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文昌鱼分类地位的形态学和遗传学研究 摘要 应用单因子方差分析、聚类分析、主成分分析和判别函数等方法分析了采自 厦门、青岛和日照白氏文昌鱼的3 个种群的形态，测定了这三个种群的c y tb 、 c o i 及1 6 sr r n a 的基因序列，同时从g e n e b a n k 上选取了日本文昌鱼的三个基 因片段序列，探讨了四个群体的亲缘关系及分类地位。结果如下： 1 对文昌鱼三个种群的文昌鱼进行的单因子方差分析发现，三个地区的文昌鱼 种群的1 9 个形态特征的平均值均存在显著差异，种群间的差异大于种群内的 差异，并且发现青岛和日照群体的差异小于厦门与两者之间的差异。聚类分析 的结果表明，三个种群的文昌鱼可分为两个大的类群，类群1 主要由青岛样本 组成，类群2 主要由厦门样本组成，日照群体在两类群都有分布；主成分分析 发现，前四个主成分的累计贡献率达到8 3 8 6 ，第一主成分的贡献率为 6 0 4 2 ，主要受全腹褶长、肛前长和腹孔前长的影响，其他三个主成分的贡献 率分别为9 1 8 、7 2 和7 0 7 ：前三个主成分分布图也能分成两个大的类群： 青岛和日照群体构成一类群，而厦门单独构成另一类群；以判别分析建立的判 别函数，对三个不同群体的综合判别率为9 8 8 ，其中有一条日照文昌鱼被误 判到青岛群体中。 2 比较厦门、青岛、日照及日本文昌鱼c y t b 、c o i 和1 6 sr r n a 发现，三个片 段的分析结果高度一致，多种系统树都将这四种群分成两个类群，厦门文昌鱼 与其它三个分离，单独形成一个类群，其余三个群体形成一个类群。厦门与其 它三个群体的遗传距离：c y tb 为o 2 1 ，c o i 为o 1 8 ，1 6 sr r n a 为0 1 7 ，这 三个数值均以达到种间的遗传距离；而青岛、日照和日本三者之间的遗传距离 在0 0 0 0 0 1 之间，因此这这些群体应属于同一个种。所有结果都显示，厦门 文昌鱼与其它三者之间的遗传差异已达到种间水平。因此本文支持厦门文昌鱼 与青岛及日本文昌鱼为两个种的观点。 关键词：文昌鱼；形态特征；方差分析；主成分分析；聚类分析；判别分析； c y tb ；c o l ；1 6 sr r n a t h et a x o n o m i cs t a t u so fa m p h i o x u si nc h i n ab a s e do n m o r p h o l o g ya n dm o l e c u l a rp h o l o g e n y a bs t r a c t a m p h i o x u si so n eo f t h eo l d e s t ，t h em o s tp r e c i o u sm a r i n ea n i m a l s i ti sc a l l e dt h e l i v i n gf o s s i li nt h ep r o c e s so fe v o l u t i o nf r o mi n v e r t e b r a t et ov e r t e b r a t e ，a n ds oi th a s 1 1 i 曲a c a d e m i cr e s e a r c h v a l u ea n de c o n m i cv a l u e ， 1 w ea n a l y s e dn i n e t e e nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so fa m p h i o x u sb yo n e - w a ya n o v a p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ，c l u s t e ra n a l y s i s ，a n dd i s c n m i n a n tm e t h o d s t h er e s u l t s o fo n e - w a ya n o v as h o w e dt h a ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nm e a n so f19m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r se x i s t e da m o n gt h r e ed i f f e r e n ta m p h i o x u sp o p u l a t i o n s ，a n dt h e r ew e r eg r e a t v a r i a n c ea m o n gp o p u l a t i o n st h a nw i t h i np o p u l a t i o n t h er e s u l t so fp r i n c i p a l c o m p o n