（材料科学与工程专业论文）京尼平交联壳聚糖的研究.pdf

摘要 京尼平交联壳聚糖的研究 摘要 口服结肠定位给药系统是通过口服达到结肠定位释放的目的。目 前广泛应用o c d d s 的载体材料主要有偶氮类、多糖类等材料。偶氮 类材料存在生物相容性差、细胞毒性大、不易降解等缺点。壳聚糖是 一种生物相容性良好的天然多糖，在生物医药行业有着广泛的应用前 景，尤其是壳聚糖及其衍生物所具有的p h 敏感性，在口服结肠定位 给药领域具有潜在的应用，但是它的机械性能较差、稳定性不好。本 文制备了n 羧乙基壳聚糖海藻酸钠共混膜，并摒弃了常规交联剂戊 二醛选用了天然交联剂京尼平，从而有望进一步降低共混膜的细胞毒 性、提高膜的力学能力并减缓膜的降解。此种结肠定位释放的药物载 体膜具有制备工艺简单，给药受胃肠道环境影响较小等优点。在此基 础上，利用静电喷雾技术研制出了一批具备成球性好、粒径均匀、环 境友好等特点的海藻酸钠微球，通过后续工艺使n 羧乙基壳聚糖包 覆在微球表面，再经过京尼平交联后制备出一种具有核壳结构的微 囊，为新型微囊用于结肠定位释放开辟了道路。 具体内容和结论如下： 1 、首先通过迈克尔加成反应制备一种水溶性的壳聚糖衍生物 - n 羧乙基壳聚糖( c s a a ) ，然后选用京尼平作交联剂制备了n 羧乙基壳聚糖海藻酸钠膜，并对其进行红外表征、核磁分析、溶胀 动力学、模拟结肠环境的缓冲溶液中药物释放行为、酶降解实验和形 l 北京化t 人学硕i ：学位论文 貌分析等测试。结果表明这种共混膜具有良好的p h 值响应性能，在 p h = 1 2 缓冲溶液的溶胀率远远小于p h = 7 4 缓冲溶液时的溶胀率， p h = 7 4 缓冲溶液时5 氟尿嘧啶药物缓释量也大于p h = 1 2 环境，从而 有可能使药物减少在胃部环境中流失及降低了胃部刺激，所以该共混 膜能作为结肠定位控释的潜在载体。 2 、通过改变静电喷雾技术的外部电压强度、注射器针头、推进 速度等因素制备出2 0 0 u m 左右的粒径均匀的海藻酸钠微球，并用激 光粒度仪进行粒径分析。经过后续c s a a 包覆、京尼平交联，制备 出一种具有发射荧光的微囊结构。主要对微囊进行了荧光显微镜分 析、共聚焦激光扫描显微镜的核壳分析、形貌分析等方面的研究。确 定了制备微囊的最优条件，有望以后用于生物医学甚至结肠定位载体 的实验。 关键词：壳聚糖，京尼平，结肠定位，静电喷雾，p h 响应性，海藻 酸钠微球 摘要 r e s e a r c ha b o u tc h i t o s a nc r o s s l i n k e db y g e n i p i n a b s t r a c t t h eo b j e c t i v eo fo r a lc o l o n - s p e c i f i cd r u gd e l i v e r ys y s t e m ( o c d d s ) i st h es p e c i f i cd e l i v e r yo fd r u g st ot h eh u m a nc o l o nv i at h eo r a lr o u t e c h i t o s a n ，w h i c hi san a t u r a lp o l y m e rw i t hg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , h a sa b r o a df o r e g r o u n di nb i o m e d i c i n ei n d u s t r y e s p e c i a l l yb e c a u s eo ft h ep h s e n s i t i v i t y , c h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si n o c d d sf i e l d i nt h i sp a p e r , n c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n s o d i u ma l g i n a t e b l e n dm e m b r a n e sc r o s s l i n k e db yg e n i p i nw e r ep r e p a r e d g e n i p i ni sa n a t u r a l c r o s s l i n k i n ga g e n t ，w h i c h h a sl e s sc e l l c y t o t o x i c i t y , b e t t e r c r o s s l i n k i n ga b i l i t ya n dd u r a b i l i t yt oe n z y m a t i cd e g r a d a t i o nt h a nt h e c o m m o nc r o s s l i n k i n ga g e n tg l u t a r a l d e h y d e t h i sk i n do fd r u gc a r r i e r m e m b r a n e sr e