（环境科学专业论文）微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究.pdf

s t u d yo n ln - sit ua d s o rp tio na n dm o nit o tin gm e t h o d oio g y f o reic r o c y s tin sb yr e sin s a b s t r a c t i nr e c e n t y e a r s ，t h ee u t r o p h i c a t i o n i s b e c o m i n g t oas e r i o u s i s s u eo f e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n w i t l l r a p i dd e v e l o p m e n to fe c o n o m y b o t he c o l o g i c a l e n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t hh a v eb e e ns e r i o u s l ya f f e c t e db yc y a n o b a c t e r i a lb l o o m s ， e s p e c i a l l yc y a n o b a c t e r i a l t o x i n s p r o d u c e db y t o x i c s p e c i e s o f c y a n o b a c t e r i a m i c r o c y s t i n sd i r e c t l ya f f e c tt h es a f e t yo fd r i n k i n gw a t e rb e c a u s et h e ya r et h em o s t u n i v e r s a lc y a n o b a c t e r i a lt o x i n sa n dv e r yt o x i ct oh u m a nh e a l t h s oi ti sv e r yu r g e n tt o m o n i t o rm i c r o c y s t i n si nw a t e rr e s o u r c e f i r s t l y , t h ei n t r a - c e l l u l a ra n de x t r a - c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fm c l ra n d d h a 7 m c - l rt o x i n sw e r ea n a l y z e du s i n gt h em i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a9 0 5c u l t u r e si nt h e p r e s e n ts t u d y s e c o n d l y , t h ea d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fm c l ra n d d h a 7 m c l r t o x i n sb yh p 2 0a n ds p 7 0 0r e s i n sw e r ec h a r a c t e r i z e d ，a n dt h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s m w a se x p l o r e da c c o r d i n gt ot h ep o r o s i t ys t r u c t u r e so fr e s i n s f i n a l l y , t h ei n - s i t u a d s o r p t i o na n dm o n i t o r i n gf o rm i c r o c y s t i n sw e r es i m u l a t e db yc y a n o b a c t e r i a lc u l t u r e s 、i t l ld i f f e r e n td e n s i t yi no r d e rt oo b t a i nt h et h e o r e t i c a lb a s i sa n dd a t af o rt h en e w m o n i t o r i n gt e c h n o l o g y t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tb o t hi n t r a - c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a ra m o u n to f m c l ra n d d h a 7 m c l rt o x i n si na v e r a g ec y a n o b a c t e r i a lc e l lg r a d u a l l yd e c l i n e d w i t hg r o w t hi