（动物学专业论文）贻贝棘尾虫皮层微管骨架的超微结构及微管蛋白的免疫电镜定位.pdf

贻贝棘尾虫皮层微管骨架的超微结构及微管蛋白的免疫电镜 定位 专业：动物学 导师：倪兵顾福康 摘要 研究方向：细胞与分子生物学 研究生：汤蕾 本文以腹毛目纤毛虫贻贝棘尾虫( s t y l o n y c h i am y 矗l u s ) 为材料，应用扫描电镜 术、透射电镜术及免疫电镜术等从细胞皮层超微结构和蛋白质组成、细胞骨架体 系等不同水平探讨了贻贝棘尾虫细胞结构的分化特征，所得结果按三部分论述如 下： l 形态发生中皮层纤毛器的扫描电镜观察 贻贝棘尾虫皮层纤毛器由i ：1 围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、背纤 毛等组成。应用扫描电镜术观察到，贻贝棘尾虫无性分裂过程中，处于形态发生 区的表膜产生孔洞，于小孔内伸出纤毛芽，组成新纤毛器的原基区；老口围带后 1 3 部分发生更新，前2 3 部分的小膜无明显变化，此后两者共同形成前仔虫的口 围带；左、右缘棘毛原基分别在老缘棘毛前端和中部的棘毛瓦解位置产生，此后 新的左、右缘棘毛列分别在老缘棘毛的右侧形成。结果表明，贻贝棘尾虫形态发 生中，纤毛器基体是在表膜下发生的，前仔虫口围带结构建成与部分老口围带的 更新有关，并且处于形态发生区的老纤毛结构对新结构的形成不但具有物质贡 献，并可能具有定位或定向作用。本研究从亚显微水平上较完整地显示了贻贝棘 尾虫纤毛器骨架形态发生的细节，为深入了解贻贝棘尾虫细胞发育提供新的资 料，对进一步揭示微管类胞器的结构和功能是有意义的。 2 无性生殖周期中皮层微管骨架的透射电镜观察 原生动物贻贝棘尾虫微管类细胞骨架除了由口围带、波动膜、额腹横棘毛、 左右缘棘毛、背纤毛等构成的纤毛器微管骨架外，还包括纤毛器基部附属微管和 其他皮层微管骨架。应用透射电镜术显示，贻贝棘尾虫纤毛区皮层中，除表膜、 纤毛基体( 含基体微管) 、基体附属结构( 基体间连接以及基体发出的纤毛后微 管、横微管) 等结构特征外，还包括毛基体水平的口围带小膜骨架、毛基体下水 平的小膜托架及托架后附属纤维，额腹横棘毛骨架及其附属纤维，以及这些纤毛 器骨架中毛基体问的连接结构，非纤毛区皮层骨架包括表膜下微管层、皮层左、 右侧微管带和尾部微管网等。 形态发生过程中，各类纤毛器的基本组成成分毛基体及其联系的纤维结构亦 发生规律性的装配和定位过程。上述结果为构建棘尾虫皮层细胞骨架的三维图 形，提供了较接近纤毛器整体水平的详细资料，为探索无性分裂过程中各类纤毛 原基发生的顺序性及相互关系等有一定的意义。 3d 微管蛋白的免疫电镜定位 本部分研究综合了国内外应用胶体金标记抗体技术显示细胞骨架及胞内组 分的实验方法，结合单细胞原生动物的一些特征，对试剂的配方及操作流程作了 部分改良及调整，增加了皂苷孵育、多聚甲醛和戊二醛双重固定等步骤，改进了 包埋后染色的步骤。所得结果显示，贻贝棘尾虫口围带小膜基体及基体下的附属 纤维、相邻基体间的连接纤维等，棘毛区的基体及纤毛杆等结构均有胶体金颗粒 分布，表明这些结构都是一类以微管蛋白为基本成分的微管胞器。胶体金标记抗 体技术显示原生动物皮层微管骨架方法的建立是对蛋白银方法、免疫荧光技术的 补充和完善。 综上所述，本研究应用扫描电镜术显示的纤毛器水平上皮层细胞骨架的形态 发生过程、应用透射电镜术从毛基体水平、毛基体下水平显示的贻贝棘尾虫无性 生殖周期中皮层细胞骨架的超微结构，与应用免疫电镜技术揭示的贻贝棘尾虫皮 层细胞骨架结果基本一致。所有这三部分结果为贻贝棘尾虫形态发生学及分子水 平上微管蛋白成分研究提供了基础的资料。 关键词：贻贝棘尾虫皮层纤毛器微管蛋白扫描电镜术透射电镜术免疫电镜 术 t h eu l t r a s t r u c t u r eo ft h ec o n i c a lm i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o no ft h e s t y l o n y c h i am y t i l u sa n d t h el o c a l i z a t i o nb yi m m u n o - e l e e t r o n m i c r o s c o p y m a j o ez o o l o g y s u p e r v i s o r ：n ib i n g g uf ub n g s p e c i a l i t y ：c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y g r a d u a t e ：t a n gl e i a b s t r a c t t h eu l t r a s t r u c t u r e ，p r o t e i nc o m p o s i t i o na n dc y t o s k e l e t o no fs t y l o n y c h i am y t i l u s i nh y p o t d c hc i l i a t ew c r ed e t e m i n e db yu o fs a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，t