d u c e dt h es i d e - e f f e c to f d r u g t o g a s t r o i n t e s t i n a l e n v i r o n m e n t ，a n dw e r eo fs i m p l ep r e p a r a t i o n b a s e do nt h i s ，s o d i u m a l g i n a t em i c r o s p h e r e sw e r e f a b r i c a t e d u s i n gt h e e l e c t r o s t a t i c s p r a y t e c h n o l o g y t h ee n v i r o n m e n tf r i e n d l y , s y m m e t r ya n ds p h e r i c i t yo ft h e m i c r o s p h e r e sa r es u p e r i o r i t y t h e nt h em i c r o s p h e r e sw e r ec o a t e di na c h i t o s a ns o l u t i o na n dc r o s s l i n k e db yg e n i p i n a sar e s u l t ，t h e g e n i p i n c r o s s - l i n k e dn - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n s o d i u ma l g i n a t em i c r o c a p s u l e s i i l 北京化t 人学倾i j 学位论文 w e r ec o l l e c t e d t h ed e t a i l sa n dc o n c l u s i o n sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 ，as e r i e so fb l e n dm e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db yaw a t e r - s o l u b l e c h i t o s a n ( n - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c s a a ) a n ds o d i u ma l g i n a t e ( a l g ) c o - c r o s sl i n k e db yg e n i p i n t h e nt h em e m b r a n e sl o a d e dw i t hd r u g ( f l u o r o u r a c i l ，5 - f u ) w a sp r o d u c e dw i t ho n em e t h o dt h a ti st oa d dt h e d r u gi n t ot h eb l e n do fc s - a a a l gb e f o r ec r o s s l i n k i n gw i t hg e n i p i n ， a f t e rt h a tu s i n gu vs p e c r u mt ot e s tt h ed r u gr e l e a s ec a p a b i l i t yi nd i f f e r e n t p hb u f f e rs o l u t i o n s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es w e l l i n gr a t i ow a ss l o w i nt h es t r o n ga c i dm e d i u md u et of o r m a t i o no fh y d r o g e nb o n d sb e t w e e n c s - a aa n da l g i n a t e a tp h7 4 ，t h ec a r b o x y l i ca c i dg r o u p so nt h e c s a a a l gh y d r o g e lb e c a m ep r o g r e s s i v e l yi o n i z e d i nt h i sc a s e ，t h e h y d r o g e ls w e l l e dm o r es i g n i f i c a n t l yd u et oal a r g es w e l l i n gf o r c ec r e a t e d b yt h e e l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o nb e t w e e nt h ei o n i z e da c i dg r o u p s t h e r e l e a s e s y s t e mr e