（农产品加工及贮藏工程专业论文）南瓜糖蛋白的提取与纯化研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 糖蛋白是一类有糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。糖蛋 白具有增强免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、血酯、抗氧化、防衰老等作用， 在开发新药方面具有较大的应用价值。本文对南瓜粉中糖蛋白的提取、分离、 纯化和结构分析展开了研究，主要研究内容和结论如下： 1 以多糖提取的方法进行南瓜粉糖蛋白提取、分离的研究。探讨了水提醇 沉法超声辅助提取南瓜粉中多糖的工艺，对影响南瓜粉多糖得率的几个因子， 进行了单因素试验和正交试验，方差分析表明：温度和醇沉浓度是影响南瓜粉 多糖得率的显著因素：提取的最适条件为温度4 5 ，醇沉浓度7 0 ，料液比1 ：1 6 ， 时间3 0 m i n ，在此条件下，南瓜粉粗多糖的得率为6 6 3 ，纯度为8 1 9 1 。利 用乙醇分级沉淀和s e p h a d e x g 7 5 柱层析相结合的方法将南瓜粉粗多糖分离、纯 化，得糖蛋白，得率为1 3 8 。 2 以蛋白质提取的方法进行南瓜粉糖蛋白提取、分离的研究。探讨了碱溶 酸沉法超声辅助提取南瓜粉中蛋白质的工艺，对影响南瓜粉蛋白质得率的几个 因子，进行了单因素试验和正交试验，方差分析表明：温度是影响南瓜粉蛋白 质得率的显著因素；提取的最适条件为温度6 0 ，p h 8 5 ，料液比l ：1 6 ，时间 3 0 m i n ，在此条件下南瓜粉粗品蛋白质的得率为6 8 2 ，纯度为8 1 2 7 。利用 硫酸铵盐析分级和s e p h a d e x g 7 5 柱层析相结合的方法将南瓜粉粗品蛋白质分 离、纯化，得糖蛋白，得率为0 8 9 。 3 对南瓜粉中糖蛋白的不同提取方法进行了比较，水提醇沉法简便易行， 所需设备少，产品得率高，是较好的提取方法。 4 对南瓜粉糖蛋白进行了简单的结构分析。利用纸层析、s e p h a d e x g 7 5 柱 层析、s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了南瓜粉糖蛋白为均一组分，分子量大约 在3 0 0 0 0 左右。南瓜粉糖蛋白的含糖量为7 8 0 6 ，含蛋白质为1 3 7 4 。紫外 光谱表明南瓜粉糖蛋白中存在o 型糖苷键。 关键词：南瓜糖蛋白提取糖尿病 江苏大学硕士学位论文 a bs t r a c t g l y c o p r o t e i n i sak i n d o fc o m b i n a t i v e p r o t e i n t h a ti s c o m p o s e d o f p o l y s a c c h a r i d ea n dp r o t e i nt h r o u g ht h ec o v a l e n tb o n d i th a sm a n yf u n c t i o n s s u c ha s i m p r o v i n gi m m u n i t y , i n h i b i t i n gt u r n o u t , r e d u c i n gb l o o ds u g a ra n dp r e v e n t i n g o x i d a t i o na n dc a d u c i t y , t h u si th a sr e s e a r c hv a l u ea n dc a nb em a d ei n t on e wt y p e m e d i c i n e i nt h i sp a p e r , t h ee x t r a c t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r ea n a l y s i s o fg l y c o p r o t e i nf r o mp u m p k i np o w d e rw e r es t u d i e d ，t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea s 。f o l l o w ： 1 t h ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o no fg l y c o p r o t e i nf r o mp u m p k i np o w d e rw e r e s t u d i e db yt h em e t h o do fe x t r a c t i n gp o l y s a c c h a r i d e e x t r a c t i o nw i t hw a t e ra n d d e p o s i t i o nw i t he t h a n o lo fp o l y s a c c h a r i d ef r o mp u m p k i np o w d e rw a ss t u d i e d