e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a tf o u rp r i n c i p a lc o m p o n e n t sw e r ec o n s t r u c t e db y f a c t o rl o a d i n g ，a n dt h ec o n t r i b u t o r yr a t i o so ft h ef i r s tf o u rp r i n c i p a lc o m p o n e n t sw e r e 6 0 4 2 ，9 18 ，7 2 a n d 7 0 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ef i r s tp r i n c i p a lc o m p o n e n tw a s a f f e c t e db yt o t a lb o d yl e n g t h ，l e n g t ho fm e t a p l e u r a lf o l d ，a n u st ot i po fs n o u ta n dt i p o fs n o u tt oa t r i o p o r e i nt h er e s u l to fc l u s t e ra n a l y s i s ，a m p h i o x u sw e r em o s t l yd i v i d e d t w og r o u p s t h ef i r s tg r o u pw a sc o m p o s e db yq i n g d a oa n dr i z h a o ，a n dt h eo t h e r g r o u pw a sc o m p o s e db yx i a m e n t h et o t a la c c u r a c yo fd i s c r i m i n a t i o no na m p h i o x u s w a s9 8 8 ，a n do n l yo n es a m p l ef r o mr i z h a op o p u l a t i o nw a sa p p e a r i n gi nq i n g d a o p o p u l a t i o n t h ed i s c r i m i n a n tf u n c t i o n so ft h r e ep o p u l a t i o n sw e r ee s t a b l i s h e d ， h o w e v e ra l lo fa c c u r a c yb yt h ef u n c t i o n sw e r en o tc h a n g e d 2 c y tb ，c o la n d16 sr r n ag e n ef r a g m e n t so fa m p h i o x u sf r o mx i a m e n , q i n g d a o a n dr i z h a ow e r ea m p l i f i e db yp c r ，t h e nt h ep c rp r o d u c t sw e r ep u r i f i e da n d s e q u e n c e d w ea l s og o ts e q u e n c e so fj a p e n e s ea m p h i o x u sf r o mg e n e b a n k t h e c y tbg e n ef r a g m e n tw a s4 7 2 b p ，a n dt h ea tc o n t e n tw a sh i g h e rt h a ng cc o n t e n t , 6 2 8 t h ec o la n d16 sr r n ag e n ef r e g m e n t sw e r e4 0 3 b pa n d5 7 4 b p ，r e s p e c t i v e l y ， a n dt h ea tc o n t e n tw e r ea l s oh i g h e rt h a ng cc o n t e n t ，6 0 9 a n d6 3 2 t h eg e n e t i c d i s t a n c eb a s e do nc y tbg e n eb e t w e e nx i a m e na n dt h eo t h e rt h r e ep o p u l a t i o n si s0 21 h o w e v e rt h eg e n e t i cd i s t a n c ea m o n gt h eo t h e rt h r e ep o p u l a t i o n si so 0 1 a n dt h e g e n e t i cd i s t a n c eb a s e do nc o ia n d16 sr r n ab e t w e e nx i