l e a s e da tp h 1 2w a sr e l a t i v e l yl o w e r t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ec h i t o s a n b a s e dh y d r o g e lc o u l db eas u i t a b l ep o l y m e r i c c a r t i e rf o rs i t e s p e c i f i cp r o t e i nd r u gd e l i v e r yi nt h ec o l o n 2 ，as e r i e so fs o d i u ma l g i n a t em i c r o s p h e r e sw e r ef a b r i c a t e db y c h a n g i n g t h ee x t e r n a l v o l t a g ev a l u e s ，p r o m o t es p e e da n d n e e d l e s d i m e n s i o n so fe l e c t r o s t a t i cs p r a yt e c h n o l o g y t h e nu n i f o r mg r a d i n g m i c r o s p h e r e sw i t hd i a m e t e ro fa b o u t2 0 0 p mw e r ec h o s e ni np a r t i c l es i z e a n a l y s i su s i n gl a s e rg r a n u l o m e t e r t h e nt h em i c r o s p h e r e sw e r ec o a t e di n ac h i t o s a ns o l u t i o na n dc r o s s l i n k e db yg e n i p i n t h eg e n i p i nc r o s s - l i n k e d 摘要 c s a a a l gm i c r o c a p s u l e sw e r ec o l l e c t e d t h ec h a r a c t e r i z a t i o nw a s s t u d i e db yt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya n a l y s i s ，t h ec o n f o c a ll a s e r s c a n n i n gm i c r o s c o p ya n a l y s i sa n ds e me t c ，a n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f t h e m i c r o c a p s u l e s w e r ed e t e r m i n e d i ti s p o s s i b l et h a tt h eg e n i p i n c r o s s l i n k e dc s k 心a l gm i c r o c a p s u l e sw i l lb eu s e da sc o l o n s p e c i f i c c a m e r k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，g e n i p i n ，c o l o n - s p e c i f i c ，e l e c t r o s t a t i cs p r a y , p h s e n s i t i v i t y , s o d i u ma l g i n a t em i c r o s p h e r e s v 符0 说i j c s c s a a c s a a x 0 ：y ) o c d d s a l g m g 5 一f u s r d s s e m f b i r c l s m p a s w t r m i n 符号说明 壳聚糖 n 羧乙基壳聚糖 n 羧乙基壳聚糖占共混物质量的x ，京 尼平与n 羧乙基壳聚糖摩尔比为i ：y 口服结肠定位给药系统 海藻酸钠 b ( 1 - 4 ) d 甘露醛酸 a ( 1 _ 4 ) l - 古罗糖醛酸 5 氟尿嘧啶 溶胀率 取代度 扫描电子显微镜 红外光谱仪 激光扫描共聚焦显微镜 帕秒 质量分数 转| 分铵 v i l 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：盔堕坦 日期： 2 里丝釜篓旦至旦 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的 规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京 化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部 或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用本 授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权 书。 