t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d ew e r et e m p e r a t u r e4 5 ( 2 ，e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n7 0 ，w a t e r1 ：16a n dt i m e3 0m i n t h er e c o v e r ya n dp u r i t yo fi m p u r e p o l y s a c c h a r i d ew e r e6 6 3 a n d8 1 91 r e s p e c t i v e l yi nt h ec o n d i t i o n s t h er e c o v e r y o fg l y c o p r o t e i nw a s1 38 f r o mi m p u r ep o l y s a c c h a r i d et h r o u g he t h a n o lg r a d i n g d e p o s i t i o na n ds e p h a d e x g - 7 5c h r o m a t o g r a p h y 2 t h ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o no fg l y c o p r o t e i nf r o mp u m p k i np o w d e rw e r e s t u d i e db yt h em e t h o do fe x t r a c t i n gp r o t e i n e x t r a c t i o nw i t ha l k a l ia n dd e p o s i t i o n w i t ha c i do fp r o t e i nf r o mp u m p k i np o w d e rw a ss t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r t h ey i e l do f p r o t e i nw e r et e m p e r a t u r e6 0 c ，p h8 5 ，w a t e ri ：1 6a n dt i m e3 0m i n t h e r e c o v e r ya n dp u r i t yo fi m p u r ep r o t e i nw e r e6 8 2 a n d81 2 7 r e s p e c t i v e l yi nt h e c o n d i t i o n s t h er e c o v e r yo fg l y c o p r o t e i nw a s0 8 9 f r o mi m p u r ep r o t e i nt h r o u g h v i t r i o l i ca m m o n i u mg r a d i n gd e p o s i t i o na n ds e p h a d e x g 7 5c h r o m a t o g r a p h y 3 b yc o m p a r i n gd i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d sf o rg l y c o p r o t e i n ，t h ee x t r a c t i o n w i t hw a t e ra n dd e p o s i t i o nw i t he t h a n o lw a sp r e f e r a b l e 4 t h es i m p l es t r u c t u r a la n a l y s i sf o rg l y c o p r o t e i no fp u m p k i np o w d e rw a s s t u d i e d t h eg l y c o p r o t e i nw a sp r o v e dt ob eh o m o g e n e o u sb yp a p e rc h r o m a t o g r a p h y ， s e p h a d e x g - 7 5c h r o m a t o g r a p h y a n de l e c t r o p h o r e s i s i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s e s t i m a t e dt ob e3 0 0 0 0a p p r o x i m a t e l y i t sc a r b o h y d r a t ec o n t e n tw a s7 8 0 6 a n d p r o t e i nc o n t e n tw a s13 7 4 t h ee x i s t e n c eo fo - g l y c o s i d el i n k a g ew a ss h o w e db y l a v a n a l y s i so ft h eg l y c o p r o t e i n k e y w o r d s ：p u m p k i ng l y c o p r o t e i n e x t r a c t i o nd i a b e t e s 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学位保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 ：，在算年解密后适用本授权书。 