nt h ei n i t i a lp h a s e ，e x p o n e n t i a lp h a s e ，a n ds t a t i o n a r yp h a s e h o w e v e r , t h et o t a li n t r a - c e l l u l a ra n de x t r a - c e l l u l a ra m o u n to fb o mt o x i n si n c r e a s e dg r a d u a l l yi n t h ee x p e r i m e n t a lt e r m ，a n dr a t i oo fe x t r a - c e l l u l a ra m o u n tt oi n t r a - c e l l u l a ra m o u n ta l s o g r a d u a l l yr i s e d t h eb e h a v i o r so fa d s o r p t i o no fm i c r o c y s t i n sb yh p 2 0a n ds p 7 0 0 r e s i n sw e r ec o r r e s p o n d i n gw i t l lf r e u n d l i c he q u a t i o n a l t h o u g hb o t hh p 2 0a n ds p 7 0 0 r e s i n sc o u l df a s t l ya d s o r p tm i c r o c y s t i n si nt h er a n g eo fe x p e r i m e n t a lc o n c e n t r a t i o n s ， h p 2 0r e s i nw a sb e t t e rf o rm o n i t o r i n gm e t h o db e c a u s ei tw a sm o r ea d v a n t a g e o u s d e s o r p t i ni nt o x i n ss o l u t i o nw i t l ll o wc o n c e n t r a t i o n b o t hr e s i nb a g sc o u l da d s o r p ta n d m o n i t o rm i c r o c y s t i n si nt h e c u l t u r e so fm i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a9 0 5p r o d u c i n g m c l ra n d d h a7 m c - l r t o x i n s h o w e v e r , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh p 2 0r e s i n h a db e t t e rb e h a v i o ri nc u l t u r e sw i t hl o wc y a n o b a c t e r i a ld e n s i t y t h e r e f o r e ，t h eh p 2 0 r e s i nw a sr e c o m m e n d e da sa ne f f e c t i v et 0 0 1c o m b i n e dw i t ht 1 1 eh p l cm e t h o dt o m o n i t o ra n df o r e c a s tt h em i c r o c y s t i n sp o l l u t i o ni nw a t e rr e s o u r c e t h cs t u d yp r o v i d e dt h e o r e t i c a lb a s i sa n dp r i m i a r yd a t af o rt h em o m i t o r i n ga n d f o r e c a s t i n gm e t h o d o l o g y o fm i c r o c y s t i n si nw a t e rr e s o u r c e ，w h i c hw a sv e r y s i g n i f i c a t i v ea n dv a l u a b l et op r o t e c tt h ed r i k i n gw a t e rs a f e t ya n dh u m a n h e a l t h k e y w o r d s ：n i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ；m i c r o c y s t ir l s ：h p 2 0 r e s in ：s p 7 0 0 r e s i n ：h p l c 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 o 前言 水作为人类生存必不可少的物质之一，加强水质的监测是十分必要的。由于 社会经济的高速发展，环境污染造成的水体富营养化问题日益严重，水体富营养 化是指大量氮、磷等营养物质受自然因素或人类活动的影响进入水体，使水体中 一些藻类和其他浮游生物大量繁殖，溶解氧量显著降低，从而导致鱼类和其他生 物大量死亡，水质恶化的现象。