r a n s m i s s i o n e l e c 响n m i c r o s c o p y f r e m ) a s w e l la s i m m u n o - e l e c t t o n m i c r o s c o p y t h er e s u l t i s a s f o l l o w s ： 1as e mo b s e r v a t i o no nm o r p h o g e n e s i so ft h ec o r t i c a lc f l i a t u r e s t h ec o r t i c a lc i l i a t u r e so ft h es t y l o n y c h i am y t i l u sc o n s i s t e do fa d o r a lz o n eo f m e m b r a n e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a t i n gm e m b r a n e s ( u m ) ，f r o n t a l v e n t r a l - t r a n s v e r s e c i r r i ( f v t c ) ，l e f ta n df i g h t m a r g i n a lc i r r i ( i r m q ，d o r s a lk i n e t i c s ( d k ) a n ds oo n d u r i n gt h ea s e x u a ld i v i s i o no fs t f l o n y c h am y t i l u s ，h o l e sw e r eo b s e r v e d0 1 1t h e s u r f a c eo fc e l lp e l l i c l ei nt h ea n l a g e nr e g i o nb yu s i n gs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e n c i l i ab u d se x t e n df r o me a c hh o l ea n df o r mt h ea n l a g e nr e g i 彻o fn e wc i l i a t u r e s ； 1 3p a r to ft h eo l da d o r a lz o n eo fm e m b r a n e l l e s 脚w a sr e n e w e d ，t o g e t h e rw i t h t h el e f t e v e rc o n s t i t u t ea l li n t a c ta z ma tt h eo r i g i n a la r e aw h i c hb e l o n g e dt ot h ep r o t e r ； t h en e wm a r g i n a lc i r r ip r i m o r d i u mp r e s e n t si nt h ef r o n ta n dt h em i d d l ep a r to ft h e d e g e n e r a t e ds i t eo ft h eo l dm a r g i n a lc i r r i ，a f t e rt h a t ，t h en e wm a r g i n a lc i r r if o r m e da t t h er i g h ta r e ab u tn o tt h eo r i g i n a l l ya r e ao ft h e o l do n e s t h e s er e s u l t ss h o wt h a td u r i n gt h ep r o c e s so fm o r p h o g e n e s i s ，t h eb a s a lb o d i e s f o r mb e l o wt h es u r f a c eo fc e l lp e l l i c l e ；t h ec o n s t i t u t i o no f a z mi nt h ep r o t e ri sr e l a t e d t ot h er e n e w a lo ft h eo l da z m t h eo l dc i l i a sw h i c hb e l o n gt ot h ea n l a g e nr e g i o n p l a y e da l li m p o r t a n tp a r ti nt h el o c a t i o na n do r i e n t a t i o no ft h en e ws t r u c t u r e ，w h a t s m o r e ，s u p p l i e di t sd e v e l o p m e n tw i t hs o m es u b s t a n c e s t h i sp a p e rd e s c