l 不保密囵。 学位论文作者签名：问、琴构 姗q 年缸月如日 与i 为采 、p 年q 月加日 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：夕、寸萝桕 日期：姗年年月知日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。1 9 3 6 年，s u m m e r 分离纯化了植物凝集素半刀豆球蛋白( c o n a ) ，属于一种糖蛋白， 发现它具有凝血的作用。国内外的科学工作者开始了对糖蛋白的性质、结构、功 能的研究，发现植物糖蛋白具有复杂的、多方面的生物活性，尤其许多糖蛋白的 降血糖、降血酯功能，引起了医药界的关注。一直以来，在临床上南瓜被医生指 定为糖尿病患者的辅助食物。据报道，日本北海道有一个村子，村民以南瓜为主 食，这个村子中没有糖尿病患者和高血压患者，因而南瓜成为风靡日本的天然食 品。熊学敏【l 】等分析了南瓜多糖降血糖作用的机理：南瓜多糖可能是以糖蛋白的 形式存在，并含有丰富的多种氨基酸，可刺激胰岛素分泌，产生降糖效果。张拥 军1 2 j 等对南瓜的降血糖作用进一步研究表明：南瓜中确实存在降血糖的有效成 分，且主要是一些大分子的多糖或糖蛋白，南瓜中糖蛋白的存在可能刺激胰岛素 的分泌，增强葡萄糖激酶的活性，促进糖代谢紊乱的恢复。因此，选择合适的工 艺，从南瓜中提取糖蛋白，开发降血糖、降血酯的药物，将是十分有意义的。 1 1南瓜的历史起源及国内外的研究开发现状 1 1 1 南瓜的历史起源 南瓜( c u c u r b i t am o s c h a t ad u t c h ) ，为葫芦科南瓜属植物，一年生蔓生藤本【3 1 。 南瓜初见于本草纲目列入菜部，李时珍谓：“出南番，转入闽、浙，今燕京 诸处亦有之”【4 】。据认为1 5 j ，南瓜的野生祖先产于墨西哥、危地马拉一带。古代 的阿兹特克、印卡和马雅印第安人用南瓜籽作食物，但他们可能丢弃了果肉，因 为野生南瓜只有少量带苦味的果肉，欧洲的探险家们来到新大陆的时候，他们看 到墨西哥、北美和西印度群岛，北至加拿大东南部，南到墨西哥城到处都种植南 瓜，他们以为南瓜是些硕大的瓜种，就把南瓜带回旧大陆，并在西欧到东亚的广 大地区种植。 h a r r ys p a r i s l 6 j 认为，南瓜可能是最古老的最多种多样的葫芦科植物， 它是葫芦科中最典型的属类。最早是在草本植物学中开始描绘南瓜的，随之越来 越扩大。南瓜的果实包括球形果实，扁球形果实，倒卵形及卵形果实，有的表面 平而光滑，有的凹凸不平，也有的表面粘着许多小粒葡萄，大小不一。 南瓜是当果实完全成熟时才被消费的，它们的果实没有木质化，很容易被切 成片。南瓜的可食部分达到8 0 以上，它皮薄肉厚，组织细密，既可以作为蔬菜 实用，又能长期储存代替粮食，是种救荒佳品。在中国，南瓜普遍是一种在秋 江苏大学硕士学位论文 天收获的金黄色的果实。 1 1 2 南瓜的种类及分布1 3 一】 南瓜性状不一，各类名称相互混淆，根据植物学性状，以产地命名，可分为 中国南瓜、印度南瓜、美国南瓜三种。 中国南瓜( c m o s c h a t ad ) ，别名窝瓜、饭瓜( 东北) 、倭瓜( 北京) 、番瓜。 在我国吉林、黑龙江、山东、河北、湖北、四川、云南、贵州、浙江、福建、广 东等省及甘肃省的河西、兰州、陕西省的陕北、江苏的镇江、徐州等地分布最广， 其他各省也有栽培。果实成熟时米黄色或黄褐色而有斑纹，稍有白粉，常有纵走 果沟或果肋。果面平滑或有瘤粒突起。果肉黄色或橙黄色、粘质。种子灰白或黄 白色，较小，边缘稍厚，色泽稍浓，“株柄痕 圆型。代表品种有：湖北的柿饼 南瓜，甘肃的磨盘南瓜，广东的盒瓜，台湾的木形南瓜，山东的长南瓜，浙江的 十姐妹，江苏的牛腿番瓜等。 印度南瓜( c m a x i m ad ) ，别名苟瓜、冬南瓜、洋瓜( 云南) 。在我国西北 最多，其次是东北、华北、华东西南各省及陕西中部分布最多，其他地区也有少 数零星栽培。果实大扁球形、纺垂形或长形等，无沟肋，皮色有灰绿色、墨绿色、 朱红色或橙黄色等。果面无斑纹，肉厚，粘质至粉质，含糖分较高，成熟后才有 品种风味。种子大而厚，乳白色或褐色，周边不肥大，与中央部同色同质，“株 柄痕”斜形。品种有栗南瓜、打木、d e l i c i o u s 、h u b b a r d 、b u t t e rc u p 等品种群。 美国南瓜( c p e p ol ) ，别名西葫芦、番瓜( 兰州) 、葫芦( 玉门) 、香瓜、 荀瓜( 云南) 。在我国西北最多，其次是东北、华北。西南各省的城市附近也有 栽培。果实小，形状色彩变化甚多。