作者签名：董堕塑日期：兰! 篮堑塑兰旦 导师签名：二及，【煎 日期：工o d 笙月牛日导师签名： 丛玉 日期： 兰! 丝垒! 丛! 望 * 一绪论 第一章绪论 1 1 口服结肠定位释放的研究 口服结肠定位给药系统( o 哪c o l o n - s p e c i f i cd r u gd e l i v e r ys y s t e m ，o c d d s ) 是指 药物与其他辅科或者载体结合l | 服后在上消化道不释放，到达人体结肠后开始 崩解或蚀解并释放出来，使药物发挥对局部或者全身治疗效果的系统它属于靶 向给药系统中的一类，容易避免因大剂量用药而引起的全身不良反应【”。o c d d s 在临床应用上具有很多重要意义，近年来获得了迅速发展，有非常广阔的市场前 景。 结肠的结构和特点 圈i - i 口服结肠吸收示意图 f i g 1 - 1s c h 日n a t i cd i a g r a m f o r o r a lc o l o na b s o r p t i o n 结肠可分为升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠四部分，在人体内是介于盲 肠和直肠之间的部分。其中乙状结肠在临床上虽容易引发疾病，所以也是口服 结肠定位给药所选择的部位( 如圈l ，1 ) 】。结肠部位含有4 0 0 多种有益菌群，结 肠菌丛产生的酶可催化多种药物代谢反应，结肠丰富的淋巴组织为口服太分子药 物特别是多肽蛋白类药物的吸收提供一磬有效途径。 从2 0 世纪8 0 年代发展到现在，结肠利于药物的吸收和起效已经受到越来越多 的重视，这主要是因为结肠的生理结构有咀下几个特点：第一，肠道内m 细胞的顶 北京化t 人学顾f ：学位论文 端表面有许多的微绒毛和扁平的微皱褶，它具备有效的细胞转运能力。结肠可以吸 收水分和电解质，但是不能主动吸收糖、氨基酸、小分子肽和疫苗类药物等物质， 这些物质在结肠内的转运速度比较缓慢，在结肠内滞留的时间较长，所以结肠容 易发挥吸收功能【4 】。第二，结肠与胃和小肠比较其环境中酶或细菌的活性和程度 都较低，滞留时间长，结肠丰富的淋巴组织为口服大分子药物提供有效的吸收环 境。第三，结肠中的p h 值比胃肠道其他的区域都要高，末端回肠、结肠前端、升 结肠和结肠中部p h 值分别约为：7 5 、6 4 、7 0 、6 6 。所以在较高的p h 值下溶 胀、降解的材料有潜在的结肠定位释药的可能。第四，通常情况下食物在胃中的 运行时间从十几分钟到十二小时都有可能，而在小肠的运行时间为四个小时，这 就说明药物从小肠运行到结肠的时间是一定的，所以说结肠释药研究与时间有密 相关性【5 1 。 1 1 20 c d d s 的研究方法及其特点 近年来，o c d d s 已引起了专家们的广泛关注，研究工作和临床实践已有了很 大的进展，展示出了良好的发展前景。结肠定位制剂具有如下特点：( 1 ) 对治疗 结肠疾病如溃疡性结肠炎、结肠癌、便秘等具有靶向意义，借助物理手段将药物 在病变区直接释放减小二次伤害，避免药物被胃酸破坏或被胰酶代谢而失去治疗 作用；( 2 ) 提高了大分子药物如蛋白质、多肽等口服给药后的生物利用度；( 3 ) 长效缓释* u n - 如易在清晨发作的哮喘、冠心病、中风等疾病如果睡前用药，直 至清晨药物才会释放出来，提高了药物制剂的有效性和安全性；( 4 ) 药物在结肠释 放可以提高局部药物浓度减少对胃肠道的刺激以及全身性的毒副作用，同时可 以减少剂量；( 5 ) 研究的周期较短，开发成功率较高，投资回报率高。 6 - 9 目前，用于结肠定位的给药系统主要有p h 依赖型释药系统、时滞释药系统、 压力控制型释药系统、菌群触发型释药系统以及综合时滞效应和p h 值差异的释药 系统等等【1 0 1 1 1 。 1 1 2 1p h 依赖型释药系统 p h 依赖型释药系统是目前应用最广的结肠给药系统，它不仅研究最多而且制 备方便。一般在消化道内胃的p h 为o 9 1 5 ，在结肠为6 5 7 5 。所以口服结肠 定位的体外研究方法一般以0 1m o l l 1h c l 模拟o c d d s 在胃中的情况，p h 7 2p b s 模拟o c d d s 在结肠的情况。 有学割1 2 】利用结肠高p h 生理环境溶解适宜聚合物包衣材料( 如甲基丙烯酸树 脂、e u d r a g i ts 和e u d r a g i tl ) 的原理制备了5 氨基水杨酸的结肠定位释药系统，可 阻止药物在胃的酸性环境中释放，改善药物在碱性环境中的释放，可作为o c d d s 材料。邱雪兰等【l3 j 制备了一种康复新结肠靶向胶囊，通过体外溶解度测定发现胶 2 第一章绪论 囊在进入结肠前已有3 0 左右的药物溶出；而在体内运转试验中，制剂几乎都是 到达结肠后方才溶出，是因为体内运转的观察指标( 硫酸钡) 在包衣膜完全破裂 后方才扩散。在小肠液中，药物可能已通过衣膜的空隙溶解出来。该靶向胶囊的 结肠靶向性有待进一步研究。