r i b e dt h e d e t a i l si n t e g r a t l yo nm o r p h o g e n e s i so fs t y l o n y c h i am y t i l u sa n dt h er e s u l t sc o u l d p r o v i d es o m en e w r e f e r e n c e sf o rab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h es t r u c t u r ea sw e l la st h e t i o n so fm i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n si nc i l i a t e s 2at e mo b s e r v a t i o no nu l t r a s t r u c t u r eo ft h ec o r t i c a lm i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o nd u r i n g a s e x u a ld i v i s i o n s t h em i c r o t u b u l 缸c y t o s k e l e t o no ft h es t y l o n y c h i am y t i l u sc o n s i s t so fd l i a t u r e s a n di t sb a s e - a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e sa n do t h e rm i e r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n si nt h e c o r t e x t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yr e v e a l s ：t h e r ea r ep e l l i c l e s ，t h ec i l i a t e d b a s a lb o d i e sa n dt h e i ra s s o c i a t e ds t r u c t u r e sa m o n gt h e m ( f i l a m e n tl i n k sa m o n gb a s a l b o d i e s ，t h ep o s t e r i o rl o n g i t u d i n a la n dt r a v e r s em i c r o t u b u l e s ) a tt h ec i l i a t e dr e g i o n s m e a n w h i l e t h em e m b r a n e l l e - s k e l e t o no fa z mf o r m e db yt h ec o n n e c t i o no fh i g h e l e c t r o n - d e n s eb a n d sw i t h c y l i n d r i c a lf i b r o u sm a t t e r s ；t h e f r o n t a l v e n t r a lc i r r i s k e l e t o n sf o r m e db yb a s a lb o d yb r a c k e t sa n dm tr i b b o n su n d e rb a s a lb o d i e s t h e r e a r ea l s ol o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l el a y e r s ，t h el e f t - a n dr i g h t m i c r o t u b u l a rr i b b o n s ，t h e c a u d a lm i e r o m b u l 盯n e ta tt h en o n - c i l i a t e dr e g i o n si nt h ec o r t e x d u r i n gt h em o r p h o g e n e s i s t h ee s s e n t i a lc o m p o s i t i o n so ft h ea ut h ee i l i a t u r e sa r e b a s a lb o d i e s ，m o r e v e r e ，t h ef o r m a t i o na n do r i e n t a t i o no ft h e s eb a s a lb o d i e si nt h e c o r t e xa l ea l s or e v e a l e d 3t h el o c a l i z a t i o no fq - t u b u l i ni ns t y l o n y