肉白色或淡黄色，成熟后果皮坚硬成壳，无 甜味。种子较小，黄褐色，边缘和中央部同色同质，“株柄痕”水平或圆形。 就中国南瓜而言，现在已培育出许多优良品种。如能搅刮出“金丝”的“海 蜇皮南瓜”、甜面窝瓜、砘子南瓜、一串铃南瓜、铁皮南瓜、七叶南瓜、缩面南 瓜、保山南瓜、成都癞子南瓜等。南瓜在我国华北、东北、西北、华东、华中、 西南、华南、台湾等地区分布最广。其多栽于田边，路边，地角及屋侧。在六、 七十年代许多地方都有过集中栽培，由于大多数地区都是采用零星栽培的方式生 产南瓜，因此目前对于全国南瓜的生产情况，没有确切的统计资料。但普遍的说， 南瓜的亩产量在5 0 0 0 6 0 0 0 斤，象齐齐哈尔生产的甜面窝瓜，亩产可达到3 3 0 0 0 至6 0 0 0 0 斤。 1 1 3 国内外研究开发现状 1 1 3 1 南瓜产品的开发利用 我国人民很早就将南瓜作为节令美食享用，或炒，或蒸，或馅，或腌后凉拌。 江苏大学硕士学位论文 一二一 清代汪灏在广群芳谱中，即有秋季用南瓜“和肉作羹”制成南瓜肉羹之记载。 在我国还有许多种南瓜美点，如南瓜蛊八宝饭、南瓜花片、南瓜团子、南瓜素火 腿、南瓜糊等。在国外，南瓜成熟之时，不少国家每年都要隆重举行南瓜节、南 瓜宴。美国人在1 0 月底的万圣节，挖空南瓜内瓤安放蜡烛，制作南瓜灯笼；在 感恩节，有吃南瓜馅饼以及南瓜糕点的习俗【8 】。 近年来，国内外对南瓜的开发利用逐渐增多。南瓜系列食品主要有：南瓜粉、 南瓜饮料、南瓜酱、南瓜罐头、南瓜果脯、三合味南瓜片、南瓜蜜饯瓜干、南瓜 晶、南瓜糊、南瓜糕点、南瓜冰淇淋、什锦瓜果、南瓜果冻、瓜瓤馅饼、南瓜酱 油、南瓜火腿等多种。在这些琳琅满目的南瓜系列产品中，以南瓜粉的生产与销 量最大。中国南瓜粉在日本、韩国、中国的香港和台湾等东亚地区以及北美、北 欧等国有广泛的市场，产品常常脱销。日本既是生产大国，也是南瓜粉需求量最 大的国家，每年大量从中国、美国、墨西哥等国进口大量南瓜粉经过深加工之后 又返销到以上国家。据统计，南瓜粉世界年需求量1 2 万多吨，我国南瓜粉年贸 易量约5 0 0 0 多吨，而目前产量不足3 0 0 0 吨。近年来，南瓜粉已成为我国的重要 出口创汇产品之一。南瓜粉换汇率高于马铃薯和玉米，1 9 9 5 年国际市场南瓜粉 销售价每吨5 万人民币( 5 0 元千克) ，最高可达8 9 万元人民币( 8 0 9 0 元千 克) ，国内收购价每吨1 5 3 万人民币( 1 5 - 3 0 元千克) i h 引。 1 1 3 2 南瓜中营养成分的分析 贺小琼【2 4 】等对南瓜粉营养成分进行了分析，结果表明，南瓜粉营养丰富， 每l o o g 南瓜粉中含脂肪2 2 9 9 、粗纤维1 2 5 4 9 、维生素e 2 0 8 1 m g 、1 3 胡萝卜素 1 2 0m g 、钠2 2m g 、钾3 0 5 0m g 、钙2 1 3m g ，为低脂、低钠、高膳食纤维、高 维生素e 、高1 3 胡萝卜素、高钾、高钙食品。南瓜粉含有人体所需的多种元素 和1 7 种氨基酸，其中赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸 等必需氨基酸的含量较高，是心脑血管病、糖尿病患者和老年人理想的健康食品， 值得开发利用。 1 1 3 3 南瓜有效成分的提取、分离 吴彩娥2 5 1 等通过试验确定了南瓜黄色色素的最佳提取工艺：以9 5 的乙醇 做溶剂，原料切分成0 5 、l m m 的薄片，提取温度7 0 ( 2 ，提取时间4 5 m i n ，料液 比1 ：1 0 ：以丙酮做溶剂，原料打成浆状，提取温度5 0 c ，提取时间6 0 m i n ，料液 比也为l ：1 0 。 张水成【2 6 】研究了南瓜果肉色素提取的基本方法：溶剂为醇醚混合液( 1 ：1 ) ， 料液比为l ：2 ( w v ) ，搅拌，浸提2 次，7 5 * ( 2 干燥得橙红色素浸膏，得率2 6 。 该色素对酸、碱、温度稳定，光照易分解。 罗昌利2 7 1 对南瓜粉中色素、果胶进行了提取、分离和鉴定，确立最优工艺 条件。色素：温度6 0 、乙醇浓度5 0 、料液比1 ：2 5 、时间3 0 m i n ，该色素对 江苏大学硕士学位论文 温度、碱、酸稳定，光照易分解；果胶：温度1 0 0 、时间9 0 m i n 、料液比l ：2 5 、 p h 2 0 ，得率为1 3 6 ，果胶酯化度为2 2 3 6 ，甲氧基含量为3 8 6 ，符合国家 标准。然后对脱色素和果胶后的滤渣进行了脱脂、脱淀粉和脱蛋白处理，得到了 食用纤维，并对其性能和质量进行了研究。 敬大江【3 8 】等采用无机钙盐沉淀的方法，从南瓜榨取的汁液中提取了天然b 胡萝卜素。用质量分数为o 7 的c a c l 2 2 h 2 0 溶液处理，然后再以固液比1 ：8 1 ：1 5 的石油醚作为溶剂进行萃取，收率可以达到8 5 。 孔庆胜【2 8 3 i j 等对南瓜多糖的提取分离进行了研究。南瓜干粉经热水提取， s e v a g 法弃蛋白、透析、乙醇沉淀，干燥即得南瓜多糖粗品，回收率为6 o 。南 瓜多糖粗品经s e p h a d e x g 1 0 0 柱层析纯化，得南瓜多糖精品。用聚丙烯酰胺凝胶 电泳及玻璃纤维纸电泳证明为均一体。