a m e na n dt h eo t h e rt h r e e p o p u l a t i o n sw e r e0 18a n do 17 ，r e s p e c t i v e l y a l lo ft h ep h y l o g e n e t i et r e e sr e v e a l e d t h a tq i n g d a o ，r i z h a oa n dj a p e n e s ep o p u l a t i o n sw e r ep o o l e di n t oo n eg r o u p ，a n d x i a m e np o p u l a t i o nw a sp o o l e di n t ot h eo t h e rg r o u p a b o v ea l l ，o u rr e s u l t ss u p p o r t e d t h ev i e w p o i n tt h a tq i n g d a oa m p h i o x u sa n dx i a m e na m p h i o x u sm i g h tb e l o n gt o d i f f e r e n ts p e c i e s 。 k e yw o r d s g m p h i o x u s ；m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ；o n e - w a ya n o v a ； p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ；c l u s t e ra n a l y s i s ；d i s c r i m i n a n tm e t h o d s ； c y t b ；c 0 1 ；1 6 s r r n a 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 学位论文作者躲l r 髟肾 聊擗当万锄 导师签字：汐一f 1 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 文昌鱼分类地位形态学和通传学研究 第一章前言 文昌鱼是介于无脊椎动物向脊椎动物进化的过渡类型，是脊索动物门头索动 物亚门幸存物种，有“活化石”之称，由于其具有原始脊椎动物的构造，同时又具 备无脊椎动物的一些特征，因而是研究脊索动物的珍贵材料。系统深入地研究文 昌鱼对于了解动物界系统进程和规律具有重大学术意义。此外，文昌鱼还具有很 高的营养价值，蛋白质含量高达7 0 ，脂肪含量只占2 左右。因此，对文昌鱼 资源进行保护、增殖和适当开发具有一定的经济意义。 在过去的几十年中，我国学者对文昌鱼的生物学、胚胎发育和生殖生理等进 行了深入的研究，认为我国各地的文昌鱼均属于白氏文昌鱼，共包括两个地理亚 种：厦门亚种( 主要分布于福建厦门、广州等海区) 和青岛亚种( 主要分布于河 北秦皇岛、山东烟台、青岛胶州湾等到海域) 。然而，近年来有学者提出将原来 的青岛文昌鱼亚种提升为种，与南方的厦门亚种分别作为两个独立的种。因此， 从多个方面，尤其是遗传学方面重新鉴定两个亚种之间的分化是非常必要的。 随着现代分子遗传学研究的进展，利用分子生物学技术在物种的遗传本质 d n a 水平上进行系统学研究，对传统分类和进化研究提供分子方面的佐证， 已成为系统学研究中的一个新的热点。利用分子生物学标记对物种系统发育的分 析，可以避免因外部形态适应性的趋同进化所带来的影响，因此对文昌鱼进行分 子系统学研究具有重要的意义。 1 1 文昌鱼的分类地位及分布 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i g r a y ) 属于脊索动物门( c h o r d a t a ) 、头索 动物亚门( c e p h a l o c h o r d a t a ) 、文昌鱼纲( a m p h i o x i ) ，又名蛞蝓鱼、双尖鱼、海 矛等。是由德国动物学家p a l l a s 于1 7 7 4 年在英国的c o r r w a l l 发现的，他命名这 种动物为l m a xl a n c e o l a t u s ，后来意大利人c o s t a 在1 8 3 4 年研究了n e a p e l s p o s i l l i p p o 海岸发现的文昌鱼，认为它是一种低等脊椎动物，并确定了它的属名 b r a n c h i o s t o m a 。我国的文昌鱼于1 9 2 3 年由美国学者l i g h t 在厦门首次发现，并 在1 9 3 2 年由b o r i n g 和“正式定名为b r a n c h i o s t o m ab e l c h e rg r a y , 1 8 4 7 ，( 中文名 为白氏文昌鱼) f m 。 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 文昌鱼广泛分布于热带和温带海域，北起大西洋挪威沿海，经地中海、印度 洋一直分布到中国和日本沿岸，美国两海岸也均有发现，向南一直延伸到大洋洲 海滨。