e h i ar a y t i l u sb yi m m u n o e l e c t r o n m i c r o s c o p y t 嘶ss t u d yd e s c r i b e dam o r ee f f e c t i v ei m p r o v e dm e t h o df o rv i s u a l i z i n gt h e c y t o s k e l e t o na n ds p e c i a lc o m p o m e n ti nt h ec e l lb a s e do nt h ei m m u n ec o l l o i d a lg o l d t e c h n i q u e sh o m ea n da b r o a d s o m em a i ni m p r o v e ds t e p sa r ei n c u b a t i n gc e l l sw i t h s a p o n i n , 丘x i n g c e l l sw i t h p o l y f o r m a l d e h y d ea n dg l u t a r a l d e h y d e ，a s w e l la s p o s t e m b e d i n gm e t h o d t h eg o l dl a b e l i n ga l s oa p p e a r si nt h em e m b r a n e l l eb a s a l b o d i e sa n da s s o c i a t e df i l a m e n ta m o n gt h e mo fa z m ，f i l a m e n tl i n k sb e t w e e nt h eb a s a lb o d i e s , c i l l a sa n d o n t h er e s u l ts h o wt h a tt h e s es t r u c t u r e sa r cm i c r o t u b u l eo r g a n e u e sc o m p o s e do f t u b u l i n s t h i se s t a b l i s h e dt e c h n i q u ei sar e c r u i ta n di m p r o v e m e n tt ot h ei m m u n o f l u o r e s c e n e ea n d o t h e rm e t h o d s i naw o r d ，t h e s er e s u l tv i s u a l i z i n gt h eu l t r a s t r u c t u r eo ft h es t y l o n y c h i am y t i l u s d u r i n ga s e x u a ld i v i s i o n sb ys e ma n dt e m a i ec o n s i s t e n tw i t ht h e r e s u l tb yi m m u n o e l e c t r o n m i c r o s c o p y a l lt h e s es t a t e m e n tp r o v i d es o m ed a t a sf o rab e t t e ru n d e r s t a n d i n gf o r m o r p h o g e n e s i s a n d p r o t e i nc o m p o s i t i o n o ft h es t y l o n y c h i am y t i l u s k e yw o r d s ：s t y l o n y c h i am y t i l u s ：c o r t i c a lc f l i a t u r e s , m i c r o m b u l m ；s e m ；t e m ；i m m u n o - e l e e t r o n m i c r o s c o p y 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：陋日期：盘盈：生 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名： 移专 日期：少7 鱼 导师签名： 日期： 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 第一章研究综述 摘要：纤毛虫是研究细胞骨架结构和功能、探讨真核细胞的分化特征以及生命活 动规律的好材料。纤毛虫的表层细胞特化为皮层，是所有细胞中结构最复杂的层 次之一，纤毛虫的皮层细胞骨架可分为两大部分：纤毛器部分和非纤毛器部分。 近年来纤毛虫皮层细胞骨架方面的研究进展主要集中在蛋白银染色方法、稳定保 存微管结构的透射电镜术、以纤毛基体作为主成分的骨架结构及皮层纤毛器形态 和形态发生的扫描电镜术等。