（材料科学与工程专业论文）生物碳纤维的酶固定化研究.pdf

摘要 生物碳纤维的酶固定化研究 摘要 碳纤维具有优异的生物相容性、较高的比表面积、稳定的物理化 学性能以及应用形态的多样化。目前作为吸附材料已广泛应用于废水 处理，而作为生物酶载体材料应用的研究报道却并不多。 酶是一种高效专一的催化剂蛋白质。游离态酶一般溶于水、不稳 定，将酶固定在载体上，有利于底物分子的扩散，提高酶的热力学稳 定性，并方便分离和重复使用。目前酶载体材料在物化性能、力学性 能、耐温性、活性范围和再生等方面已不能满足使用要求，限制了生 化反应技术的推广与应用。本文试图探索一种以碳纤维作为新型酶固 定化载体，提高现有酶热力学稳定性，重复使用性，保持或提高载酶 活性、载酶量的新型酶固定化技术与方法。从而为生物化学反应领域 提供耐热、高效、快捷、稳定的新载体、新方法和新技术。 本文首先选取了脂肪酶和果胶酶作为探索实验，确定了以脂肪酶 作为固定化的研究对象，进而通过系列碳纤维为载体与传统载体壳聚 糖固定化实验进行对比。研究了以新型碳纤维为载体固定化脂肪酶的 效果，主要研究了优化固定化脂肪酶的条件和探索固定化前后的酶学 性质的变化。通过扫描电镜和x 射线光电子能谱研究并解析固定化 前后样品表面形态和结构变化，探讨酶活性变化、载酶量、以及热稳 定性的变化规律及制约因素。 北京化工大学硕十学位论文 研究结果表明：以碳纤维作为载体固定化脂肪酶或果胶酶时吸附 法为最佳固定化方法，所得到的固定化酶活性最高。残留活性表明， 固定化脂肪酶残留活性为1 2 7 ，而固定化果胶酶的残留活性为 0 9 0 ，说明脂肪酶在固定化时有效利用率比较高。采用不同固定化 方法、不同载体进行脂肪酶固定化对比研究表明：吸附法得到的固定 化酶的活力最高；t 3 0 0 级碳纤维为载体的载酶量与固定化酶活力的 相关研究，说明以t 3 0 0 级碳纤维作为载体能提高脂肪酶的利用率。 同时结果还表明固定化脂肪酶在5 0 时仍能保持良好的活性，尤其 以t 3 0 0 级碳纤维作为载体的固定化酶热失活缓慢。对s i g m a 脂肪酶 在t 3 0 0 级碳纤维上的固定进行的系统性研究与固定化反应条件优 化，所确定的固定化反应条件为：给酶量o 1 9 、固定化水浴温度2 5 。c 、 固定化时间2 h ；固定化s i g m a 脂肪酶相对于游离酶的反应p h 值向碱 性偏移；最佳反应温度提高到5 0 ，并在5 0 的酶催化反应环境中 1h 仍能保持很好的活性和较好的热稳定性。 通过系统研究得出创新性结果：以碳纤维作为生物酶固定化载体 是可行的。碳纤维是一种新型优质生物酶固定化载体。该结果经检索 未发现国内外有报道，具有原创性，获得发明专利受理。该结果有望 应用于生物化学反应与反应器，对于提高我国生化反应技术水平的起 到促进作用。 关键词：碳纤维，脂肪酶，载体，固定化，活性，热稳定性 i i 摘要 s t u d i e so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o no n b i o l o g i cc a r b o nf i b e r a b s t r a c t c a r b o nf i b e rh a sb e e ne x t e n s i v e l ya p p l i e di nt h es e w a g ed i s p o s a l f i e l da s a b s o r b i n g m a t e r i a l sf o ri t se x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y , h i 曲 s p e c i f i c s u r f a c ea r e a ，s t a b l ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n d d i v e r s i f i c a t i o no fa p p l i c a t i o ns i t u a t i o n ，b u ti t ss e l d o mr e p o r t e da st h e c a r r i e rm a t e r i a lo fb i o l o g i ce n z y m e e n z y m ei so n ek 1 1 do fh i g h l yu n d i v i d e dc a t a l y t i c a lp r o t e i n b e c a u s e o ft h ew a t e r - s o l u b l ea n du n s t a b l ep r o p e r t i e so ft h ef r e es t a t ee n z y m e ，i t u s u a l l yn e e d st ob ei m m o b i l i z e do nt h ec a r t i e rt oi m p r o v et h ed i f f u s i o no f t h ez y m o l y t em o l e c u l e ，e n h a n c et h et h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t yo fe n z y m e a n df a c i l i t a t et h es e p a r a t i o na n dr e u s a g eo ft h ee n z y m e a tp r e s e n t ，t h e d e v e l o p m e n t so ft h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp e r f o r m a n c e s ，m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s ，t e m p e r a t u r et o l e r a n c e ，a c t i v i t yr a n g ea n dr e c y c l i n go fe n z y m e c a r r i e rc a n n o ts a t i s f yt h ed e m a n d so fp r a c t i c a la p p l i c a t i o n s ，w h i c hl i m i t t h ep o p u l a r i z a t i o na n da p p l i c a t i o no fb i o r e a c t i o nt e c h n o l o g y i nt h i st h e s i s ， w et r yt oe x p l o r ean o v e le n z y m ei m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yw h i c hc a n e n h a n c et h et h e r m a l s t a b i l i t y , r e c y c l i n g ，a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e a n de n z y m ec o n t e n tw i t hak i n do fn e wc a r b o nf i b e ri m m o b i l i z a t i o n i i i 北京化工大学硕士学位论文 c a r r i e rt op r o v i d ean e wk i n do fh e a t r e s i s t a n t ，e f f i c i e n t ，e x p e d i t i o u sa n d s t a b l ec a r d e ra n dt e c h n i q u ef o rb i o c h e m i c a lr e a c t i o nf i e l d i nt h i st h e s i s ，l i p a s ew a sc h o s ea st h ei m m o b i l i z e do b j e c to ft h e i m m o b i l i z a t i o ns t u d ya f t e rp l e n t i f u l c o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t sb e t w e e n l i p a s ea n dp e c t a s e ，a n dt h e nt h ep e r f o r m a n c e so fas e r i e so fd i f f e r e n t c a r b o nf i b e r sc a r d e r sw e r ec o n t r a s t e dt ot h a to fc h i t o s a nw h i c hw a st h e t r a d i t i o n a lc a r d e r d u r i n g t h e e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n s t u d i e s