在我国文昌鱼主要分布于台湾海峡、东海和黄海。 艄 图1 1文昌鱼分布图 f i g 1 1t h es k e t c hm a p o fd i s t r i b u t i o no fa m p h i o x u si nt h ew o r l d 1 2 文昌鱼的研究概况 1 9 2 3 年，美国学者l i g h t 向国外报道了我国厦门有文昌鱼的分布，此后，我 国学者对文昌鱼研究也逐渐重视起来。1 9 3 1 年，陈子英教授发表中国文昌鱼 一个雌雄同株标本的研究：1 9 3 3 年，金德祥在国外发表了厦门文昌鱼的调查 报告，并附有文昌鱼的照片。自此，越来越多的学者开始了对中国文昌鱼研究。 1 9 3 6 年，中国学者张玺、顾光中等人在青岛胶州湾发现文昌鱼，经他们研 究认为，青岛文昌鱼是白氏文昌鱼的一个新变种，定名为b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i t s i n g t a o e n s e l 5 j 。1 9 5 8 年周才武在比较青岛、烟台和厦门、海南的文昌鱼形态特 征后提出，南方和北方的文昌鱼已出现了明显的分化，前两者应为白氏文昌鱼青 岛亚种，后两者为白氏文昌鱼指名亚种1 6 】。此后，学术界将产自胶州湾及其邻近 海域的北方文昌鱼作为青岛亚种丑b e l c h e rt s i n g t a u e n s e ，而其他产区的文昌鱼仍 被称为厦b e l c h e r i i 。 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 1 9 8 1 年，n i s h i k a w a 研究发现日本产的文昌鱼与青岛产的文昌鱼同属一个亚 种【引。1 9 8 8 年，张庄丽指出分布于福建、广东和广西海区的文昌鱼都属于厦门白 氏文昌鱼，而分布于秦皇岛和青岛海区的文昌鱼是厦门文昌鱼的一个变种【9 】。 1 9 9 7 年曹玉萍研究了河北省东部海区文昌鱼的栖息环境及形态特征后提出 该海区的文昌鱼属厦门文昌鱼的地理亚种【l o l 。2 0 0 1 她又分析了秦皇岛文昌鱼的 种群结构、生物学特征等，并对秦皇岛文昌鱼的分类地位进行了研究，结果表明， 秦皇岛文昌鱼与厦门文昌鱼及青岛文昌鱼同属一个种，从亲缘关系上，秦皇岛文 昌鱼与青岛文昌鱼要更近些【l 。 2 0 0 4 年，王义权等分析了文昌鱼的c y t b 基因序列，研究结果表明，青岛和 日本白氏文昌鱼亚种与厦门海域产的文昌鱼的遗传距离达到种间水平，因此他建 议将青岛和日本产的白氏文昌鱼亚种丑b e l c h e rt s i n g t a u e n s e 提升为种【1 2 1 。 2 0 0 4 年，闰路娜等研究了秦皇岛、青岛和厦门的文昌鱼种群形态特征的分 化，结果发现秦皇岛和青岛分化不明显，而厦门文昌鱼已分化成为一个独立的类 碰 1 3 1 1 1o 1 3 分子系统学的产生和发展 过去的分类学研究主要依据形态特征进行物种鉴定和归类，侧重于形态观察 和描述。随着科学的发展，在系统发育学的发展过程中，对系统发育学理论、研 究方法等深入研究的同时，研究的目标也由宏观的形态逐渐深入到微观的分子。 具体的说，分子系统学是指通过对生物大分子( 蛋白质、核酸等) 的结构、功能 的进化研究来阐明生物类群( 包括已灭绝的生物类群) 间的谱系发生关系【1 4 1 。 相对于经典的形态系统分类研究，由于生物大分子本身就是遗传信息的载体，含 有庞大的信息量，且趋同效应较弱，因而其结论更具可比性和客观性。尤为重要 的是，在一些缺乏以资鉴别形态性状的生物类群( 如微生物和低等动、植物) 中、 以及在一些形态性状可以和现生生物进行类比的已绝灭生物类群中，它几乎成为 探讨其系统演化关系可利用的并令人信服的唯一手段。由于分子系统学的上述特 点j 自其诞生之日起就逐渐在各种生物类群的系统发生研究中得到了广泛的应 用。 分子系统学的早期应用主要是在蛋白质水平上，蛋白质电泳和特殊化学染色 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 体在种内和种间的应用揭示了不同物种间蛋白质变异的幅度，根据这结论，人们 进行了大量的进化研究，并且在人类起源的研究中取得了卓越的贡献。随着对酶 的特性和生物分类的深入研究以及同工酶电泳方法出现，使这个方法产生了巨大 且可比较的数据基础，并在分子系统学上得到了极其广泛的应用。染色体结构和 数目上差异也为种内和种间提供了作为遗传标记有用的来源。氨基酸序列比较提 供了分子钟的第一个指标，并且在系统进化上得到广泛应用；上世纪8 0 年代后， 核酸的实验操作技术和分析方法上的巨大进步导致了对d n a 和r n a 拓展上的 广泛研究，序列分析主要来自核d n a 和线粒体d n a 等遗传物质。目前在分子 系统学中，广泛使用的主要有两种途径，即蛋白质电泳和m t d n a 分析。