自2 0 世纪9 0 年代起，应用微管蛋白的抗体标记方 法及免疫荧光技术、相关的生化与分子生物学方法、胶体金标记抗体技术结合透 射电镜术等显示纤毛虫的徽管类纤毛器及其微管蛋白组分，开始对微管胞器的形 态、功能及装配机理进行探讨并取得了重要进展。 关键词：纤毛虫，皮层、细胞骨架、微管蛋白、蛋白银方法、扫描电镜术、透射 电镜术、免疫电镜术 真核生物细胞骨架的研究是细胞生物学的一个重要发展领域，单细胞原生动 物是研究细胞骨架结构和功能、探讨真核细胞的分化特征以及生命活动规律的好 材料。纤毛虫作为原生动物中最高等的类群，具有多种复杂的皮层细胞骨架，其 中，纤毛虫细胞表面被覆大量的纤毛和毛基体，毛基体在作用上等同于中心体， 起微管组织中心的作用。据报道四膜虫组装1 7 种不同类型的微管胞器( g a e r t i g , 2 0 0 0 ) ，因此纤毛虫在研究细胞骨架特别是微管类细胞细胞骨架上有许多优越性， 已成为研究单细胞中微管类细胞骨架的组装与发生等过程的理想材料。 近几十年来，随着新的研究方法、新的研究技术的不断运用，纤毛虫细胞骨 架的研究层面不断深化，从最初的结构描述、皮层纤毛器的形态发生，到亚细胞 水平的各种细胞器功能变化，再到分子水平上对蛋白质组成、基因调控机制等的 研究均取得了重要的进展，本章就相关研究作一回顾和综述。 1 纤毛虫皮层细胞骨架 1 1 皮层 在全部真核细胞中，纤毛虫的细胞结构最为复杂，其表层细胞质特化为皮层， 是所有细胞中结构最复杂的层次之一。纤毛虫细胞的皮层是与多种结构成分联系 的一种镶嵌式构造，包括表膜、表膜下纤维系统和其他多种结构，例如纤毛( 或 鞭毛) 及其联系的纤维结构、表膜泡、各种脊结构，表膜下微管结构，还有皮层 线粒体和其他有关细胞器等。纤毛及其与纤毛相联系的多种结构成分组成了皮层 的重要结构成分。纤毛的排列、分布等各方面表现出来的有规则的相对恒定的模 2 0 年华东师范大学硬士学位论文 式与按种而异的皮层模式有相应的内在联系，纤毛及其联系的纤维结构位于皮层 表面或深处的特定位置，它们与其他结构组成一个统一体，表现为细胞的形态、 具有纤毛的区域差异和各种细胞器间的特定位置关系。 本研究所选用的贻贝棘尾虫属腹毛目纤毛虫，细胞体积较大，其身体有了腹、 背的分化，细胞表面纤毛形成由许多纤毛有组织地聚集在一起而行使更为有效的 运动和摄食等生理功能的纤毛器，纤毛器基部向细胞表膜下伸出的多种纤维结构 与细胞的其他表膜下系统和某些细胞器交织串连在一起。其皮层微管等细胞骨架 成分丰富，有利于进行细胞皮层分化和皮层细胞骨架组装的机理等问题的探究。 1 2 皮层细胞骨架 纤毛虫细胞皮层中含有非常丰富的细胞骨架成分，它们在结构上表现出来的 特殊性有利于更深入地探索皮层分化和皮层模式的控制机理。长期以来，人们利 用该种生物为材料探讨真核细胞的分化特性以及生命活动规律。当前，主要通过 研究营养细胞和分裂期细胞的皮层模式来确定种的特征，其中涉及纤毛、毛基体 及与之相连的纤维衍生物的分布情况等，这些结构都是由微管组成。与多细胞生 物相比，单细胞的纤毛虫具有更多类型的微管骨架结构，多存在于细胞质中，是纤 毛、鞭毛等运动性器官以及中心粒的组成部分。 纤毛虫的皮层细胞骨架可分为两大部分：纤毛器部分和非纤毛器部分。纤毛 器部分的细胞骨架主要结构为由微管组成的基体、基体托架和小根纤维。非纤毛 器部分是一封闭式的网状结构，是保持细胞表面形状及保证细胞正常运动不可缺 少的结构，其主要成分也是微管。纤毛器表面看来相互独立，在电镜下，它门是 由小根纤维构成，它可能不仅起连接支撑作用，构成它们的微管很可能有一种特 异性分子或信息的作用。基体托架在纤毛虫皮层中起着微管组织中心的作用。因 此，微管是组成真核生物细胞骨架的成分之一，微管类细胞骨架是细胞骨架的主 要类型之一，它是真核细胞所独有并普遍存在的结构。 2 纤毛虫皮层细胞骨架研究的主要方法 纤毛虫皮层细胞骨架与细胞形态的保持和纤毛运动有关，是细胞外层的最复 杂的功能结构之一。在皮层细胞骨架的研究中，光镜水平上的大部分工作，包括 系统分类研究仍主要依据应用蛋白银染色方法在显微水平上的观察。所得结果仅 限于局部皮层结构或同一水平的骨架结构上，对皮层整体结构和同一纤毛器骨架 在不同水平的形态，以及纤毛器中毛基体与其托架的联系等特征尚缺乏了解。近 几年来，不少新技术和新方法应用于原生动物细胞骨架的显示及其成分研究中， 并积累了一定的资料。包括应用免疫学技术和荧光标记方法显示游仆虫 ( e u p l o t e s ) 和其它纤毛虫微管骨架。所得结果适于对整体细胞骨架的观察，而 免疫胶体金技术则用于揭示细胞骨架的超微结构细节。其他多层次、多样化的研 2 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 究已从细胞局部结构和细胞整体水平深入了解纤毛虫细胞骨架的立体构型，对于 丰富、更新、补充纤毛虫细胞骨架结构和功能的理论有重要的科学意义。 2 1 纤毛虫皮层细胞骨架的研究，在2 0 世纪初主要是对形态发生的描述和实验 分析，2 0 世纪6 0 年代开始，许多研究者对纤毛虫的皮层形态发生决定及其在纤 毛虫生命活动中的重要性做了细胞生物学和细胞发育水平上的探讨。