南瓜多糖精品的分子量为1 6 0 0 0 ，其用酸 完全水解，经纸层析表明有d 葡萄糖、d 半乳糖、l 5 可拉伯糖、d 葡萄糖醛酸 和木糖组成。其摩尔比分别为0 1 8 l ：0 0 8 3 ：0 0 6 9 ：0 1 7 5 ：0 0 3 1 。该方法提取的南瓜 多糖，收率高，纯度纯。南瓜多糖为酸性杂多糖。 熊学敏【l _ 2 j 等研究了南瓜多糖降血糖有效部位的提取分离及检测。新鲜成熟 南瓜去皮、切片，用水提、醇沉、复溶后用三氯乙酸沉淀，后经大孔离子柱和 s e p h a r o s e 柱、s e p h a d e x a 2 0 0 柱分离，冷冻干燥后得白色粉末状南瓜多糖的降糖 组分，对该南瓜多糖有效组分经纸层析分析和玻璃纤维纸电泳纯度检查，均显示 不多于3 个紫红色斑点，说明该南瓜多糖有效部位为相对单一组分。该提取方法 的收率高，纯度也较高。 张拥军 3 3 j 对南瓜脂多糖的提取分离及其理化性质进行了研究。采用浸泡、 超滤、透析、酸碱处理相结合的工艺，借助于鲎试验法为主要检测手段，从南瓜 中提取得到了鲎试验阳性物质南瓜脂多糖粗品。首次证明了南瓜中脂多糖的存 在，并通过研究提出了一条合理的提取工艺，分析了南瓜脂多糖粗品的组成：葡 萄糖：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖= 4 7 ：2 ：5 ：2 ：6 ，研究了南瓜脂多糖的性质，南瓜脂 多糖溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，分子量在6 0 0 0 0 以上。该提取物经测 定，其中脂多糖的活性不小于1 0 2 e u g 。 张拥军【2 _ 4 q7 l 等将南瓜粉依次采用热水抽提、有机溶剂分布萃取，再用乙醇 沉淀反复多次提取所要的多糖，然后采用d e a e 离子交换纤维素柱，以不同浓 度的n a h c 0 3 为洗脱液进行纯化分离，收集有效成分，再经s e p h a d e x g 2 0 0 柱层 析纯化得南瓜多糖。分子量为1 1 5 0 1 0 4 d a ，气相色谱法分析其单糖组成为葡萄 糖、半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖，1 h n m r 及1 3 c n m r 表明其分子为具有b1 3 糖苷键的杂多糖。 1 1 3 4 南瓜药理作用的研究 ( 1 ) 降血糖作用 江苏大学硕士学位论文 熊学敏【h3 9 1 等研究了南瓜多糖降糖有效部位的降糖作用。将多糖给予四氧嘧 啶糖尿病造模大鼠( 3 8 9 l ( g ) 连续2 l 天，测定其空腹血糖、尿素氮和变化情况。 结果该有效部位有明显降低四氧嘧啶糖尿病大鼠血糖作用。分析了南瓜降血糖的 机理： 南瓜中所含多种微量元素中最有代表的是钴，这是胰腺细胞所必需的微量 元素，可促进动物糖尿病大鼠胰岛素分泌正常，从而达到降糖作用。 南瓜多糖可能是以糖蛋白的形式存在，并含有丰富的多种氨基酸，可刺激 胰岛素分泌产生降糖效果。 南瓜多糖的降糖作用可能与其结构有关系。 熊学敏【4 0 】等对南瓜多糖的降糖作用还进行了临床试验。将南瓜多糖降糖有 效部位提取、分离纯化后，制备成颗粒剂给病人服用。按中药新药治疗糖尿病临 床研究指导原则进行评判，临床验证以南瓜多糖颗粒剂为治疗组：以消渴丸为对 照组进行比较；结果治疗组总有效率8 7 1 3 ，其中显效1 6 例、有效1 0 例、无 效4 例。对照组总有效率为7 0 0 0 ，两组比较治疗组优于对照组( p 0 0 1 ) 。表明： 南瓜多糖颗粒剂作为一种新的降糖药物临床观察有较好的疗效，预示该药将有较 好的开发前景。 孔庆胜【3 仉3 l j 等研究了南瓜多糖的降糖作用。用南瓜多糖对正常及糖尿病模 型小鼠灌胃2 0 0 m g k g 和5 0 0 m g k g 时，均有降支链氨基酸( b c a a ) 作用，正常小 鼠平均可下降1 0 o ，而四氧嘧啶糖尿病模型小鼠平均下降3 1 7 ，并且多糖对 糖尿病模型小鼠的降支链氨基酸作用强于正常小鼠，且高剂量组下降的幅度大于 低剂量组。而胰岛素能促进b c a a 进入肌肉组织代谢，且二者呈负相关。用多 糖灌胃后，b c a a 均出现了不同程度的下降，推测多糖促进了胰岛素的分泌，可 间接反映胰岛素分泌的多少。而通过研究南瓜多糖的单糖组成摩尔比，对南瓜多 糖进行分离、纯化，证明它只是由单一多糖组成，大多数杂多糖是由葡萄糖、甘 露醇、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等中的几种单糖组成，因此南瓜多糖可 作为一种高效低毒的降血糖药物。 张拥军【2 3 4 3 6 川】等对南瓜的降血糖作用进行了比较深入的研究，首先对南 瓜脂多糖的降糖作用进行了研究，脂多糖的药理生物试验表明：它对糖尿病具有 一定的疗效保健作用。为探寻南瓜中对正常及糖尿病模型小鼠血糖有影响的未知 有效成分，依次采用有机溶剂分步萃取、除蛋白、透析、乙醇沉淀及葡聚糖柱层 析等分离手段，以小白鼠血糖值作为筛选活性成分的指标，在分离的每一阶段对 分离所得各个组分进行活性定量评估，并追踪活性最强的部分，最后分离纯化出 降血糖活性最强的组分g 南瓜多糖。