林友文等人【1 4 】合成了水溶性的n ( 2 磺酸基苯甲基) 壳聚糖，反复在p h = 1 0 的人工胃液和p h = 7 4 的人工肠液中交替浸泡表现出明显 的p h 敏感性和良好的可逆的溶胀收缩性能。把药物包埋于凝胶网络中，利时滞释 药系统提高其生物利用率。此水凝胶有望作为药物载体用于开发具有p h 敏感性的 口服结肠定位给药系统。 1 1 2 2 时滞释药系统 时滞释药系统的原理是利用控释等技术延迟制剂开始释药的时间，使药物在 胃和小肠不释放，到达结肠时大量释放的系统。虽然胃排空时间变异较大，但药 物通过小肠的时间是相对固定的，药物口服后依次经胃、小肠到达结肠需要约6 h 的历程i l5 1 。一般选用包衣技术，比如采用溶蚀型、亲水膨胀型等辅料来达成时滞 的效果。 吴伟等【1 6 】设计的在体交联包芯片以含药素片为核心，其周围包裹有包衣材料， 外层包衣阻滞材料采用特定用量和高重量份钙盐的果胶钙盐混合物，通过在体交 联过程用于结肠定位给药的在体交联包芯片。这种包芯能延滞药物释放，达到理 想的结肠定位释药，同时不必使用较多的包芯材料。张为胜等【l 7 】设计了一种新型 的蒙脱石结肠定位释放片，在于蒙脱石片外面包衣了一种在胃液、小肠液中均不 溶的p h 依赖型结肠溶树脂薄膜衣。这种新载体在胃和小肠中不释放药物，保证了 药物定量输送到结肠中，还可提高发病部位在结肠及直肠的各种急、慢性腹泻尤 其是结肠炎等的疗效。除此以外，刘庆芸【l8 】发明了一种治疗结肠炎的结肠靶向定 位制剂及制备方法，该制剂由蒙脱石、粘合剂和润滑剂组成。蒙脱石药物与粘合 剂、润滑剂混合后再加硬脂酸美混合压片，最后包衣得到蒙脱石结肠定位肠溶片。 把上述药片装入普通胶囊，外包结肠溶肠衣膜即可。该制剂在上消化道不崩解、 不释放。到达小肠末端，结肠部位制剂崩解后释放药物，药物直接与肠道病灶部 位接触提高疗效。这种制备方法非常简单，操作也很方便。 1 1 2 3 压力控制型释药系统 对于大多数水溶性的药物，先将药物与渗透活性物质制成片芯，然后再用醋 酸纤维素等不溶性高分子材料包衣( j i a 致：f l n 或包衣后用激光等方式制孔) ，形成 具有小孔的刚性半透膜。在使用条件下，体液中的水分通过包衣膜进入片芯，使 其中的药物和渗透活性物质溶解，在片芯内形成具有高渗透压的饱和溶液。于是， 药物在压力作用下通过小孔向环境释放。现在，一些难溶性的药物也被制成了压 力控释片，取得了良好的效果。由于结肠内大量的水分和电解质被重吸收，导致 肠内容物的黏度增大，当肠道蠕动时对物体产生较大的直接压力，使物体破裂。 北京化t 人学硕i ：学位论文 依此原理设计了压力控制型胶囊【l9 1 ，即将药物用聚乙二醇) 溶解后注入在内表面涂 有乙基纤维素的明胶胶囊内。口服以后明胶层会立即溶解，内层的乙基纤维素此 刻呈球状( 含有药物) ，到达结肠后由于肠压的增大引起其崩解，药物立即释放出来。 1 1 2 4 菌群触发型释药系统 消化道内的p h 值变化、病人的病理的状态、食物组成以及个体的差异等等很 多因素限制了前面几种释药系统的发展。菌群触发型释药系统由于能被结肠内的 菌群降解而具有精确的定位性，其研究已成为结肠靶向研究领域的热点，前景被 普遍看好。结肠细菌能产生许多独特的酶系，譬如特异偶氮还原酶、多糖酶、各 种糖苷酶等，菌群触发型释药系统就是利用结肠菌群产生的特异酶作用于包衣材 料或阻滞剂，使高分子材料降解而释放药物的触发释药系统【2 0 1 。所以能够在结肠 部位降解的高分子材料可以作为药物载体制成结肠酶控制型制剂。壳聚糖、明胶 等天然聚合物含有大量可产生衍生物的基团，大范围的分子量，种类繁多。除此 以外，这些天然材料的低毒性以及生物降解性，使制备生物降解的释药系统成为 可能。 魏农农等【2 1 】制备了一种p h 依赖和酶依赖的结肠定位壳聚糖包衣氟尿嘧啶脂质 体，并对进行体内外药剂学实验，发现此结肠靶向制剂在人工结肠液中2 h 后，药 物基本释放完全，达到结肠定位释放；在人工结肠中加人酶后，药物释放迅速后 达到结肠定位释药的要求。s h i m o n o 等人研究了一种复微粒壳聚糖分散系统( c d s ， 内层是药库，外层是控释层) 【2 引。控释层是以亲水或疏水的聚合物作为基质，壳聚 糖粉末分散在基质中。药物在从胃到结肠的任何地方都可以从c d s d x 球中释放。 所以当用作结肠靶向时，还需再加一层肠衣，以保护壳聚糖层不在酸性条件下溶 解，阻止药物在胃里的释放。加肠衣的c d s 胶囊给狗口服后l - 3 d 时内到达大肠， 在结肠中降解。国外用壳聚糖胶囊制备的胰岛素结肠靶向制剂体外试验表明，在 人工胃液和人工肠液中均没有药物释放，而在含有盲肠内容物的介质中药物显著 释放。动物体内实验表明，口服2 0 0 0 i u 胰岛素和甘胆酸钠的壳聚糖胶囊后，胰岛 素吸收很好，降糖作用在给药8 h 开始，与药物到达结肠时间相一致【2 3 】。 1 1 2 5 其他释药系统 胃与肠的p h 有显著地差异，但是小肠和结肠的p h 差异较小，单纯利用结肠 细菌的作用以及在病理情况下可能出现结肠p h 比小肠还低的情况，或者单纯利用 p h 差异进行释药结果可能也不理想。除此以外，药物在胃肠的转运过程中胃的排 空时间在不同情况下有很大差异，但通过小肠的时间相对恒定( 约为4h ) ，单纯 利用时滞进行释药也存在一定的难度。