这种现象发生在海洋中叫做赤潮，发生在江河湖 泊中叫做水华，也称湖靛。与湖泊富营养化相伴随的一个普遍现象就是蓝藻水华 ( o l i v e re ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它是指在适宜的条件下，富营养化水体中的蓝藻在短时 间内大量繁殖并聚集的现象( 高政权等，2 0 0 9 ) ，其发生极为频繁，而且危害严 重。蓝藻水华出现时，厚厚的蓝绿色湖靛覆盖在水面上，甚至大量堆积在岸边， 大量死亡的藻体在被分解的过程中，散发出难闻的气味，破坏周围的景观，蓝藻 的快速增殖改变了水体的理化环境，使水体透明度降低，溶解氧减少，同时造成 鱼虾等水生物的死亡。当水体中的营养元素被蓝藻耗尽时，蓝藻大量死亡，在被 细菌分解过程中仍然可以释放蓝藻毒素，最终导致水生态系统的迅速崩溃( 高政 权等，2 0 0 9 ) 。蓝藻水华也给水产养殖业、供水及旅游业甚至人类的饮用水安全 带来极大的危害( 王扬才等，2 0 0 4 ) 。作为有害藻华的一种，蓝藻水华是一个世 界性难题( c a r m i c h a e le ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 我国目前6 6 以上的湖泊、水库处于富营养化的水平，其中重富营养和超富 营养的占2 2 ，富营养化成为我国湖泊目前与今后相当长一段时期内的重大水环 境问题( 黄漪平等，2 0 0 1 ) 。上世纪9 0 年代以来，国内淡水水体的富营养化状 态日益严重，在调查中发现，长江、黄河、松花江等主要河流以及鄱阳湖、太湖、 巢湖、武汉东湖、昆明滇池、上海淀山湖等大型淡水湖中均有大量藻类生长，并 且形成严重的蓝藻水华( 沈建国等，2 0 0 1 ) 。2 0 1 0 中国环境状况公报显示 2 6 个国控重点湖泊( 水库) 中，满足i i 类水质的1 个，占3 8 ；i i i 类的5 个， 占1 9 2 ；i v 类的4 个，占1 5 4 ；v 类的6 个，占2 3 1 ；劣v 类的1 0 个，占 3 8 5 。主要污染指标是总氮和总磷。大型水库水质好于大型淡水湖泊和城市内 湖。在监测的2 6 个湖泊( 水库) 中，营养状态为重度富营养的1 个，占3 8 ；中 度富营养的2 个，占7 7 ：轻度富营养的1 1 个，占4 2 3 ：其他均为中营养， 微囊藻毒素韵树脂吸阳与原位监测方法研究 占4 6 2 ( 中华人民共和国环境保护部，2 0 11 ) 。 伴随着蓝藻水华的发生，有害蓝藻释放出的生物毒素备受关注，在发生水华 的蓝藻中有许多能产生毒素，其中以微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) 的存在最普 遍且与人体健康关系最密切( m o h a m e de ta 1 ，2 0 0 8 ) 。微囊藻毒素是存在于蓝藻细 胞内的毒素，当蓝藻细胞死亡或破裂时，胞内的毒素就会释放到水体中，微囊藻 毒素在被光解或生物降解之前，会在水体中存留较长时间，因此它将直接威胁到 人类的饮水安全，加强对其监测已经是十分必要的。 1 绪论 1 1 微囊藻毒素概况 1 1 1 微囊藻毒素的结构和性质 m c s 是一类环状七肽物质，其分子结构见图1 1 ，化学通式为：环 ( 一d - a l a 1 - x d - e r y t h r o b - m e t h y l a s p - l z a d d a - d - g l u - n m e t h y l d e h y d r o - a l a ) ，图中 ( 1 ) d a l a 是d ，丙氨酸；( 2 ) l x 足可变l 氨基酸，即图中r l 位；( 3 ) d e r y t h r o d m e t h y l a s p ( i s o ) 是d 赤b 甲基天冬氨酸；( 4 ) l - z 是可变l - 氨基酸： 即图中r 2 位；( 5 ) a d d a 是( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) 3 氨基9 甲氧基- 2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基4 ，6 二烯酸，它是特殊的2 0 个碳原子的氨基酸；( 6 ) d g l u ( i s o ) 是d 异谷氨 酸；( 7 ) n m e t h y l d e h y d r o a l a ( m d h a ) 是n 甲基脱氢丙氨酸。由于2 、4 位上两 个可变的l 氨基酸的存在( r i n e h a r te ta 1 ，1 9 9 4 ) ，以及其他氨基酸的去甲基化等 变化，从而形成了不同种类的微囊藻毒素，到目前为止已发现的微囊藻毒素至少 有8 5 种( s i v o n e ne ta 1 ，2 0 0 9 ) ，常见的微囊藻毒素结构和名称见表1 1 。由于构型 的不同，其毒性也存在较大的差异，其中存在最为普遍、含量较高、且毒性较大 的三种变体是m c l r 、m c r r 和m c y r ( 王俊峰等，2 0 0 9 ) 。