由不同相对分子质量且经高度纯化 的壳聚糖与d n a 组成的络合物在电荷比为1 ：1 时几乎可以完全抑$ 1 d n a s ei i 对质 粒d n a 的降解。壳聚糖之所以能有效地抑帛u d n a s e 降解，估计是因为壳聚糖与 d n a 结合而成的络合物形成的三维空间结构所产生的位阻效应。m a o 等也研究了 壳聚糖d n a 复合物在盐溶液和血清中稳定性，发现当复合物暴露在血清或高离 子强度的盐溶液时，可能由于对蛋白质的吸收或相互之间发生凝聚作用导致复合 物的尺寸变大【67 1 。m a c l a n g h i n 等更加系统地研究不同相对分子质量、不同电荷 比的壳聚糖d n a 复合物在1 0 血清浓度中的稳定性。研究发现随着相对分子质 量的增大，壳聚糖与d n a 之间的相互作用更趋于稳定【鲳】。 研究人员普遍认为壳聚糖微囊是一种具有广阔前景的新型药物载体，具有无 毒、生物相容性高、生物可降解、可控制药物的释放、提高药物生物利用度以及 增加药物局部滞留性等优点。药物经过壳聚糖微囊化后，可以避免与消化酶直接 接触，通过对药物释放时间的控制，可使其在肠道内释放药物。近些年来，许多 研究表明壳聚糖能和d n a 形成微囊，可以用作基因转运系统来转运治疗性基因 和免疫性基因。m a o 等把d n a 与壳聚糖共聚成壳聚糖d n a 纳米粒子，实现 了d n a 在多种细胞中的转染，并跟踪了壳聚糖介导的p r e 荧光素酶质粒释放后 在h e l ( 2 9 3 细胞中的基因表达动力学，表明壳聚糖载体介导基因转化至靶细胞 第一章绪论 后，基因可稳定表达【6 9 】。近来，p a r k 等人，制备了半乳糖改性的壳聚糖一接枝 一葡聚糖- - d n a 复合物，实验证明这一体系能有效地转染表达唾液酸糖蛋白受 体( a s g r ) 的c h u g 肝细胞，a s g r 能特异地识别壳聚糖上的半乳糖配体【7 0 】。 1 5 论文研究工作的提出 综上，壳聚糖及其多种衍生物具有很好的抗菌性能，但具体抗菌机理尚不明 确。目前对于壳聚糖及其衍生物与d n a 的作用研究主要基于将其应用于基因治 疗领域，对其作为非病毒载体的研究已证实壳聚糖可以与d n a 以静电络合的方 式形成稳定复合物。而将这种研究方法应用于抗菌研究方面的报道却很少。因此， 我们希望将这种途径应用于壳聚糖抗菌机理的研究，选取出抗菌性能和水溶性均 较好的衍生物进行生物实验，以期对其抗菌机理的发展提供一些数据和理论支 持。 由于壳聚糖及其衍生物与d n a 的结合应该是基于氨基和磷酸基团的正负电 荷吸引，因此氨基含量应该是影响结合能力的一个重要因素。当氨基含量由于取 代反应发生在氨基基团上而降低时，衍生物结合d n a 的能力应受到影响。鉴于 此，本论文将通过制备不同取代位置和不同取代度的壳聚糖衍生物，对其进行抗 菌性能研究。选取抗菌性能较好的衍生物，使之与d n a ，m r n a 和蛋白质进行 作用，考察其与d n a ，m r n a 的结合性能和对蛋白质的结构影响。主要进行的 工作包括： 1 合成不同取代位置和不同取代度的壳聚糖衍生物，包括o 羧甲基壳聚糖、n 甲基亚磷酸壳聚糖、磺化壳聚糖和n 烷基化壳聚糖等，并利用多种测试手段对 其进行结构表征与测试。对各种衍生物进行抗菌性能测试，选取出抗菌性能较好 的衍生物进行下一步实验。 2 利用琼脂糖凝胶电泳和圆二色谱两种手段，研究不同条件的壳聚糖及其衍生 物( 种类，相对分子质量，浓度，取代度等) 对质粒d n a 的结合作用。利用 m r n a 杂交实验讨论壳聚糖及其衍生物对l 州a 的影响作用。利用大肠杆菌转化 实验讨论壳聚糖及其衍生物对大肠杆菌生长的作用途径。 3 在前人利用蛋白质丙烯酰胺凝胶电泳和对水杨酸羟化酶酶活力测定研究壳聚 糖及其衍生物对蛋白质影响的结论基础上，利用圆二色谱手段初步直观的研究壳 聚糖及其衍生物对大肠杆菌蛋白质酶液结构的影响作用。 第二章壳聚糖衍生物的制备及性能表征 第二章壳聚糖衍生物的制备及性能表征 2 1 壳聚糖衍生物的合成 2 1 1 实验原料及仪器 2 1 1 1 实验原料 壳聚糖( 脱乙酰化度8 5 )m w = 1 0 0 0 0 壳聚糖( 脱乙酰化度8 5 )m w = 5 0 0 0 氯乙酸 甲酰胺 氯磺酸 异丙醇 n a o h h c l 溴代十六烷 亚磷酸 其他试剂均为分析级 2 1 1 2 实验仪器 透析袋 a j 一1 0 0 电子天平 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 上海优品生化有限公司 上海优品生化有限公司 天津市大茂化学试剂厂 天津市化学试剂六厂 中国医药集团上海化学试剂公司 天津化学试剂有限公