本试验结果证明南瓜多糖可以降低四氧嘧 啶型糖尿病小鼠的血糖，表明南瓜多糖能有效地控制糖尿病的症状，近期疗效很 好，而南瓜多糖可能是以糖蛋白的形式存在的。 江苏大学硕士学位论文 左耀明【4 2 】等研究了南瓜多糖的降血糖作用。用南瓜多糖喂饲四氧嘧啶糖尿 病模型的大鼠，每日两次，连续2 1 天，测其血糖值和尿素氮。结果表明南瓜多 糖有较好的降低四氧嘧啶糖尿病大鼠血糖的功效。并且得出了一系列结论： 南瓜多糖是一混合性的多糖，降糖的有效部位尚有待确定。从经过两次 水提取后剩下南瓜非多糖( 有可能未提尽) 有较好降糖效果分析，南瓜多糖的有 效降糖部位趋向于弱极性的大分子区域，而不是较强的小分子单糖、双糖部分。 分析表明，南瓜多糖中含有d 甘露糖、d 木糖、d 半乳糖，并富含蛋白 质、氨基酸和铜。经火棉胶透析后，蛋白质和铜含量略有上升，提示南瓜多糖是 以糖蛋白的形式存在，并且铜在这一大分子结构中处于稳定的螯合状态。 四氧嘧啶能够选择性作用于动物的胰腺1 3 细胞，造成1 3 细胞因不可逆变性 而坏死，从而产生实验性糖尿病。本研究结果证实，南瓜多糖可降低四氧嘧啶糖 尿病大鼠的空腹血糖值，且受试动物一般活动情况趋复正常，这表明南瓜多糖可 有效地控制糖尿病的症状，并可能因促进胰岛素的分泌，而达到降低血糖的作用。 现代研究表明，铜是机体内氧化还原过程中极为有效的催化剂。铜盐可 促进酶的利用，有利于降低血糖。因此南瓜多糖的降低血糖作用与其富含铜不无 关系。 经分析预测南瓜多糖有效的降糖部位可能在四、五碳糖之间。胃肠吸收 过程中，不排除有抑制糖苷酶的活性，减缓葡萄糖吸收的可能性。这与降糖药物 拜糖平( 假性四糖) 的降糖作类似。 彭红 4 3 - - 4 4 j 等对南瓜多糖的降糖作用进行了研究。共做了四个项目的试验： 南瓜多糖对正常动物的糖耐量试验、南瓜多糖与其它降糖药物的协同试验、南瓜 多糖对试验性糖尿病大鼠的降糖作用试验、南瓜多糖对正常动物的血糖影响试 验。表明：南瓜多糖有较好的降糖作用，且与胰岛素有很好的协同作用。说明南 瓜多糖在糖尿病辅助治疗方面存在着非常重要的价值。 张之佳【4 5 j 等用一定剂量的超细南瓜粉喂养试验性糖尿病模型的家兔，用现 代医学检验手段对治疗前后糖尿病的5 个相关指标进行了观察，血糖尿糖都有显 著降低。初步探索了南瓜降血糖作用的机理，南瓜防治糖尿病是几种成分共同作 用的结果： 南瓜中含有环丙铵酸( c t y ) ，能促进胰脏分泌胰岛素，增强胰岛素受体 的敏感性，同时可激活葡萄糖酶，加快葡萄糖的转化，降低血糖浓度。 南瓜中富含果胶能减少胃肠道激素“胃抑多肽”的分泌，使餐后血糖及 血液胰岛素水平下降：同时果胶具有饱腹效果，能改善病人的饥饿感。 各种微量元素、维生素在控制血糖中也起重要作用，如铬作为葡萄糖耐 量因子( g t f ) 的活性中心，可刺激葡萄糖的摄入，协助维持糖耐量，缺铬可使体 内g t f 生成减少，胰岛素生物活性降低。南瓜中含铬5 p p m ，比一般食品( 约为 江苏大学硕士学位论文 0 1 p p m ) 高出5 0 倍。 研究还证实v e 和v c 的抑制密度脂蛋白发生氧化作用，对防治糖尿病 患者并发的动脉粥样硬化有一定作用。 句立言【4 6 】等采用静脉注射途径给予四氧嘧啶( 6 0 m g k g ) 的方法，研究南瓜 粉对血糖的影响。结果表明：南瓜对四氧嘧啶所致的高血糖小鼠具有显著的降血 糖作用。南瓜粉的降血糖作用可能在于能将p h 调节到弱碱性，提高胰岛素利用 率，有利于糖尿病的防治。此外，南瓜粉还可能具有调节内分泌系统的功能，使 胰岛素分泌正常抑制血糖上升。 j l a c o s t a p a t i n o ，e j i m e n e z b a l d e r a s l 4 7 j 等研究了南瓜对患有中度高血糖症的 i i 型糖尿病人的降血糖作用，给十个患有中度高血糖症的i i 型糖尿病人，按 4 m g k g 的剂量服用南瓜提取物。3 h 后病人血糖水平从1 2 0 7 1 6 9 m m 降到了9 4 2 1 9 6 m m 。5 h 后降到了8 3 7 1 7 4m m 。南瓜的降血糖作用与动物试验的结果 一致，本研究并未阐明南瓜的降糖机理。 ( 2 ) 降血脂作用 孔庆胜【3 0 j 等对南瓜中多糖的降血糖、降血脂作用进行了研究。取南瓜多糖 2 0 0 和5 0 0 m g k g 水溶液，经胃分别注入正常及糖尿病模型小鼠后，通过测定脂 蛋白的方法测定高密度脂蛋白( h d l ) 及低密度脂蛋白( l d l ) 中胆固醇的含量， 实际上代表h d l 及l d l 量，南瓜多糖( p p ) 能显著降低正常及糖尿病小鼠血 清总胆固醇( t g ) 、甘油三酯( t c h ) 及l d l ，升高h d l 及h d l t c h ( p 0 0 5 ) 。 众所周知，血清中t g 、t c h 、l d l 均是动脉粥样硬化形成的促进因子，并与 h d l t c h 比值呈负相比，特别l d l 升高是心肌梗死的危险因子，而h d l 则能将 外周血中的胆固醇带回肝脏代谢生成胆汁酸，因此h d l 升高是抗心肌梗死的安 全因子。南瓜多糖的这种降血脂作用，除了可预防及治疗糖尿病并发症外，也有 较好的抗动脉粥样硬化作用。分析了降血脂、血糖机理： a p o a i 具有带正、负电荷的氨基酸分布在螺旋结构的极性表面，呈两性 螺旋，其中带负电荷的氨基酸主要集中在螺旋表面中心一条狭窄的区带中，带正 电荷的氨基酸分布在表面两侧。