肝糖原测定实验报告.doc

_肝糖原的提取、鉴定与定量一、实验目的1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。5. 正确掌握溶液转移的操作。6. 正确操作使用分光光度计。二、实验原理（一）肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4十2NaOH Na2 SO4+Cu(OH)22Cu(OH)2十C6H12O6 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH Cu2O(红色)+H2OCu(OH)2 CuO(黑色)+H2O（二）肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意实验材料：（一）仪器1. 普通离心机，室温100恒温水浴箱（2），分光光度计，精度为10mg级电子天平（1）2. 剪刀（1），镊子（1），研钵（1）3. 试管架（1），（10015）mm试管（3）4. 刻度吸量管（2mL1，5 mL2），1000L微量可调取液器（1）5. 100mL容量瓶（1）6. 白瓷反应板（1）（二）实验样品和试剂1. 鸡肝。2. 95乙醇。3. 0.31mol/L(5)三氯醋酸溶液。4. 0.15mol/L NaCl溶液。5. 12mol/L HCl。6. 12.5mol/L(50)NaOH。7. 碘试剂。8. 班氏试剂。9. 5.35mol/L(30)KOH溶液。11. 标准葡萄糖液(50mg/L)。12. 17mol/L(90)H2SO4(用于制备蒽酮显色剂）。13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4-5d。实验方法：吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。（1） 肝糖原的提取与鉴定 操作流程如下：鸡肝约1.0g，剪碎5%CCl3COOH 1 ml研磨至乳状5%CCl3COOH 3 ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min）沉淀（弃去） 上清（取2 ml）2ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟离心5分钟（4000 r / min）上清（弃去） 沉淀蒸镏水1 ml沸水浴2分钟，溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml 浓HCl 5滴加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却糖原溶液2滴 50%NaOH 5滴呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 班氏试剂4滴混匀沸水浴2分钟，观察变化注意事项1. 肝糖原提取一步，向上清液中加入95乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95乙醇，溶液分成两层。总量相对较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2. 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20，30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3. 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。（2） 肝糖原定量测定 操作流程如下：鸡肝0.10 g30%KOH 1.5ml （用吸量管）沸水浴15分钟冷却，全部转入100 ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液 糖原的测定取3支试管，按下表操作。试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0标准葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.00.2%蒽酮溶液（用吸量管）2.52.52.5混匀，沸水浴10分钟，冷却。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。计算：肝糖原(g/100 g肝组织) = A样品0.051001001.11 A标准肝组织重(g)1000四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。（一）结果1.鉴定实验中的呈色对比1) 结果：2) 结论：如图所示，加入提取的糖原溶液后，颜色变浅（碘液稀释后变浅），但并未变成红棕色，所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。2. 鉴定实验中葡萄糖还原反应1) 结果： 2) 结论：水浴后，溶液的颜色加深，但并未生成红黄色沉淀，所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。3. 肝糖原定量测定实验1) 结果定量实验中沸水浴后空白管、标准管和样品管的颜色（从左至右）吸光度测定结果吸光度（A）空白管标准管样品管第一次第二次第三次平均2) 结论：肝糖原(g/100 g肝组织) = A样品0.051001001.11 A标准肝组织重(g)1000根