从2 0 世纪 7 0 年代末开始，这一方面的研究逐渐集中到一个主题上，即皮层中主要的、整 体性的结构系统一皮层细胞骨架( 8 e i s s o n 1 9 9 4 ) 在早期的皮层细胞骨架研究中，r o t h ( 1 9 5 7 ) 应用透射电镜术首先观察到盘 状游仆虫( e u p o t e sp a t e l l a ) 的表膜下微管结构；g r i m 应用透射电镜术和蛋 白银染色方法，显示了阔口游仆虫( e u p o t e se u r y s t o m u s ) 的表膜下微管和施 氏腹柱虫( g a s t r o s t y as t e i n i i ) 的棘毛基部骨架，并构建了其棘毛基部骨架 的三维图像( g r i m ，1 9 6 7 ；g r i m ，1 9 7 2 ) ；m a t s u s a k a 等以透射电镜术的结果为 基础，构建了苔藓织毛虫( h i s t r i c u u s m u s c o r u m ) 一根棘毛基部骨架为单元的 三维图形( m a t s u s a k a ，1 9 8 4 ) 。但是该方法存在一些不足：工作量大，需要采集 大量的标本，具备熟练的操作技巧等。针对以上的不足，庞延斌等( 1 9 8 3 ) 以 t u f f r a n 方法为基础，加以适当改进，形成了一套在腹毛类纤毛虫中适用面更广 的蛋白银染色方法，使实验过程更易于操作，结果更趋理想。史新柏( 1 9 8 5 ) 应 用蛋白银方法显示了贻贝棘尾虫( s t y l o n y c h i am y t i l u s ) 的皮层纤维系统，观察到其 中存在三种不同定位的棘毛基部纤维，即前纵纤维、后纵纤维和横纤维等纤维结 构。所述的这些在显微和亚显微水平的工作，为纤毛虫皮层细胞骨架的进一步研 究奠定了基础。 2 2 扫描电镜、透射电镜的应用为进一步揭示纤毛虫表面及细胞内的亚显微结 构提供了可能。g r i m 等成功地应用生化去膜技术和扫描电镜术相结合的方法显 示了游仆虫表膜下纤维层、口皮层纤维和纤毛器水平的纤维骨架等立体结构，将 纤毛虫皮层细胞骨架的形态观察从二维水平发展到三维水平( g r i m ，1 9 8 2 ) ； w i l l i a m s 等( 1 9 8 2 ；1 9 8 6 ) 应用改进的生化去膜技术提取四膜虫( f e t r a h y m e n a ) 口区纤维骨架，取得了较理想的结果；顾福康等( 1 9 9 1 ) 应用w i l l i a m s 改进的 生化去膜技术进一步获得了游仆虫腹面皮层口围带托架、波动膜托架以及额腹横 棘毛区表膜下和背面表膜下纤维层的结构；庞延斌等( 1 9 9 2 ) 应用同样方法获得 了镰游仆虫( e u p t o t e sh a r p a ) 和有肋檐纤虫( d s p i d i s c ac o s t a t a ) 的部分纤 毛器骨架和非纤毛器骨架的局部形态，并描绘了毛基体托架的模式图。 但是，所述的对纤毛虫皮层细胞骨架的研究仅局限于少数纤毛虫的皮层某一 部位或是某些纤毛器的局部骨架上，多年来尚无新的进展。为从细胞局部结构和 细胞整体水平深入了解纤毛虫皮层细胞骨架的立体构型，顾福康等( 2 0 0 3 ) 继续 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 应用改进的生化去膜方法对镰游仆虫( e u p o t e s h a r p a ) 腹面皮层细胞骨架做了 深入的观察，详细描述了处于毛基体和毛基体下水平的口围带、口侧膜、额腹横 棘毛骨架，以及口围带小膜托架、口侧膜托架、额腹横棘毛托架的主要附属纤维 和非纤毛区表膜下皮层骨架的立体图形，对构建纤毛虫皮层细胞骨架的三维图 形，提供了较详细的和接近纤毛器整体水平的资料。所得结果表明，纤毛器托架 附属纤维可能与细胞内各种纤毛器问的联系以及包括纤毛器运动在内的整个细 胞运动的协调有关；朱慧等( 2 0 0 4 ) 进一步显示了小游仆虫( e u p o t e s g r a c j l i s ) 皮层细胞骨架中由非纤毛区皮层骨架、纤毛器骨架及其附属纤维等构成的三维结 构网架，其中各类细胞骨架以纤维为基本成分组成纤维网、纤维层，纤维束和纤 维薄片等不同形态单元。并据结果认为，游仆虫表面形成区域化结构，可能与细 胞表面各部分的联系及其细胞与环境的相互作用有关，纤毛器骨架中各个纤毛器 的毛基体复合结构可能对纤毛器托架和骨架附属纤维等起到微管组织中心的作 用。 2 3 近年来已开始应用直接免疫荧光标记方法和间接免疫荧光标记等方法显示 纤毛虫微管骨架。a r r e g u i 等( 1 9 9 4 ) 利用p 一微管蛋白抗体标记和鞣酸一透射 电镜术，在e u p l o t e sf o c a r d i i 中，显示左侧表膜下纤维被一个复杂的微管系统 增强和副小膜中存在一个发达的微管网络：此后，l u c i aa r r e g u i 等( 2 0 0 2 ) 将 已在哺乳动物微管骨架研究中成功应用的f l u t a x 一一紫杉醇的一种荧光衍生物 引入到纤毛虫骨架研究中来，直接观察到了七种纤毛虫的细胞骨架以及骨架的动 态变化，a r r e g u i 等( 2 0 0 2 ) 显示了几种纤毛虫的表膜下纤维系统，与以往的蛋 白银染色方法相比，该方法步骤简单，操作简便，并且效果良好；梁爱华等应用 y 微管蛋白抗体标记八肋游仆虫，结果现实荧光标记出现在纤毛、棘毛基部， 即基体的部位( 梁爱华，1 9 9 8 ) ；田沁等( 2 0 0 2 ) 利用q 一，b 一微管蛋白抗体标 记包囊游仆虫( e u p l o t e se n c y s t i c u s ) ，其中所有纤毛器包括纤毛杆及其基体都 显示荧光，其腹面可见强荧光标记的口围带基体和短纤毛杆，被标记的还有位于 腹面的口侧膜和额腹横棘毛和尾棘毛，以及侧面呈点状排列的背触毛基体。 