常见的m c l r 的结构在2 位和4 位上分别为亮氨酸和精氨酸( s p o o fe ta t ，2 0 0 9 ) ，m c l r 是 m c s 中最为常见、己知毒性最强、急性危害最大的一种毒素，其半致死量( l d 5 0 ) 仅为5 0l 上g k g ( j a y a r a je ta 1 ，2 0 0 6 ；a c e r oe ta 1 ，2 0 0 5 ) ，是我国地表水体发生蓝藻水 华时经常遇到的毒素种类。微囊藻毒素相对分子质量约为1 0 0 0 ( m c e l h i n e ye ta 1 ， 微耋蓬童鲞箜塑塑坚堕皇鉴垡堕型查鲨婴窒一 _ 一。 2 0 0 5 ) ，微囊藻毒素不同变体的分子量见表2 1 ，表中不同变体的氨基酸用斜体表 示，相同氨基酸变体的其他变型列在表中的z 列。 l 霉l - x 图1 - 1 微囊藻毒素分子结构图( s p o o f e ta 1 ，2 0 0 9 ) 表1 1 常见微囊藻毒素名称和结构 _ 毒素名称l - x ( r 1 ) l - z ( r 2 ) m c l rl 亮氨酸( l e u c i n e ) l - 精氨酸( a r g i n i n e ) m c r rl 精氨酸( a r g i n i n e ) l 一精氨酸( a r g i n i n e ) m c y rl 一酪氨酸( t y r o s i n e ) l - 精氨酸( a r g i n i n e ) m c l al 一亮氨酸( l e u c i n e ) l 一丙氨酸( a l a n i n e ) m c l yl 亮氨酸( l e u c i n e ) l - 酪氨酸( t y r o s i n e ) m c l f l 亮氨酸( l e u c i n e ) l - 色氨酸( t r y p t o p h a n ) m c l w l 亮氨酸( l e u c i n e ) l 一苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ) 表1 2 微囊藻毒素不同变体的分子量( l a w t o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) a l a n i n e a m i n o i s o b u ( y r i ca c i d a r g i n i n e d a s p 3 ，d h d d a s p 3 d h d l s e r 7 d 队d d 彳 d a s p 3 ，d g i u ( o c h ) 6 ( 6 z ) 一a d d a 5 d a s p 3 ，a d m a d d d d g i u ( o c h ) 6 d a s p 3 ，a d m a d d d ，d h b 7 l m e s e r 7 d a s p 3 ，l m e s e r 7 9 5 21 0 3 7 1 0 0 9 1 0 2 3 i 0 2 3 i 0 4 1 1 0 3 7 1 0 5 2 1 0 4 i 9 0 9 9 3 2 1 0 0 89 9 41 0 2 8 9 6 6 9 8 0 9 8 0 9 9 8 9 8 0 9 9 4 9 9 4 1 0 0 8 ，1 0 2 2 “8 1 0 0 8 1 0 0 9 1 0 1 2 1 0 2 8 10 1 4 ，1 0 2 8 h f 9 5 9 1 0 6 7 1 0 4 4 ，1 0 4 8 1 0 5 8 “。 1 0 3 0 h 7 1 0 3 0 ，1 0 4 4 h y 1 0 3 0 ，1 0 4 4 h y 1 0 6 2 h 7 1 0 7 3 h y 薅糠辩糌瓣。薄舞渴墨打离高睇菹斟去囊斟 z 可变氨基酸x a l a a r g g meh o m ol e um e t h i o n i n ep h e t r yr y r 砌， 4( a )( r )( e ) ( o m e ) i s o l( l ) - s - o x i d e ( f )( w )( y )( v ) a d m a d d d d s e r i a d m a d d a 5 d g l u o c 2 m ( c m ) o # a d m a d d a 5 m e s e ? n m e t h y l l a n t h i o n i n e e ( o m e ) d a s p 3 ，d h a 7 d h 7 l s e r 7 d a s p 3 ，s e r 7 l e u c i n e m e t h i o n i n e - s - o x i d e p h e n y l a l a n i n e t r y p t o p h a n t y r o s i n e 9 6 9 9 8 3 1 0 0 1 9 8 3 9 9 7 1 0 1 5 1 0 0 1 1 0 2 2 ，1 0 3 6 “8 1 0 3 8 1 0 5 21 0 2 8 1 0 4 0 1 1 1 5 9 5 1 9 8 5 1 0 2 4 1 0 0 1 1 0 3 5 9 7 1 h ：字母标注的氨基酸的同系物；t ：四羟基酪氨酸；a d m a d d a ：o 乙酰基- o - 二甲基a d d a ；d m a d d a ：o - 二甲基a d d a ；( 6 z ) 一a d d a ：6 - 顺式a d d a ， 在6 双键顺式a d d a 的异构体：d h a ：脱氢丙氨酸；d h b ：脱氢酪氨酸；m e s e r n 甲基丝氨酸；e ( o m ) ：谷氨酸甲酯。 