所以，综合时滞效应和p h 差异等2 种或3 种释药机制的o c d d s 可以在一定程度上克服单一释药系统因受胃排空、p h 差异 4 第一章绪论 以及个体差异等因素影响而出现的药物释放难以预测与控制的情况，合乎新型 o c d d s 的需要【2 4 j 。 熊索彬等【2 5 】设计了综合利用时滞效应和胃肠道p h 值的差异的结肠定位释药 功能的口服药物，以有效药物成分与药物中允许接受的辅助成分共同组成药芯， 其外包覆有山亲水凝胶或吸水膨胀型高分子材料中的至少一种构成的内包衣层， 最外层包覆有肠溶型高分子材料的外包衣层。这种药物可制成包括片剂、小片、 小丸、颖粒、软胶囊和硬胶囊等多种常用的口服型药物制剂。通过综合利用时滞 效应和胃肠道p h 值的差异，能实现满意的结肠定位快速释药目的，提高了其结肠 定位的可靠性，使药物到达病灶部位后能迅速释放，发挥治疗作用，提高疗效， 减小毒副作用的产生。除此以外，还有学者通过包衣技术达到时滞型与p h 依赖型 相结合的技术用于将美沙拉嗪结肠定位释药系统【2 6 】的研究中，将药物与琥珀酸、 乳糖、羟丙基甲基纤维素等辅料用湿法制粒后制备片芯，再依次以羟丙基甲基纤维 素液、丙烯酸树脂号液、羟丙基甲基纤维素液及邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素 液进行包衣，制得时滞型的结肠定位控释片，最后体外释放试验结果得到在模拟胃 肠液中的时滞于6 h 时累积释放率达8 5 。 综上所述，o c d d s 有着良好的前景，该给药部位的开发对于许多疾病的治疗都 有非常重大的意义。在各种释药机理f 1 趋发展的同时，我们发现综合时滞效应及胃 肠p h 设计的o c d d s 具有工艺相对简单，给药受胃肠道环境影响相对较小等优点。 而目前存在的药物释放机理中单一结肠药物定位效果不尽人意，因此o c d d s 的发 展方向是如何巧妙地将现有的药物传递机理结合起来协同发挥结肠定位的作用 【2 7 1 。 1 1 30 c d d s 的材料 o c d d s 的载体材料主要有偶氮类、多糖类以及偶氮与多糖联用材料等等。其 中偶氮类载体材料在制备过程中需要进行化学改性，不仅在药物选择上具有很大 的局限性、收率不高，而且偶氮类材料细胞毒性大，生物相容性差，降解速率欠 佳【27 。该类载体材料在结肠降解速度往往不能保证，有原形排泄的可能，因此如 何快速降解及寻找无毒的结肠降解的材料是其需要解决的首要问题。多糖类的材 料不仅消化道上部不能被吸收能够被结肠内的菌群降解，还具有良好的生物相容 性和低毒性，是结肠定位给药的载体材料的佳选。用作o c d d s 的多糖载体材料主 要有壳聚糖、果胶、瓜尔树胶、葡聚糖、菊粉、直链淀粉、a 淀粉、果胶酸钙、 环糊精、海藻酸、环葡聚糖和凝胶多糖等【l ，这些材料来源广泛，分别来源于动 物、植物、藻类以及真菌和细创列j ，形式主要有多糖胶衣、多糖凝胶和多糖前药。 但是，在o c d d s 应用方面天然高多糖也存在一些缺陷，例如机械性能较差，稳定 北京化t 人学硕l ：学位论文 性不好等，加之有的生产成本较贵，限制了材料的产业化。 本研究选用天然材料壳聚糖为原料，壳聚糖广泛存在于虾蟹的甲壳以及植物的 细胞壁中，来源广泛。本研究通过对它的改性制成水溶性的壳聚糖，侧重于与天 然材料京尼平交联从口服结肠定位释放体系展开进一步研究。 1 2 壳聚糖基材料 1 2 1 壳聚糖概述 甲壳素( c h i t i n ，结构如图1 2 所示) 又名壳多糖、壳蛋白、几丁质，是自然界 中存在的唯一天然碱性多糖，其化学名为( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧b d 葡聚糖，它 的结构是由n 乙酰氨基葡萄糖以l ，4 糖苷键缩合而成的1 2 弘3 2 j 。甲壳素来源广泛， 存在于甲壳纲动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌( 酵母、霉菌) 的细胞壁和 植物( 如蘑菇) 的细胞壁中，其中虾壳中甲壳素的含量为2 0 ，蟹壳中含量为1 7 1 8 ，年生物合成量估计将近1 0 0 亿吨。甲壳素是地球上是地球上除蛋白质外数量 最大的含氮天然有机化合物，也是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物。d 3 j 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素的碱化n 脱乙酰基产物，化学名称是( 1 , 4 ) 2 氨基2 脱氧p d 葡聚糖。糖链骨架包含高度n 脱乙酰的b 1 ，4 接枝d 葡糖胺，与纤维素 的结构十分相似，只是c 2 上的乙酰氨基取代了羟基。通常情况下我们认为，n 乙 酰基脱去5 5 以上为壳聚糖，这种脱乙酰度的壳聚糖可以溶解于p h 6 的稀酸溶 液中，不溶于普通有机溶剂。纯净壳聚糖为白色或灰白色，半透明的片状固体。分 子量它的相对分子质量从数十万到数百万不等，通常其脱乙酰度为8 0 - - 9 5 蝌3 4 j 。 n 脱乙酰度和黏度( 可反应平均相对分子质量) ，是壳聚糖的两项主要性能指标。 1 8 1 1 年，法国人于大自然中最早发现了甲壳素，之后于1 8 5 9 年又发现了甲壳 素的脱乙酰基产物壳聚糖( 一种唯一的碱性天然多糖) p 5 1 。