l i a n g ( 1 9 9 3 ) t a n ( 1 9 9 8 ) 研究了八肋游仆虫大核和小核基因组的v 徼管蛋白基 因，谭明等( 2 0 0 0 ) 尝试了在大肠杆菌中表达游仆虫v 微管蛋白，并且表达出的 融合蛋白具免疫学活性，为大量获得v 微管蛋白，进一步研究其功能奠定了基础。 实验证明，利用f l u t a x 可以省去以往免疫荧光中的固定和试剂的渗透等步 骤，操作更加便捷。但是，该方法也存在不足：与以往的免疫荧光相比，荧光的 稳定性较差，标本无法长期保存。曾红等( 2 0 0 6 ) 采用f l u t a x 直接荧光标记和 抗8 微管蛋白抗体的间接免疫荧光标记显示，原生动物贻贝棘尾虫( s t y l o n y c h i a m y t i l u s ) 细胞微管胞器由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、背纤毛等 4 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 纤毛器微管骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层微管骨架组成。纤毛器微管骨 架和基部附属微管按皮层纤毛模式定位；皮层左、右侧微管带和领肋壁微管等其 他皮层微管构成细胞特定位置的皮层微管骨架，并可能为具有背腹分化的腹毛日 纤毛虫所特有，对维持细胞背腹面的形态、支持附近纤毛器( 如左、右缘棘毛) 的 运动起作用。上述结果较完整地阐述了其细胞骨架的三维构形，对于深入了解纤 毛虫细胞微管骨架的结构和分布特征，进一步揭示微管类胞器的功能是有意义 的。综上所述，应用免疫学技术和荧光标记方法显示的细胞皮层骨架结构，不仅 有利于细胞骨架结构的整体研究，还将纤毛虫皮层细胞骨架的研究聚焦到微管及 其微管组分的水平。 2 4 胶体金标记抗体技术显示腹毛日纤毛虫皮层微管骨架方法的建立 2 4 1 原理 胶体金( c o l l o i dg o l d ) 是一种带负电荷的水溶液，它可制成不同大小的单分散 粒子，胶体金粒子依靠非共价的静电吸附，能稳定又迅速地与大分子物质结合， 而大分子物质的生物活性没有明显改变。因此胶体金可以作为探针对细胞表面或 细胞内多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、抗原、激素( 借助抗体) 、核酸( 通过核 酸酶) 等生物大分子进行精确定位。其优点是能标记不同生物大分子，而保持活 性；金粒子电子密度高，在透射电镜下易识别；金粒子能发射强烈的二次电子， 可用于扫描电境观察；利用金粒发射的x 一射线谱可对大分子定量分析；根据需 要利用不同直径胶体金颗粒标记不同抗原，可进行免疫电镜的双标或多重标记。 2 4 2 胶体金标记抗体技术静发展 2 0 世纪，人们将电镜技术与免疫学方法相结合，逐步形成了免疫电镜检查术。 1 9 7 1 年，f a u l k 和t a y l o r 首次用胶体金标记抗体，取得满意结果；1 9 7 5 年， h o r i s b e r g e r 等把这种技术推广应用于扫描电镜术，胶体金标记抗体技术的引入 无疑是免疫电镜发展过程中的又一个里程碑。免疫胶体金技术( i c g ) 是以胶体 金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定 位、定性乃至定量研究的标记技术。 近十年来，免疫金标记技术逐渐得到普遍应用，与免疫荧光技术、电镜酶细 胞化学技术等标记技术一样，应用免疫胶体金技术时，既要保存胞内成分的抗原 性，也要保存细胞的微细结构。因而，细胞的处理与标记必须遵守行之有效的操 作程序。苜先周定液胄勺选择以多聚甲醛和戊二醛混合液较多；免疫电镜染色方法 有包埋前染色、包埋后染色和冷冻超薄切片法；t o k u y a s u 建立了冰冻超薄切片法， 以液氮速冻、冷冻切片；避免了样品的染色、固定、脱水等损伤细胞结构的处理 过程。上述样品制备技术在原生动物研究中已有初步应用。 由于胶体金颗粒具有强激发电子能力，可作扫描电镜观察和x 一射线衍射分 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 析。近年来的x 一射线断层扫描术( t o m o g r a p h y ) ，通过胶体金颗粒在一系列连续 的超薄切片中的分布，构建细胞三维方向上的图像。结合样品制备的快速冷冻术 对原生动物基体及相关胞器复杂结构的研究是对传统的电子显微镜方法的补充 和拓展。目前，应用胶体金技术研究单细胞原生动物微管类细胞骨架超微结构及 其成分已取得了一定的进展。 