蛋白质 电泳一个主要特点是能分辨、估计出很高的不同等位基因的差异，但m t d n a 比 蛋白质提供更强的解决能力，可达到定量化的分辨差异，因此m t d n a 的应用在 分子系统学研究中开创了了一个新时代【l 引。 1 3 1 动物线粒体基因组，c y t b 基因、c o l 基因和1 6 sr r n a 基因 线粒体作为细胞器，其生长和增殖受核基因组和线粒体基因两套遗传基因体 系的协同控制。早在1 9 4 9 年，e p h r u s s i 等在啤酒酵母中发现线粒体中含有d n a ， 1 9 6 3 年m n a s s 和s n a s s 用电镜证实了线粒体中存在d n a ，b o r s t 等首先在鸡肝 中分离得到线粒体d n a 。此后，科学家从多种高等动物组织细胞中分离出线粒 体d n a ，并对其结构、性质及功能进行了深入的研究。同时线粒体d n a 作为一 种结构相对简单的基因组，也引起了人们广泛的研究兴趣。 1 3 2 线粒体d n a 的结构特点 线粒体d n a 一般是共价闭合的环状双链d n a 。动物d n a 的大小一般在 1 6 k b 左右，含有3 7 个基因( 1 3 个编码蛋白质基因，2 个r r n a 基一1 2 sr r n a 基因和1 6 sr r n a 基因，2 2 个t r n a 基因) ，1 3 个蛋白质编码基因上有一个e t y b 基因，两个是a t p 酶基因，三个是细胞色素氧化酶基因和7 个呼吸链n a d h 脱 氢酶亚基的基因。t r n a 基因大多数散布在靠近蛋白质编码基因以及r r n a 基因 之间，在t r n a - p r e 和t r n a p h e 间存在有一特殊的d l o o p 结构，是复制所不可 缺少的，并与转录起始相关。 4 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 图1 2 动物线粒体基因组结构图( 参照s a i t o he ta 1 ，2 0 0 0 绘制) f i g 1 2p h y s i c a lg r a p h i co fm i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fa n i m a l s 线粒体d n a 的主要特点是分子量较小。绝大部分基因组在15 7 19 5 k b 之间，是动物最小核基因组的1 2 5 0 0 0 ，处于限制性内切酶的分析范围，基因组 结构相对而言比较简单、稳定，便于进行研究结果的分析。 m t d n a 在遗传上具有相对独立性，一个线粒体内大约有4 - 一6 个拷贝的线粒 体d n a ，单个细胞内线粒体d n a 拷贝数随组织不同而有很大的差异。 m t d n a 是典型的母系遗传，虽然在某些高等生物的受精过程中，精子可以 全部进入卵细胞，但精子只含有1 0 0 个左右的m t d n a 拷贝，而卵细胞内却含有 1 0 8 个以上的m t d n a 分子l l6 | 。因此，来自父系的m t d n a 并不对遗传作出重要 贡献。而且，用限制性酶切技术不可能检测到低于总量1 一5 的m t d n a 分子 【17 1 。由于严格的母系遗传，一个个体就可以代表一个母系集团，在进行酶切分 析时，通过几个随机的动物个体样本就可以获知一个群体的遗传结构【1 8 】，这样 就可以减少供试动物的数量。 m t d n a 的第四个特点就是进化速度快，发生于线粒体的无义突变速率是核 d n a 的无义突变速率的7 倍。群体内变异大，近缘种间解析的灵敏度很高。其 进化速度快的原因主要有以下几个方面： 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 ( 1 ) 选择压力小。细胞核承担了有关细胞的生长发育和新陈代谢的绝大部分功 能，线粒体只是细胞内分子进行呼吸的一个细胞器。核d n a 承担了绝大部分的 选择压力，对m t d n a 的选择压力相对较小，因而其突变容易固定下来。 ( 2 ) 受诱变的影响大。m t d n a 没有与之结合的核蛋白，在某种意义上说，m t d n a 是裸露于诱变剂之中。因为线粒体作为氧化磷酸化和许多代谢反应的场所，自由 基和一些代谢中间物如烷化剂，就在其中积累。这些物质都是强诱变剂，可以使 m t d n a 的突变率增高。 ( 3 ) 代谢增补时间短。由于代谢过程中被损伤与破坏的线粒体需要不断补充， m t d n a 表现快速增殖，为碱基的突变提供了更多的机会，使突变能不断传递下去。 ( 4 ) 复制无校对修复。脊椎动物m t d n a 复制酶a 多聚酶不具备校对能力，且线 粒体缺乏修复机制。实际上在已发现的脊椎动物的m t d n a 中，每10 0 0 个脱氧核 苷酸中就掺有1 2 个随机分布的核糖核酸f 1 9 。2 2 j 。 此) m t d n a 的提取方法简单，每个细胞中m t d n a 有1 0 0 0 一1 0 0 0 0 个拷贝，因 其量小，又具有线粒体双层膜的保护，m t d n a 的提取相对核d n a 来说容易的多， 不需繁复的保护步骤就可获得完整的m t d n a 分子。 