南瓜多糖含大量糖醛酸，有较多的带负电荷的酸 性基因，与螺旋表面两侧的正电荷结合导致q 螺旋的增强，改变a p o a i 的构象， 使其有利于与脂类结合。 a p o a i 又能激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，促进h d l 成熟，使胆固醇酯 化运至肝脏，从而加速清除血中胆固醇而降低血脂。 在生理p h 下带负电荷的多糖，可能具有肝素样作用，可与l p l 结合， 并将其从动脉壁上释放到血液，促进对乳糜微粒、v l d l 的降解。 a h m e d ，m s l a k h a n i l 4 s l 等对南瓜汁提取物对链尿佐菌素诱发的i 型糖尿病小 鼠的高血糖、高血脂的影响进行了研究。结果显示，i 型糖尿病小鼠血浆胆固醇、 江苏大学硕士学位论文 甘油三脂、磷脂显著升高；h d l 降低，血浆l p o 和m d a 适度高，肾l p o 增高 两倍。1 0 周后，小鼠的各方面水平接近正常。另外，体外试验表明，南瓜汁对 膜l p o 也有抑制作用。得出结论，南瓜汁提取物对链尿佐菌素诱发的糖尿病小 鼠有降血脂、血糖的功能。 ( 3 ) 抗癌作用 徐国华1 4 9 】等为寻求和开发新的植物抗肿瘤药，探讨了从南瓜中提取的多糖 对动物肿瘤的抑制作用以及免疫活性。以小鼠s 1 8 0 ，艾式腹水癌( e a c ) 为动 物模型，通过灌胃给予南瓜多糖。结果：南瓜多糖对s 1 8 0 ，艾式腹水癌的抑瘤 率分别为3 7 3 和3 3 3 ，对胸腺增重率为8 3 。小鼠白细胞及淋巴细胞数升高， 对红细胞、血小板计数及血浆白蛋白水平无显著影响。血浆s o d 活性升高，丙 二醛( m d a ) 含量有不同程度的降低。红细胞免疫吸附肿瘤细胞功能增强。因此南 瓜具有一定的抗癌及升高血浆白细胞、淋巴细胞的作用，增强红细胞免疫吸附功 能。 1 1 4南瓜的研究开发前景i s o l 我国药学专家廖清江教授在对2 1 世纪有突破性意义的新药研制选题中提出 几条建议，其中一条是：预计到本世纪末我国将进入老年型国家的行列，所以研 究开发老年人常见病多发病用药，其社会效益与经济效益必将十分显著，诸如心 脑血管病、糖尿病骨质疏松等。因此，研制开发以南瓜为主原料的高技术含量的 制品将是一大热门课题。从目前的研究和将来的发展趋势看，以下几个领域存在 着较大的潜力。 ( 1 ) 南瓜中有效活性物质的研究和提取 南瓜对糖尿病和心血管疾病有很好的预防和食疗作用，因而，对南瓜中活性 物质的研究和提取，特别是对预防糖尿病的活性成分研究已成了许多实验室的热 门课题。 ( 2 ) 南瓜保健食品的开发 目前，虽然市场上也有南瓜制品，但品种单调，口味难以接近消费者，因 此在改善风味和营养配方以及加工工艺、降低成本等方面，仍有很有的潜力。 研制开发以南瓜为主原料的系列产品，不断推出新产品，既能适合市场需要， 又能提高附加值，从而增加收益。 江苏大学硕士学位论文 1 2 植物糖蛋白的研究概况 1 2 1 糖蛋白的组成与结构 5 1 - - 5 3 i 一切糖蛋白的基本组成都可分为糖链和肽链两大部分，分子量有几万到十 几万。主要有九种单糖作为植物糖蛋白糖链的组成成分，如：d 半乳糖( d g a l ) 、 d 甘露糖( d m a n ) 、d 葡萄糖( d g i c ) 、l 岩澡糖( l f u e ) 、d 木糖( d x y l ) 、 l 阿拉伯糖( l a r a ) 、d 一乙酰葡萄糖胺( d g i c n a c ) 等，分子中含糖百分率一 般在5 0 以下。而植物糖蛋白多肽链中几乎含有所有的氨基酸。 1 2 1 1 糖蛋白多肽链的结构 植物糖蛋白中含有几乎所有的氨基酸，所以糖蛋白的多肽链除了与糖链连 接处是几种固定的氨基酸外，其余部分结构与普通植物蛋白多肽链的结构相差 不大。 1 2 1 2 糖肽键 糖肽键是糖链和肽链的连接键，是指糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基 酸残基上的酰胺基或羟基脱水形成的糖苷键。可分为n 糖苷键和o 糖苷键两 类，前者对碱稳定，后者易被碱降解。 ( 1 ) n 糖苷键 n 糖苷键主要是1 3 - n 乙酰葡萄糖胺天冬酰胺这种连接方式。如图1 1 。 h o n h 、万一c h z 一差l 一c 。h 图1 - ln - 糖苷键 n 糖苷键不仅与氨基酸的种类有关，而且与氨基酸的顺序有关。带糖链的天 冬酰胺残基附近往往含有一个苏氨酸或丝氨酸残基，即它具有顺序子结构，称为 天冬酰胺顺序子：天冬酰胺x 苏氨酸( a s n x t h r ) 或天冬酰胺x 一丝氨酸 ( a s n - x - s e r ) ，其中x 可代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸残基。 ( 2 ) o 糖苷键 在植物糖蛋白中，o - 糖苷键主要有木糖丝氨酸、阿拉伯糖羟脯氨酸等几种 类型。图1 2 为阿拉伯糖羟脯氨酸连接方式。 江苏大学硕士学位论文 h h o c 0 0 h 植物糖蛋白的糖链可以是直链或支链，糖基数一般为1 1 5 个左右。