在2 0 世纪7 0 年代以前主要 是欧美的一些国家在研究甲壳素、壳聚糖，后来研究的重心转移到日本，我国直 到1 9 5 2 年才正式开始研究壳聚糖。2 0 世纪8 0 年代上半期，近几十年来，甲壳素和 壳聚糖在国内外都被当作热点研究的课题。据统计，近十年来日本平均每3 天就申 请l 项有关壳聚糖的专利，日本和美国是壳聚糖的主要生产国家和消费国家。我国 从2 0 世纪中期也开始开展有关的研究和产品开发，且很快成为生产壳聚糖的主要 国家。到目前为止，甲壳素及壳聚糖在医药、生命科学、功能材料、食品、化妆 品、农业、日用化学品等很多重要领域都已有应用。 6 第一章绪论 0 1 1 1 节n h ：观r 瀚n h 2 蝉o h 带= 旷z 舳i l 伽 硼i - o h 油i 、赢 图1 - 2 甲壳素和壳聚糖的结构 f i g 1 2s t r u c t u r eo fc h i t i na n dc h i t o s a n 1 2 1 1 壳聚糖的结构和性质 壳聚糖大分子链是纤维刚性结构，含有大量的氨基和羟基，带正电荷【3 6 】。它 具有许多的离子型伯胺基、仲羟基和伯氨基，分子中存在许多游离胺基，因而具 有许多独特的性质，而且能轻易进行化学反应以及和酸反应形成盐。所以，壳聚 糖能进行一系列的氨基反应，其中最典型的是n 乙酰基反应和s h i f t 反应。此外， 它和许多多糖一样结构中也存在可利用的反应性羟基，也能衍生化。壳聚糖的阳 离子和水溶性的阴离子大分子如糖胺聚糖、蛋白质或合成的阴离子化合物通过静 电相互作用可形成聚电解质复合物。因此，壳聚糖结构使其可能极易在复合材料 或超分子结构中结合，制备互相贯穿的网状物、聚电解质复合物、接枝共聚物、 混合物或其他结构物质。在实际应用方面，壳聚糖具有良好的生物可降解性、生 物相容性、可利用的活性基团，使其在生物医学中得到广泛的应用。壳聚糖可以 很容易被制备成透析膜、吸收性缝线、伤口愈合促进剂、药物释放载体及人工皮p 。 并且由于壳聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及无毒副作用，因而范 围十分广泛，其在工业、农业、食品行业、化工环境保护等领域具有广泛用途【3 弘”】。 1 2 1 2 壳聚糖的化学改性研究 壳聚糖的分子内n h 2 与h + 结合或解离，可以表现出明显的p h 敏感性，但由于 它只溶于一些酸而不能溶于水和有机物，大大限制了它的应用空间。壳聚糖的分子 上具有较多的侧基官能团，可以在伯胺基、伯羟基以及仲羟基上进行种种化学反 应，如酯化、醚化、氧化、磺化等m 】，不但可以改善壳聚糖的一些理化性能和生 物学性能，还可以解决它在水中或有机溶剂中的溶解性，使壳聚糖能够应用于更 广泛的领域。 通过引入羧酸基、磷酸基等亲水性基团，可以破坏壳聚糖的分子规整性，削 弱分子问和分子内氢键，使壳聚糖具备一定的溶解性。此实验也选用了在壳聚糖 分子内引入羧酸基，通过壳聚糖的- n h 2 和与丙烯酸的不饱和碳碳双键之间的迈克 北京化t 人学硕i ：学位论文 尔加成反应将丙烯酸引入到壳聚糖分子链上，成功实现水溶性。在实验中，丙烯 酸既作为壳聚糖溶于水介质的质子给与体，又是迈克尔反应的反应物，由此制的 水溶性的壳聚糖。 壳聚糖分子链上的活性基团可以进行接枝共聚反应，从而满足特殊的需要。 壳聚糖的接技共聚至今只报道了化学法和辐射法两种。聚乙二醇是一种血液相容 性良好的材料，分子量较高具有在乙醇中冷却结晶的特性。h u 等通过三步反应将 聚乙二醇接枝到壳聚糖链上，因此将水溶性的聚乙二醇( p e g ) 接枝到壳聚糖分子 链上，不仅能利用聚乙二醇优良的生物学性质，而且还改善壳聚糖的溶解性。刘 澜等【4 l 】以硝酸铈铵为引发剂，使壳聚糖与阳离子单体甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯 化铵( d m c ) 通过接枝共聚反应，得到改性壳聚糖絮凝剂。这种絮凝剂用量少、沉 降速度快、絮凝效果好，通过对实际废水处理的比较证明它的絮凝性能良好。 壳聚糖的c 2 糖残基在上有一个乙酰氨基或氨基，在c 3 上有一个羟基，从构象 上来看是平伏键，这种特殊结构使壳聚糖对具有一定离子半径的一些金属离子在 一定的p h 下有螯合作用。壳聚糖与金属离子螯合后，本身的结构并未改变，但产 物的性质改变了。如壳聚糖与钛离子形成红色的螯合物，与三价铁产生黄绿色， 与铜离子产生蓝色。 除此以外，壳聚糖可通过双官能团的醛或酸酐等进行交联，交联可以使产物 不溶解，甚至溶胀也很小，性质很稳定。壳聚糖的力学性能很差，溶胀后很容易 胀裂，所以经常通过交联的方式对它进行改性，除此以外这对于壳聚糖作固定化 酶载体也很重要。交联一般是醛基与壳聚糖的氨基生成西佛碱型结构，其次才是 醛基与羟基的反应。交联的条件很简单，一般可在室温下进行，而且反应速度较 快，反应的介质可以是水或者和非均相介质，而且可在很宽的值范围内发生。 1 2 1 3 壳聚糖的应用 壳聚糖及其衍生物具有许多特别的性质，例如对重金属离子的螯合性、抗菌 性、抗病毒性、抗癌性、促进伤口的愈合等等。因此，它在污水处理、贵金属回 收、膜分离、化妆品、功能膜材料等方面获得了广泛的应用【4 2 1 。