1 3 3c - m b 基因、c 0 1 基因和1 6 sr r n a 基因的特点 c 灿基因是种线粒体蛋白质编码基因，该基因全长由1 ，1 4 0 个左右的碱基 组成。已有研究表明，m t d n ac y t b 序列在解决亲缘较近的生物之间的系统发育 关系非常有用，它是对1 3 个蛋白质编码基因中了解的最为清楚的基因，被认为是 最可信的分子标记之一。2 0 0 4 年，王义权等首次通过c y t b 基因同源序列比较评估 了厦门文昌鱼的分类学地位【1 2 】。 c o i 基因是m t d n a1 3 个蛋白质编码基因之一。该基因的产物是细胞色素氧 化酶亚基i ，后者是细胞色素氧化酶的重要组成部分，是线粒体氧化能力关键调 节部位。c o x 多个亚基的复合物镶嵌在线粒体内膜上，其中i ，i i ，i i i = 个大亚 基由线粒体基因编码并定位合成，具有酶催化活性。 c o i 基因其长度约为1 s k b ，在脊椎动物中位于t m a - t y r 和t m a s e r 主2 间。c o i 基因的进货速率是比较慢的，孔晓瑜等进行了魁蚶线粒体c o i 和1 6 sr r n a 基因序 列测定分析，发现中国、韩国和日本魁蚶群体在形态和遗传上差异明显【2 3 】；2 0 0 1 6 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 年，孔晓瑜等扩增了黄河口中华绒螯蟹线粒体基因c o i 片段，并比较其与珠江流 域中华绒螯蟹和日本绒螯蟹线粒体c o i 基因差异【2 4 】；张凤英等对黄鲷线粒体c o i 基因进行了测序研究皿5 1 ；郑连明等分析了凡纳摈对虾的c o i 基因序列片段嘲；李 莉好对中国三种海豚线粒体c o i 基因进行了分析 2 7 1 。此外，c o i 基因还被大量应 用在昆虫的系统分类上，但目前在文昌鱼分类研究中应用较少。 1 6 sr r n a 基因序列较保守，适合于种、属水平及属以上水平的研究，可以 很方便地用保守引物或通用引物定位并进行p c r 扩增，所以对其测序较多，在 不同动物系统学中应用广泛。 国内对1 6 sr r n a 基因的应用主要集中在对脊椎动物研究中，主要是对哺乳 类、爬行类和鸟类的研究。高天翔等利用1 6 sr r n a 研究了大银鱼和小齿日本银 鱼、斑鲦和花鲦以及三种白鲑系统发育关系【2 s 。3 0 】。刘珊等、施燕峰等分别对淡水 豚、鲸及偶蹄类之间的系统发育进行了1 6 sr r n a 的推断【3 l - 3 2 1 。江建平、李悦等 分别对两栖类的两个类群进行了研究口3 3 4 】。吴孝兵等用1 6 sr r n a 对我国保护动 物扬子鳄的起源和进化进行了研究【3 5 】。黄艳艳、张亮等对软体动物的部分种类 分别用1 6 sr r n a 进行了研裂3 6 1 。目前，国内利用1 6 sr r n a 在文昌鱼系统学方 面的研究很少见。 综上所述，m t d n a 的基因片段序列已被广泛的应用于从分子水平上解决动 物间的系统发育问题。除了以上列举的三个片段之外，目前常用的基因还有1 2 s r r n a 、n d 2 和n 0 4 等基因片段。 1 4 形态学方法和分子方法的比较 早期的学者想用比较形态学和比较生理学的方法来研究地球生命的进化历 史，得出有机体的进化历史的主要框架。然而，形态和生理性状的复杂性导致不 可能得到一幅清晰的进化历史。分子生物学的进展大大地改变了这种局面。由于 所有生物蓝图都可以用d n a 来描绘，因而人们可以通过比较d n a 来研究它们的 进化关系。分子方法较经典的形态学和生理学途径有如下优点。 首先，不论是细菌、植物和动物中的d n a 均由匹种碱基组成，可用它们比 较所有比较有有机体的进化关系。 其次，d n a 的进化演变或多或少是有规律的，因而能用数学模型来描述其 7 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 变化，并且可以比较亲缘关系较远的生物间的d n a 。 第三，所有生物的基因组都是由多样性的核酸序列组成，比形态学性状包含 的系统发育信息要多。 鉴于上述原因，分子系统学有望澄清生命系统树中多处对于形态和生理学不 能解决的棘手问题。本实验采用形态和分子相结合的方法，开展文昌鱼系统发育 的研究，为文昌鱼分类地位研究提供理论依据，为其资源保护和开发管理打下基 础。 8 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 第二章文昌鱼种群形态学研究 在动物分类学中，最经典的分类方法是形态学分类法，其中外部形态特征是 最直接、最常用的分类依据。目前，文昌鱼的种下鉴定方要根据身体的肌节数和 体长，并参考生殖腺数、口笠触须、鳍条数等特征。但是传统的形态学分析是采 用可数性状及可量性状的单一比较，这对种间及种上水平的鉴定有效，但对种内 不同地理群体的鉴定往往无能为力【3 7 0 8 】。 迄今为止，有关文昌鱼群体形态差异方面的研究仅有少量报道。2 0 0 5 年， 闰路娜等利用形态学比较了秦皇岛、青岛和厦门地理种群的形态分化【1 3 】。