2 4 3 国外应用免疫胶体金技术研究原生动物微管类细胞骨架的进展 对衣滴虫( c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ) 的中心粒进行x 一射线断层扫描分析 结合免疫胶体金技术，发现v 一微管蛋白定位于基体的近端( s i l f l o we ta 1 1 9 9 9 ) ， 所以包含有v 一微管蛋白和其他蛋白复合体组成的帽状结构是微管负末端所具 有豹保守特征。y 一微管蛋自在衣藻中被发现以后，相继在许多生物体中都有发 现，包括纤毛虫( c i l i a t e s ) ，锥虫( t r y p a n o s o m a ) 等。利用免疫细胞化学实验 观察到草履虫体皮层和口区的基体被抗e 一微管蛋白的抗体标记，在超微结构水 平上，对包埋后分离的皮层结构进行免疫金染色，通过计算胶体金颗粒，发现e 一微管蛋白主要位于基体的两端区域。在衣藻中，e 一微管蛋自主要定位于基体周 围而非基体本身。草履虫中一微管蛋白基因沉默导致基体数目的减少和基体中 三联体微管的解聚。p a u lc h a n g 等进一步以抗一微管蛋白抗体为一抗，兔抗 一1 5 n m 胶体金为二抗。免疫电镜术显示大约8 2 的金颡粒标记物结合于中心粒 的末端附属物结合区域，从而表明8 一微管蛋白主要集中在中心粒末端。上述研 究证实了微管蛋白与y 和6 一微管蛋白一样，都位于细胞的中心体，对中心 体的复制和微管组装极为重要。从而表明微管蛋白超家族成员对于维持微管细胞 骨架极为重要。至于一个完整细胞周期中，5 和6 一微管蛋自在中心粒复制过程 中的相互关系，以及一微管蛋自如何聚集到中心粒末端附属区还有待进一步研 究。以上研究已经开始将原生动物细胞骨架的研究聚焦到微管及其微管组分的水 平。 o i l e e nt 0 ，t o o l e 等利用x 一射线断层扫描技术在一种衣滴虫 ( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 鞭毛基体中发现了一些新的结构。在基体的近端， 有一个无定形的，高电子密度的环状结构，它负责三联体微管的发生。同时还具 有连接两个成熟基体的近端条纹状纤维，在对一系列连续的x 一射线断层薄切片 进行分析时，可以探测到原基的结构和位置以及小根微管束的位置，与小根微管 结合的条纹状纤维中亦保存有完整的秩序。在近端区域出现了由三联体微管构成 的原基，这些原基比成熟基体小的多。在对6 一微管蛋白缺失体进行x 射线断 层扫描时发现，鞭毛数目减少，基体远端三联体微管减少，远端连接两个基体的 纤维不能组装，胞质组织瓦解，分裂沟出现异常，同时小根微管束组织紊乱。从 而为基体结构和组装过程中特异的微管蛋白的作用研究提供了详细的资料。 2 4 3 本研究应用免疫胶体金技术的改良 6 2 0 0 7 年华东师范丈学颀士学位论文 本实验综合了国内外应用胶体金标记抗体技术显示细胞骨架及胞内组分的 实验方法，结合单细胞原生动物的一些特征，对试剂的配方及操作流程作了部分 改良，具体改良如下： 在实验过程中，增加了用0 5 的皂苷低渗细胞数秒的步骤，此后再固定， 这样可以大大减少棘尾虫细胞的破裂，使观察到的微管超微结构更清晰；本实验 采用等体积的2 多聚甲醛：0 5 戊二醛混合液固定细胞，既避免了锇酸的强氧 化性破坏组织的抗原活性，又保证了细胞内的微管结构有较好的固定效果。之后， 用1 0 h 2 0 。腐蚀金网的时间也由哺乳动物中的l o 一1 5 m i n 改进至l j 8 m i n ；在包埋后染 色过程中，以往的方法是在蜡板上事先滴好实验试剂，再将捞好切片的金网漂浮 其中。该方法需要用镊子在试剂之间不断移动载网且试剂较难吸干净。本实验改 进了操作步骤：将金网垂直固定在染色板的凹槽中，按序加入试剂，并且用滤纸 从金网一侧吸净液体。该方法既避免了不断移动金网对切片造成影响，又保证了 没一步操作都将抗体等试剂吸干；与常规染色相比，铜网染色的时间不宜过长， 一般是以醋酸铀染5 m i n ，双蒸馏水冲洗数次后，再以柠檬酸铅染3 5m i n ，以免 电镜下造成柠檬酸铅颗粒与金颗粒相混淆的假相；染色后经蒸馏水反复冲洗的金 网，应放置烘箱里一段时间，以避免金网上的水气在电镜下造成切片的漂移。 所得结果是对蛋白银染色技术、免疫荧光技术的很好的补充和完善，也为进 一步研究细胞微管骨架提供了新的研究手段。 2 4 4 胶体金技术的应用展望 在原生动物，特别是纤毛虫细胞周期中，皮层结构都要按照原有的模式经历 一个复制的过程，其中一个重要特征就是大量的基体要进行复制和组装。但是由 于基体装配过程极其复杂，并且对于基体进行提取和生化分析非常困难，目前对 调控基体装配的分子机制还知之甚少。利用x 一射线断层扫描术( t o m o g r a p h y ) 研究基体及相关胞器复杂结构，使人们对基体组装的分子机制有了一定的了解。 胶体金是高电子密度颗粒性标记物，电镜下分辨率高，对超微结构遮盖少，并易 与其他颗粒性结构相区别，具有较精确的定位能力。因此用胶体金对超微结构免 疫标记时，反应位点可与观察的形态结构相联系，与免疫荧光标记技术相比，前 者增强了抗原一抗体反应的敏感性。此外，胶体金作为标记物与目前常用的放射 免疫标记和酶免疫标记等相比，具有操作简单，无毒，无致癌性物质，无需昂贵 仪器，无需防护设备等特点，还可以对同一样品进行肉眼，光镜和电镜的比较研 究。目前，利用胶体金标记抗体显示细胞超微结构和胞内成分