在生物医学方面， 壳聚糖及其衍生物由于其独特的性能也得到越来越多的重视。 例如利用壳聚糖制成的可吸收缝合线具有高强度、易打结、柔韧性好的机械 性能和促进伤口愈合、抗溃疡等药理作用。并且可以通过对壳聚糖的化学修饰如 乙酰化等增强纤维性能，或与其它物质如丝胶蛋白共混制成功能化纤维，以此改 善天然材料在体内环境中抗张强度损耗快的缺陷，同时也避免了较大的组织反应。 赵宏霞等以胶原和壳聚糖制成复合膜，通过动物实验测不同配比的复合膜对出血 创面的止血时间发现它的止血效果比明胶等一般止血材料好。何兰珍等通过冷冻 壳聚糖明胶共混液诱导相分离的方法，制成多孔性、亲水性和透气性良好的海绵 第一章绪论 状伤e l 敷料【4 3 1 。z h a o 等采用相分离方法制备了一种与正常人骨组成类似的新型的 生物可降解的羟基磷灰石壳聚糖明胶网状物，作为骨组织工程的三维生物仿生支 架，动物实验证明复合材料支架用于骨组织工程的可行性4 4 1 。 1 2 2 交联剂的选用京尼平 由于壳聚糖膜中含有大量的亲水基团，因此较易溶胀从而导致膜的尺寸稳定 性差以及力学性能强度低，对应用造成一定的影响，所以常用交联的方法对其进 行改性。物理交联法的交联度较低且不均一，所以常采用化学交联法。很多化学 交联剂如戊二醛、甲醛、三聚磷酸盐、乙二醇、二环氧甘油醚和二异氰酸盐【4 5 舶1 都被报道使用过，其中以戊二醛作为交联剂最为常见。如k i m 等用戊二醛对聚乙烯 醇壳聚糖共混膜中的壳聚糖进行交联，结果发现经过交联以后，膜的结晶度和溶 胀度下降，但热稳定性和机械性能有所提高【47 1 。戊二醛( g l u t a r a l d e h y d e ，g a ) 具 有水溶性，含有双官能团分子，它可以与壳聚糖分子中的氨基发生s c h i 饭应而使 其分子发生交联【4 s 】。除此以外，它还有价格低廉的优点。但是戊二醛易使组织硬 化、钙化，具有非常强的细胞毒性，会降低正常细胞的存活率和破坏大分子药物 的完整性【4 9 】，这导致了使用戊二醛进行交联处理的生物组织在植人人体以后在一 定程度上影响了受体j 下常组织的生长，进而影响了创口的愈合和功能的恢复。而 且它交联时产生的希夫碱是一种易发生可逆性反应的交联产物，其逆反应可释放 较多的戊二醛分子，引发较严重细胞毒性反应和炎性反应。京尼平( g e n i p i n ，g p ) 是最近开始研究的一种交联剂，可用于交联明胶、壳聚糖等材料，其最大优点在 于毒性很低【跏5 1 】。本实验选用这种新型天然材料作为交联剂。 京尼平是一种提取白栀子果实的天然交联剂，其毒性远远低于传统的化学交 联剂。细胞实验表明其毒性低于戊二醛1 0 0 0 0 倍，而细胞增殖能力高于戊二醛组 5 0 0 0 倍【5 2 】。有研究人员【5 3 】在细胞毒性实验中发现戊二醛交联明胶微球毒性较大， 使细胞形态功能发生变化，甚至有死亡现象。而京尼平制作的微球几乎无细胞毒 性，在支架中其浓度低于0 5 时组织无明显炎性反应，各浓度组细胞毒级均为i 级，细胞生长状态良好。 1 2 2 1 京尼平的概述 京尼平是茜草科植物栀子果实中的有效成分，也是传统中药杜仲的活性成分 京尼平甙提纯得到的产物。一般制备流程为京尼平甙用1 3 葡萄糖苷酶水解后用乙 醚萃取，然后经过真空浓缩和重结晶而制得，除此以外还可以通过微生物转化( 例 如酶固化【跏) 的方法获取。杜仲属于杜仲科的一种落叶乔木，一般分布于我国的 长江中游及南部各省，除此以外河南、陕西和甘肃等地也有栽培，其树皮可入刻”j 。 9 北京化t 人学硕l j 学位论文 京尼平除了可以作为化学交联剂外，还常被作为一种消炎利胆药应用于治疗肝脏 疾病、降压、通便各等疾病，并且广泛用于食品的染色和指纹采集试剂5 6 1 。从化 学结构上看，京尼平( 如图1 3 ) 是一个环烯醚萜类的杂环化合物，它具有o h 、 c o o 等多个活性官能基团，可以自发的和氨基起反应生成一种深蓝色的色 素5 7 。5 8 1 ，达到以单分子或多分子形式交联的效果。 图l - 3 京尼平的结构 f i g 1 - 3s t r u c t u r eo fg e n i p i n 与传统的交联剂比较，京尼平具备一定的优势。京尼平和常用化学交联剂戊 二醛的对比如下表1 1 所示，我们可以发现，京尼平的交联能力强于戊二醛，而且 它相当更不容易被快速降解，利于保持材料的稳定性以及用于缓释材料的药物缓 慢释放。第二，京尼平的生物相容性好，这对于它用于生物材料提供了更优异的 条件。第三，京尼平的低毒性能是其他传统化学交联剂无法企及的。唯一的不足 之处就是京尼平的产量较低，所以当前国内合成或者国际上的定价普遍较高。 表i - 1 戊二醛与京尼平的整体比较【5 6 l t a b l ei - ic o m p a r a t i o no fg e n i p i na n dg l u t a r a l d e h y d e 1 2 2 2 京尼平与壳聚糖的交联反应 1 0 第一章绪论 与目前常用的传统化学交联剂相比，天然生物交联剂京尼平具有良好的生物 相容性、细胞低毒性、抗降解的能力较强利于保持材料的稳定性。将京尼平用于 壳聚糖的交联将有利于壳聚糖在生物医学领域中进一步拓展应用范围。 京尼平与壳聚糖的反应是自发的，很多相关报道说明京尼平能自发的与氨基