本研 究对文昌鱼的1 9 个形态参数进行综合分析，通过比较各群体间的形态变异，分 析文昌鱼不同群体之间的形态变异特点及其分化规律，旨在为中国沿海文昌鱼的 分类地位提供一些资料。 2 1 材料与方法 2 1 1 样品来源 本研究所用文昌鱼标本于2 0 0 4 年至2 0 0 7 年：分别采集于厦门( 4 0 尾) 、青 岛( 2 9 尾) 和日照( 1 5 尾) ，保存于9 5 的酒精中，在此基础上选取样品直接进 行形态测定。 2 1 2 方法 2 1 2 1 形态特征的测定 根据形态特征和性质不同，将其分为计数性状和计量性状两类，共计1 9 个 形态特征。 ， 计数性状的测定：将文昌鱼置于带光源的解剖镜下，用肉眼分别计数其口笠 触须数( n u m b e ro f b u c c a lc r m e ，b c n ) 、肌节总数( n u m b e ro f t o t a lm y o t o m e s ，t m n ) 和生殖腺数( n u m b e r o fg o n a d s ，g n ) 。 计量性状的测定：将文昌鱼体平放置培养皿中，用游标卡尺测量其全长和体 高，精确到0 0 1 c m ；将文昌鱼体置于装有目镜测微尺的带光源解剖镜下测量其 9 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 吻鳍长和高、背鳍高、腹鳍高、上尾鳍长和高、下尾鳍长和高。文中各量度参数 按如下要求测量： 1 全长( t o t a ll e n g t h ，t l m 吻端到尾端的长度 2 体高( b o d yd e p t h ，b d ) - - - 身体最高处高度( 从背面到腹面的最大高度) 3 ，总重( t o t a lw e i g h t , t 耻未解剖时个重量 4 背鳍起点前长( t i po f s n o u tt oo d g i no f d o r s a lf i n ，s d ) 卅丑端到背鳍鳍起点 的距离 5 背鳍基长( l e n g t ho fb a s eo fd o r s a lf m ，d l ) - - - 背鳍基部的长度 6 尾鳍长( l e n g t ho f t a i lf m ，t f l 蝴鳍起点到末端的距离 7 尾鳍高( h i g h to f t a i lf i n ，脚尾鳍最宽处的高度 8 纯重( p u r ew e i g h t , p w ) 解剖之后除去内脏的重量 。 9 腹肛距( l e n g t hf r o ma t r i o p o r et oa n u s ，a a 卜腹孔到肛门之间的长度 1o 体宽( b o d yw i d t h ，b w d 身体左右两侧的最大距离 1 1 腹孔前长( t i po fs n o u tt oa t r i o p o r e ，s a ) 一吻端到腹孔之间的距离 1 2 肛前长( a n u st ot i po fs n o u t ，a s ) - - 吻端到肛门之间的距离 1 3 肛后长( a n u st ot a i le n d ，舻肛门到尾鳍末端的距离 1 4 口笠长( l e n g t ho f o r a lh o o d ，l o 卜口笠的实际长度 l5 腹肛褶长( l e n g t ho fm e t a p l e u r a lf o l df r o ma t r i o p o r et oa n u s ，虬卜腹孔 到肛门之间褶皱的长度 1 6 腹褶长( l e n g t ho f m e t a p l e u r a lf o l d ，f l 卜腹褶的总长度 2 1 2 2 形态学特征的统计学分析 利用s p s s 软件的a n o v a 程序对文昌鱼3 全种群的变异来源进行了多变量 方差分析( m u l t i v a r i a t ev a r i a n c ea n a l y s i s ) 。将总变异划成两个层次：组间( a p 地理 种群问变异) 和种群内个体间变异，并考察在哪个层次的变异是引起总体种群分 化的主要来源。在此基础上，又分别对不同文昌鱼种群的形态特征进行l s d 多 重比较( 所有p 值均经过b o n f e r r o n i 校正) ；采用欧氏距离( e u c l i d e a nd i s t a n t ) 对所有3 地文昌鱼的1 9 个特征进行聚类分析( c l u s t e ra n a l y s i s ) ；并通过描述原 形指标的均值和标准差，建立相关矩阵，计算该矩阵的特征根和特征向量，再分 1 0 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 别计算出各特征根对应的主成分，从而对文昌鱼种群进行样本的主成分分析 ( p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ) 。利用文昌鱼的1 9 个形态特征值对厦门、青岛和 日照三个文昌鱼群体进行判别分析( d i s c r i m i n a n ta n l y s i s ) ，并选取形态差异贡献 较大的参数建立3 个群体的判别公式3 9 4 。 