薅黼瓣排淋吕茸舔潭罨打淘高瞬擅讲i去窜斟 镟囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 由于微囊藻毒素具有环状结构和间隔双键，其稳定性较强，加热到3 0 0 。c 并 持续较长时问仍不能使之分解，虽然微囊藻毒素是多肽类物质，但是普通的蛋白 质水解酶对它们没有任何作用( b u ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。微囊藻毒素在阳光下也较为稳 定，但是在微生物的作用下或有蓝藻色素存在时，其光降解速度会加快( t s u j i e t a 1 ，1 9 9 5 ) 。微囊藻毒素易溶于水、甲醇和丙酮中，不挥发，耐热并耐p h 值变化， 不易沉淀或被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中，此外由于微囊藻毒素分子结构含有 羧基、氨基和酰氨基，所以在不同p h 值下，微囊藻毒素具有不同的离子化倾向 ( r i v a s s e a ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。不同种类微囊藻毒素的甲基基团和2 、4 位上的可变氨 基酸决定了它们的亲水性和疏水性( j a i s w a le ta 1 ，2 0 0 8 ) 。鉴于m c s 能够在水体 中长期存在，潜在威胁人类的饮水安全，微囊藻毒素已经成为饮用水源地水质监 测的指标之一。2 0 0 4 年w h o 颁布执行的饮用水卫生标准中将水体中m c l r 的安全限值暂定为1 州l ，同时暂定微囊藻毒素的日容许摄入量的安全限值为 0 0 4l a g ( k g - d ) ( w h o ，2 0 0 4 ) 。我国现颁布执行的生活饮用水卫生标准( g b 5 7 4 9 ， 2 0 0 6 ) 和地表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 ，2 0 0 2 ) 规定m c l r 的限值为0 0 0 1 m g c l 。 1 1 2 微囊藻毒素的产生机理 微囊藻毒素主要是由蓝藻中的微囊藻属( m i c r o c y s t i s ) 、鱼腥藻属 0 n a b a e n a ) 、颤藻属( o s c i l l a t o r i a ) 及念珠藻属( n o s t o c ) 的某些种类或品系产生的 次生代谢产物( l a w t o n e t a l ，1 9 9 1 ) 。目前产生微囊藻毒素的分子机理现已较为明 确，它是由一类巨酶复合体通过非核糖体( n o n r i b o s o m e ) 途径合成的，这类聚 酶复合体包含肽类合成酶( p e p f i d es y n t h e t a s e ) 、聚酮合成酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e s ， p k s s ) 和其他修饰酶( a r m e n te ta i ，l9 9 6 ；t i l t e t te ta 1 ，2 0 01 ；c h r i s t i a n s e ne ta 1 ， 2 0 0 3 ；r o u h i a n e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。已经测序鉴定了编码m c s 合成酶的基因簇，这个 5 5 k b 的基因簇( m c y a b c d e f g h i j ) 是由一种混合型非核糖体肽类合成酶( 聚酮合 成酶性质，m e y a m c y e 和m c y g ) 的6 个开放式阅读框( o r f s ) 和4 个具有前体 和裁剪功能的m c y f 和m c y h m c y j 的小型o p r s 组成( n i s h i z a w ae ta 1 ，1 9 9 9 ；t i l l e t t e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。m c y a b c d e f g h i j 被来自于m c y a 和m c y d 中心双向的启动子转录 为2 个多顺反子的操纵子m c y a b c 和m c y d e f g h i j ( j a i s w a t 2 0 0 8 ) 。k a e b e m i c k 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 等( 2 0 0 0 ) 研究能够确定除了m c y b 和m c y c 其他所有m c y 基因的启动位，其研 究还发现光照能够影响微囊藻毒素合成酶的产量，在强光照条件下m c y b 和 m c y d 的转录水平有所提升，另外一些特定的人为应激因素能够减弱其转录水平， 如产烷微生物( m e t h y l o g e n ) 和n a c l 等。t o n k 等( 2 0 0 5 ) 研究表明增加光照强度 后，阿氏浮丝藻产生的微囊藻毒素能够变为更多的有毒变体。由此可认为微囊藻 毒素的产生虽然是由基因决定的，但一些环境条件的改变可以调节和控制基因的 表达，由此可见毒素的产生是基因和环境因素共同作用的结果。 