糖链的 共同特点是不均一性，如分子量大小相差悬殊，组成、顺序和连接方式等的差异。 n 连接的糖链通常包含一个五糖核- i i , 结构，称为三甘露糖核心结构。如图 们1 、。3 m a n1 3 - 4 g i c n a c 1 31 - 4 g i c n a cb1 a s n 万6 p m a nq1 图1 3 n 糖链中的五糖核心区 ( 2 ) o 连接的糖链 一卜6 p g a l p l 】5 毒6 p - g a l p l 6 p - g a l p l 斗6 p - g a l p ( 1 - 0 ) s e r 亍 1 0 【a r a f ( 1 3 g a l p ) 2 ( 1 3 - g a l p ) 2 t 3 j | 1 1 ( 1 3 a r a f ) 2 ( 1 3 - a r a f ) 3 1 1 0 【a r a f a - a r a f 图卜4 枸杞子糖蛋白中的一条o 糖链。 p 表示n 比喃环型f 表示呋喃环型 o 一连接的糖链存在多种形式，如d 半乳糖丝氨酸( d g a l s e r ) 、d 甘露糖 1、_i_l1，个11 江苏大学硕士学位论文 丝氨酸( d m a n s e r ) 等，不存在共有的核心结构。图1 - 4 为植物枸杞子糖蛋白 中的一条o 糖链。 1 2 2 植物糖蛋白的药理作用研究 ( 1 ) 增强免疫调节功能 t s u r u t a 和m a t s u d a ”5 5 1 等研究了鸡蛋白蛋白酶解后产物糖蛋白的免疫活性。 他们将鸡蛋经胃蛋白酶水解后通过柱层析和免疫亲和层析分离出两个部分，在含 有碳链的部分检测到一些有免疫活性的片断，经鉴定为糖蛋白； t a k u r o t 5 6 j 等报到大豆经酸处理、乙醇沉淀、柱层析，得到一糖肽，可以协同 p h a 和c o a 作用，具有免疫调节功能： 戴玲【57 j 等对白头翁糖蛋白对巨噬细胞免疫功能的调节作用进行了研究。在 体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入不同浓度白头翁糖蛋白后，观察其对巨噬细 胞吞噬功能、一氧化氮合成和白介素1 分泌的影响。结果：白头翁糖蛋白能在体 外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，并可诱生巨噬细胞产生一氧化 氮，对巨噬细胞分泌白介素1 亦有一定的提高作用。结论：白头翁糖蛋白对小鼠 腹腔巨噬细胞有免疫增强作用。 单保恩【5 8 j 等发现了中药白附子糖蛋白对小鼠脾细胞和人淋巴细胞的增殖活 性有很强的促进作用，并有较好的量效关系。 阚建全【5 9 j 等初步研究了经d e a e 5 2 和s e p h a d e x g 1 0 0 柱层析纯化的北京2 号甘薯糖蛋白的免疫调节作用。结果表明甘薯糖蛋白浓度达5 0ug m l 时可促进 p h a 人外周血淋巴细胞转化，1 0 0l ag m l 或者1 5 0ug m l 时间可显著提高ph a 刺激的人外周血淋巴细胞转化，刺激指数分别达到6 5 和4 5 ( p 0 0 5 ) 。腹 腔注射甘薯糖蛋白8 0 m g k g d 可促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，吞噬指数和 吞噬百分数均高于共它组( p 0 0 5 ) ；另外，小鼠脾指数、胸腺指数的测定也 得到同样的结果；小鼠脾脏、胸腺光镜和电镜下观察发现，随着甘薯糖蛋白剂量 增加，脾淋巴小结增多扩大，胸腺t 细胞线粒体增多。这些结果表明甘薯糖蛋白 有明显的增强免疫调节的功能。 田庚元 6 0 - 4 2 1 等从宁夏枸杞子提取到枸杞子糖蛋白，发现其在体外能促进t 、 b 淋巴细胞增殖。 云芝糖蛋白作为免疫增强剂在国内外已应用于临床【7 9 】。 ( 2 ) 抑制肿瘤作用 日本的t s a s a b i 等对虾夷扇贝糖蛋白部分的抗肿瘤活性和免疫调节作用的 研究表明，它具有较高的抗肿瘤活性： 林玉满【6 3 j 等探讨了长裙竹菌丝体糖蛋白d i g p 2 的组成和抑瘤作用。长裙竹 菌丝体糖蛋白d i g p - 2 用氨基酸测定仪测定含有1 6 种氨基酸。气相色谱分析 江苏大学硕士学位论文 d i g p 2 的单糖组成为葡萄糖、甘露糖和半乳糖，其摩而比为2 1 3 ：1 0 0 ：0 7 8 。将 d i g p 2 注射于s 1 8 0 肉瘤的小鼠腹腔，剂量为2 m g k g ，连续给药7 天后称瘤重， 抑瘤率为3 6 8 2 对小鼠肉瘤s 1 8 0 有一定的抑制作用，抑瘤率为3 6 8 2 。 陈粤畔蛳】等将二色桌片参( m e n s a m a r i ai n t e r c e d e n s ( l a m p e r t ) 】的体壁经水煮 提、分离、最后经s e p h a d e xg 2 0 0 柱层析纯化得二色桌片参糖蛋白( g p m i ) 。 g p m i 经酶解后得二色桌片参糖蛋i 刍( g p mi i o 分别研究g p m i 和g p mi i 的 性状、化学组成和抗肿瘤活性。结果表明：g p m i 和g p m i i 都是糖蛋白，但蛋 白组成和糖含量明显不同。g p m