图2 1 文昌鱼样本采样地点示意图 f i g 2 1t h ed i s t r i b u t i o na n ds a m p l i n gl o c a t i o n so fa m p h i o x u s 2 2 结果 2 2 1 文昌鱼的一般形态学特征 文昌鱼身体细长，左右侧扁，两头尖而细，整个身体呈纺锤形，略似小鱼， 但没有明显的头部，也没有明显的脑和眼、耳、感觉器官，所以又称无头类；在 身体前端有一个黑色眼点，前端的腹面正中有一个由薄膜构成的环形口笠，口笠 周围有4 0 个左右的触须环绕；身体后端有一个比较宽大的矛状尾鳍，背面沿中 线全长有一条由皮肤折成的背褶或称背鳍，并与尾鳍紧相连接；尾鳍的腹侧又和 它前方的臀前鳍连在一起，这些鳍都是不成对的；在臀前鳍的前面，身体的腹部 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 比较扁平，所以这部分的横切面略呈三角形。在这部分的左右两侧，有由皮肤垂 形成的褶状物，称为腹褶。腹褶和臀前鳍的交界处，有一个腹孔。文昌鱼身体 分析，皮肤由单层细胞的表皮和冻胶状结缔组织的真皮构成，体表无鳞，可以看 到体内左右交替地长有呈v ”形平等排列的肌节。 2 2 2 文昌鱼3 个种群的形态学特征差异 厦门，青岛和日照三地的文昌鱼种群的全长、体高和肌节数等1 9 个形态特 征的平均值均存在显著差异( a n o v a ，p o 0 5 ) ，尤其在性腺数，口笠触手和腹 褶长上，种群间的变异大于种群内个体间变异，这说明三地文昌鱼在形态特征上 已发生了明显的种群分化。对三地文昌鱼种群的1 9 个形态特征均值差异进行多 重比较( 表2 1 ) ，结果发现：青岛和日照文昌鱼除背鳍基长之外，其余的形态 学特征较为相似；而青岛与厦门文昌鱼之间，除背鳍起点前长、尾鳍高、纯重、 性腺数和肌节数相似之外，其他剩余的形态学特征皆存在显著的差异( l s d ， p o 0 5 ) ；相似的形态学结果在日照和厦门文昌鱼之间也存在。 2 2 3 文昌鱼形态特征的聚类分析 聚类分析结果表明，采集于三地的8 4 尾文昌鱼样本可明显分成两个类群： 第一类群主要由青岛样本构成：第二类群主要由厦门样本构成。第一类群又可分 成两个小的亚类群：第一亚类群主要由青岛和日照的样本组成，第一亚类群中只 存在一条厦门的样本；第二类群由青岛和厦门样本共同组成，其中青岛样本有 1 1 条，厦门样本有6 条。 1 2 文昌鱼分类地位形态学和遗传学研究 表2 1 文昌鱼厦门、青岛和日照种群1 9 个形态特征的差异 t a b 2 1d i f f e r e n c eo n1 9m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so f x i a m e n ( 1 ) ，q i n g d a o ( 2 ) a n d r i z h a o ( 3 ) l a n c e l e t sp o p u l a t i o n s 性状l23合计差异 c h a r a c t c r i s f i c ( n = 4 0 ) ( n = 2 9 ) ( n = 1 5 ) ( n = 8 4 )，1 21 32 3 全长4 2 6 8 - - l 6 5 63 4 1 8 + - 3 0 63 9 ：3 7 43 9 0 8 - + 6 3 6 2 3 0 3 8 5 0 *3 7 3 * - 4 7 7 * t l2 6 伊弓2 2 02 9 m 4 0 93 3 5 4 5 12 6 6 5 2 2 体高4 1 0 士0 8 12 3 4 士0 3 53 4 1 士0 3 73 3 7 士i 6 8 3 7 o1 7 6 * 0 7 0 *1 0 7 b d2 1 伽巧4 01 7 m 弓0 02 8 m 4 01 7 m 弓4 0 总重0 2 0 士0 0 80 0 4 士0 0 10 0 8 - + 0 0 30 1 2 士0 0 9 6 6 3 8 0 1 5 0 1 1 o 0 4 * b w0 0 4 - - 0 3 60 0 2 m 0 6o 0 3 o 0 2o 0 2 m 3 6 背鳍起点前长1 1 3 士o 2 21 2 5 士0 2 li 4 4 士0 2 11 2 3 ：l 0 2 4 1 1 6 3 - o 1 2 - 0 3 l o加1 9 s do 7 肛1 6 01 o 帖1 8 01 1 0 1 8 0o 7 p 1 背鳍基长3 6 9 0 士6 1 82 9 5 5 士2 9 43 5 仳3 9 63 4 0 5 士5 9 1 9 5 0 7 4 1 1 9 85 4 3 * d l 2 1 0 - 4 5 52 3 孓0 6 43 0 0 - 4 1 22 1 0 - 4 5 5 尾鳍长3 7 5 士o 8 32 5 6 士0 3 53 1 2 - + 0 2 93 2 3 i - 0 8 2 3 0 9 1 1 1 9 0 6 3 * 1 1 9 t h ，1 7 肛5