1 1 3 微囊藻毒素的危害 微囊藻毒素释放到水体中，不仅可以直接污染水源导致水质恶化，而且还会 对水生生物产生毒性作用，水体中含有一定浓度的藻毒素可导致蚤类死亡、鱼卵 变形、鱼类行为和生长异常及死亡等( j a c q u e te ta 1 ，2 0 0 4 ) 。微囊藻毒素还可以 通过水生生物的富集作用进入食物链，进而危及其他生物的生存，与人类的健康 息息相关。微囊藻毒素进入人体的途径主要是经口摄入和皮肤接触，经口摄入主 要是通过被微囊藻毒素污染的饮用水和食物的摄入；皮肤接触主要是人类在从事 水上活动时，微囊藻毒素通过皮肤进入人体。随着越来越多的学者对微囊藻毒素 的毒性作用进行研究，已经证实了其具有多器官毒性作用，所以微囊藻毒素一旦 进入人体，将对人类的健康造成极大的威胁。 1 1 3 1 对肝脏的毒性作用 微囊藻毒素是一类肝毒素，肝脏是其主要作用的靶器官，它作用于肝脏细胞 和肝巨噬细胞。由于微囊藻毒素抑制了肝细胞中丝氨酸和苏氨酸的蛋白磷酸酯酶 1 a ( p p l a ) 和2 a ( p p 2 a ) 的活性，一方面，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，结果导致 哺乳动物肝细胞微丝分解、破裂和出血，最终使肝充血肿大。另一方面，增加了 蛋白激酶的活力，破坏了磷酸化和脱磷酸化的平衡，从而促进了肿瘤的发生( d u y e ta 1 2 0 0 0 ) 。 1 1 3 2 对肾脏的毒性作用 微囊藻毒素能够破坏小鼠肾脏的正常功能，从而导致其血浆中尿素和肌酸酐 微囊藻毒素的树腊吸附与原位监测方法研究 水平的升高，总蛋白和自蛋白水平的下降，也可以引起鱼的肾小囊腔膨大，凝结 管坏死( 王吴等，2 0 1 1 ) 。m i l u t i n o v i c 等( 2 0 0 3 ) 研究表明，长期暴露在低浓度 的微囊藻毒素的环境中，对肾脏的损伤具有相当大的风险。被微囊藻毒素处理的 肾脏细胞中观察到肾小球毛细血管收缩，淋巴细胞渗入，产生凋亡小体、肌动蛋 白丝被破坏等，同时还使细胞骨架改变，并且引起d n a 损伤，这些改变和损伤 都说明了微囊藻毒素对肾脏具有毒性作用。在细胞水平上，微囊藻毒素的慢性肾 毒性和急性肝毒性的作用机理是相似的。 1 1 3 3 对心脏的毒性作用 l e c l a i r e 等( 1 9 9 5 ) 发现微囊藻毒素是心脏病的潜在致病因素，在血液的动 力学研究中发现，由于受到微囊藻毒素的影响，心脏输出血量和心搏量持续快速 降低，同时还出现血管扩张、血压降低、心率下降以及周围血管发生低血压反应 等。q i u 等( 2 0 0 9 ) 研究发现在微囊藻毒素作用下，小鼠心肌细胞结构变得不规 则，细胞变大，细胞核也随之变大且形状改变，个别细胞出现了细胞质空泡，部 分心肌纤维开始退化。心肌细胞中的线粒体也发生病理改变，线粒体的紊乱导致 小鼠心率和血压下降；同时肌酸激酶和肌钙蛋白i 水平的升高，表明心脏细胞受 损。相应的病理学改变表现在心肌细胞间黏附力的消失和线粒体的肿胀和破裂。 由此得出在微囊藻毒素的暴露下能够引发心脏中毒，造成心肌功能受损，进而导 致循环系统的紊乱。 1 1 3 4 对其他器官的毒性作用 微囊藻毒素除了具有明显肝、肾、心脏毒性外，还能危害肠、脾和脑等重要 器官，引起肠胃炎、过敏、刺激反应及脾脏肿大等其他疾病( f l e m i n ge ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。周伦等( 2 0 0 0 ) 在浙江海宁大肠癌高发区的研究发现，饮用池塘水及河 浜水的大肠癌发病率均明显高于饮用井水和自来水的发病率，结论得出饮用河浜 水、池塘水等浅表水是引起大肠癌的危险因素之一，其中的微囊藻毒素含量与大 肠癌的发病率存在正相关。微囊藻毒素还具有神经和脑部毒性，上世纪8 0 年代 就有学者研究发现微囊藻毒素对幼鼠大脑具有毒性作用。巴西病人在受到微囊藻 毒素污染水源的毒性作用事件中，有很多患者在中毒后出现了各种神经异常现象 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 ( 王昊等，2 0 11 ) 。f e u r s t e i n 等( 2 0 0 9 ) 研究发现小鼠完整脑细胞可以吸收微囊 藻毒素并且细胞内蛋白磷酸酶和细胞活力都受到了毒素的抑制。 1 1 3 5 遗传毒性 对于微囊藻毒素是否具有遗传毒性还存争议，有研究报道，无论是微囊藻毒 素提取物还是纯毒素的a m e s 试验均为阴性，不具遗传毒性( d i n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 z h a n 等( 2 0 0 4 ) 应用人淋巴母细胞t k 6 研究m c l r 的体外遗传毒性，发现2 4h 染毒m c l r 可以诱发t k 6 细胞微核及基因突变，导致细胞染色体损伤及d n a 双链断裂。宋瑞霞等( 2 0 0 4 ) 将微囊藻毒素作用于动物细胞，通过研究发现其导 致细胞染色体损伤以及d n a 双链断裂，同时提高了细胞的微核率。 1 1 4 微囊藻毒素的污染现状 蓝藻作为淡水水体中常见的水生生物，其分布十分广泛，全球范围内有六十 多个国家和地区曾报道过蓝藻水华事件( c o d de ta 1 ，2 0 0 5 ) 。随着蓝藻细胞的破 裂衰亡或溶解，存在于蓝藻细胞中的微囊藻毒素就会释放到水体中。自然界中水 华暴发时，若无外来因素影响使其迅速溶解，水体中的毒素含量最多只有0 1 1 0 岭l ，但是细胞内的毒素则会高出几个数量级( l a h t ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 。大型湖泊、 河流中蓝藻释放的毒素随着大量水体的稀释，不会对水生生物和人类造成威胁， 但是当大规模蓝藻水华暴发时，就会使毒素浓度较高，产生潜在危害( 姜锦林等， 2 0 1 1 ) 。 1 1 4 1 水体中微囊藻毒素的污染 全球很多国家和地区的天然水体，甚至饮用水中都曾检测到微囊藻毒素的存 在。美国、澳大利亚、德国、r 本、台湾等2 0 多个国家和地区都曾报道过其境 内的淡水湖泊、水库等饮用水源中的水华现象，并且在水体中分离检测出了微囊 藻毒素( d a w o s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 近年来，我国湖泊、水库和江河水体的富营养化目益严重，涉及范围不断扩 大。在对长江、黄河、松花江等主要河流以及江西鄱阳湖、江苏太湖、安徽巢湖、 武汉东湖、昆明滇池、上海淀山湖等几大淡水湖泊的调查中发现，这些水体中均 9 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 检测到了微囊藻毒素的存在( 刘培启等，2 0 0 3 ；刘建康等，1 9 9 5 ；王红兵等，1 9 9 5 ； 周伦等，2 0 0 0 ) 。目前我国南北几个省市各水体中均有不同程度的m c s 污染，其 中以沟塘水、河水和水库水最为严重( 许川等，2 0 0 5 ) 。陈刚等( 1 9 9 6 ) 在原发性肝 癌高发地区江苏海门等地的许多沟塘水中都检出大量的微囊藻毒素，河水和沟塘 水中检出的微囊藻毒索最高浓度分别达1 5 5 8p g m l 和3 0 0p g m l 。2 0 0 5 年对北 京市的官厅水库、密云水库和怀柔水库三个重要饮用水水源地的水样进行藻毒素 调查发现，在藻类的高发季节，3 个水库水体中均检出微囊藻毒素，其中官厅水 库7 月份微囊藻毒素最高值达到2 0 “班( 王蕾等，2 0 0 6 ；张娟等，2 0 0 6 ) 。广东 省典型供水水库和淡水湖泊的微囊藻毒素分布较为广泛，毒素组成以m c r r 为 主，水库微囊藻毒素浓度范围在未检出0 9 1 9 “g ，l ( 王朝晖等，2 0 0 7 ) 。 1 1 4 2 微囊藻毒素对水产品的污染 微囊藻毒素不仅可以污染水体，还会在水生生物体内富集。一些研究开始关 注微囊藻毒素在水产品中的累积及其通过食物链对人类健康的潜在威胁。有研究 表明，微囊藻毒素可能通过水生生物如鱼、虾、蟹、螺、蚌等或者经常在水体中 活动的乌龟、鸭子、水鸟等生物的直接摄食在生物体内累积，并通过食物链对人 类健康产生危害( c h e ne ta t ，2 0 0 5 ，2 0 0 9 ；x i ee ta 1 ，2 0 0 5 ；谢平，2 0 0 9 ) 。除了在水 产品中累积，微囊藻毒素还具有其他的暴露途径来危害人类的健康，c h e n 等 ( 2 0 0 9 ) 研究了慢性微囊藻毒素暴露( 饮用受微囊藻毒素污染的湖水、摄食受微 囊藻毒素污染的水产品) 对渔民健康的影响，在经常接触蓝藻水华的3 5 位巢湖渔 民血清中检测出了微囊藻毒素，平均浓度为0 3 9n g m l ，相当于巴西血透析事件 死亡病人的1 8 7 ，通过饮水、水产品渔民每天摄入的m c l r e q 约为2 _ 2 3 9l a g ， 接近或略高于世界卫生组织建议的日允许摄入量( a c c e p t a b l ed a i l yi n t a k e ，a d i ) 值( 0 0 4g g k g ( 体重) 或每人2 3 肛g ) 。因此就目前微囊藻毒素的污染现状来看， 这是一个亟待解决的问题。 1 1 5 微囊藻毒素的监测方法 1 1 5 1 传统方法 目前水体中微囊藻毒素的监测方法多数是定期在典型水体断面采集水样分 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 析其中的浮游生物，鉴定该水样中出现的产毒生物种类和种群的变化趋势，虽然 通过对浮游生物的监测能够提供一种有效的毒素预警方法，但是仍然存在一些缺 陷。首先很难获得具有空间和时间综合性的水样，多数样品只能提供某一时间和 位置浮游生物组成的简短快照；其次这些证据只能间接地说明水生生物污染发生 的可能性，同时藻种多重复合的种内毒性和不必要的预警也有可能发生；最后浮 游生物的监测是一个工作量较大的工作，一些物种的最终鉴定也是很困难的，同 时需要训练有素和专业的研究人员( m a c k e n z i e ，2 0 1 0 ) 。 另外一种监测方法就是将定期采集的水样浓缩和纯化处理后，通过生物、 化学等检测方法对微囊藻毒素进行定性和定量分析，从而达到监测的目的。但是 这种监测技术同样针对性不强，不具有时间和空间的连续性，且样品处理的步骤 比较繁琐，难以实现对饮用水源地微囊藻毒素污染的预警。 1 5 5 2s p ! a t t 方法 固相吸附毒素跟踪技术( s o l i dp h a s ea d s o r p t i o nt o x i nt r a c k i n g ，s p a t t ) 是生 物毒素被动的吸附在装有多孔合成树脂的小袋中，提取出毒素后，利用适当的方 法进行分析( m a c k e n z i ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。s p a t t 的优势在于其操作简单，成本低， 易于储存和运输等；把毒素直接作为目标化合物，毒素不会再进行生物转化；样 品基质简化了提取和分析使其相对纯净，耦合了适当的分析方法( e l i s a ，h p l c ， l c m s ) ，该方法非常灵敏同时能够提供即将发生的水华事件的预警；在毒素动 力学方面提供独一无二的信息，例如新毒素的起源，在环境中的持久性等( p i z a r r o e ta 1 ，2 0 0 8 ；l i n d a h le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。国外学者关于树脂对麻痹性贝毒吸附的研究，其 研究结果表明树脂吸附可以作为藻毒素监测系统的一个有用工具( r o d r i g u e ze t a 1 ，2 0 1 1 ) 。m a c k e n z i e ( 2 0 1 0 ) 研究也表明，s p a t t 可以应用于海洋和淡水中藻 毒素的监测。 1 1 6 微囊藻毒素的检测方法 1 1 6 1 生物分析法 传统的生物分析法通常是用提取的微囊藻毒素对小鼠进行腹腔注射，进而评 价其毒性( b e a s l e ye ta 1 ，1 9 8 9 ) 。充足的毒素量会引起小鼠肝内出血，并导致小 1 1 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 鼠在1 3h 内休克和死亡，解剖时主要的发现是充血的肝脏。这种检测方法优点 在于操作简单，能够检测到未知毒性，但是该方法要使用实验动物，灵敏度较低， 快速作用的蓝藻神经毒素会掩盖作用较慢的肝毒素的存在，而且无法确定毒素类 型及其结构( m e r i l u o t oe ta 1 ，19 9 6 ) 。生物分析法通过动物急性毒性测定间接推 算微囊藻毒素含量，一般无法准确定量( 黄书铭等，2 0 0 7 ) 。 1 1 6 2 化学分析法 化学分析法主要包括高效液相色谱、液相色谱一质谱联用、气相色谱、薄层 层析色谱以及毛细管电泳等，依据微囊藻毒素的物理化学性质结合灵敏度较高的 光电技术对其进行定性、定量分析( 刘成等，2 0 0 6 ) 。 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 一般采用 正相或反相色谱柱对毒素进行分离，然后利用紫外、荧光或化学发光检测器进行 检测( 龙思思，2 0 0 4 ) 。目前分析微囊藻毒素常用的检测器是紫外检测器( 盛建 武等，2 0 0 6 ) 。该方法将被测毒素样品与毒素标准品的保留时间进行比较可对被 测毒素进行定性，将二者的峰面积进行比较可对其进行定量。它可以分析一些气 相色谱无法分析的挥发性差、极性强、热稳定性差的物质。h p l c 是w h o 、美 国等发达国家和我国权威机构推荐的检测微囊藻毒素的标准方法( 陈晓晒等， 2 0 0 9 ) 。高效液相色谱法是目前应用较广、研究较多的方法，主要是由于微囊藻 毒素本身的物理和化学性质以及该法具有良好的灵敏度和选择性。 到目前为止，液相色谱一质谱联用( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y , l c m s ) 技术在微囊藻毒素的分析检测方面得到了广泛的应用。不 同类型质谱分析微囊藻毒素的方法已经建立，其中包括快原子轰击质谱、电喷雾 质谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱。l c m s 不仅可以对微囊藻毒素准确定 量还可以提供大量的结构信息，从而为准确判定微囊藻毒素的含量和类型提供可 靠依据。虽然在l c m s 应用于微囊藻毒素检测的初期，由于仪器价格昂贵等因 素限制了其使用，但随着技术的不断进步，l c m s 技术，特别是h p l c e s i m s 被越来越广泛的应用于微囊藻毒素的检测和结构鉴定( 戴明等，2 0 0 9 ) 。 气相色谱( o a sc h r o m a t o g r a p h ，g c ) 是将样品汽化后，利用样品中各组分 的沸点、极性或吸附性能的不同在两相中进行分离，再通过检测器进行检 微囊藻毒素的树脂吸附与原位监测方法研究 测。其优点在于操作简单、分离效能高、选择性强、分析速度快。气相色谱一质 谱联用( g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t e r , g c m s ) 技术已经比较成熟， 结合了气相色谱分离特性强和质谱仪良好的定性能力，使分离、定量和定性同时 进行。但是它的局限性在于只适合于分析可以气化、稳定性好的样品。考虑到微 囊藻毒素的高极性和在高温下不稳定性，g c 和g c m s 用于微囊藻毒素测定的 应用较少。目前仅微囊藻毒素总量测定应用了g c 和g c m s 方法( y u a n ae ta 1 。 1 9 9 6 ) 。 薄层色谱法( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 是将固定相涂布在平板( 玻 璃板、铝箔等) 上，点样后用合适的流动相进行洗脱，将不同组分的毒素在平板 上分离开。该方法己广泛用于食品分析领域( 柳俊秀等，2 0 0 9 ) 。薄层色谱分析 对水体中藻毒素的检测主要受到检出限过高、无