t h e p e r f o r m a n c e so fi m m o b i l i z e dl i p a s ew i t ht h en o v e lc a r b o nf i b e rc a r r i e r , e s p e c i a l l y t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s o ft h e l i p a s e i m m o b i l i z a t i o n e x p e r i m e n ta n dc h a n g e so fl i p a s ep r o p e r t i e sa f t e ri m m o b i l i z a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d i nt h i sp a p e r s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) a n d x - r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) w e r eu s e d t or e s e a r c ha n d a n a l y z e t h es u r f a c e m o r p h o l o g i e s a n ds t r u c t u r a l c h a n g e s o ft h e i m m o b i l i z a t i o ns a m p l e s ，d i s c u s st h ev a r i a t i o n so fe n z y m ea c t i v i t i e s ， e n z y m ec o n t e n t ，t h ec h a n g el a wo ft h e r m a l s t a b i l i t ya n di t sr e s t r a i n i n g f a c t o r s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta d s o r p t i o nm e t h o di st h eb e s tw a yt o i m m o b i l i z et h el i p a s ea n dp e c t a s eo nt h ec a r b o nf i b e r sa n do b t a i nt h e h i g h e s ta c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e a tt h es a m et i m e ，t h er e s i d u a l a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ew a sh i g h e rt h a nt h a to fi m m o b i l i z e d p e c t a s e ，1 2 7 a n do 9 0 r e s p e c t i v e l y , w h i c hi n d i c a t e st h a tt h ee f f e c t i v e r a t eo fu t i l i z a t i o no fl i p a s ew a s h i g h e rt h a np e c t a s e f r o mt h ec o m p a r a t i v e 摘要 e x p e r i m e n t s o f l i p a s e i m m o b i l i z a t i o nw i t hd i f f e r e n tc a r r i e r sa n d i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s ，i tc a nb es e e nt h a tt h ea d s o r p t i o nm e t h o dc a n o b t a i nt h eh i g h e s ta c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s e t h ei n v e s t i g a t i o n so f t h ee n z y m ec o n t e n ta n di m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t i e so ft 3 0 0c a r b o n f i b e rc a r r i e ri n d i c a t e dt h a tt h et 3 0 0c a r b o nf i b e rc a r t i e rc a ne n h a n c et h e u t i l i z a t i o no ft h e l i p a s e m e a n w h i l e ，t h er e s u l ta l s os h o w e dt h a tt h e i m m o b i l i z e dl i p a s ec a nk e e ph i g ha c t i v i t yu n d e rt h et e m p e r a t u r eo f 5 0 。c ， e s p e c i a l l yt h o s ei m m o b i l i z e do nt h et 3 0 0c a r b o nf i b e rw h i c hd e v i t a l i z e d v e r ys l o w l y t h ei m m o b i l i z a t i o no f t h es i g m al i p a s eo nt h et 3 0 0c a r b o n f i b e rw a s i n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l y a n do b t a i n e dt h e o p t i m u m i m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s ：t h ea m o u n to fe n z y m ew a so 1g ；r e a c t i o n t e m p e r a t u r ew a s2 5 * ca n dr e a c t e df o r2h c o m p a r e dt of r e es t a t ee n z y m e ， t h er e a c t i o np hv a l u eo ft h ei m m o b i l i z a t i o ns i g m ae n z y m ed e v i a t e dt o a l k a l e s c e n c ee n v i r o n m e n t ，t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei n c r e a s e dt o 5 0 ca n du n d e rt h e5 0 cr e a c t i o ne n v i r o n m e n t ，t h ei m m o b i l i z e dl i p a s e c a ns t i l lk e e ph i g ha c t i v i t ya n ds t a b l et h e r m a l s t a b i l i t ya f t e r1hr e a c t i o n t h ec r e a t i v er e s u l t so ft h es y s t e m i ci n v e s t i g a t i o n sd e m o n s t r a t e dt h e f e a s i b i l i t yo ft h ec a r b o nf i b e ra st h ei m m o b i l i z a t i o nc a r r i e ro fb i o l o g i c e n z y m e c a r b o nf i b e r i san e wk i n do fq u a l i t y b i o l o g i ce n z y m e i m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r u pt on o w , t h e r e sn os i m i l a rr e s u l tr e p o r t e di nt h e w o r l d ，a n dt h i sp a p e ri sa no r i g i n a lw o r ka n dh a sa p p l i e dr e l a t i v ep a t e n t p r o t e c t i o n t h i sn o v e lt e c h n i q u ec a nn o to n l yb eh o p e f u l l yu s e dt o v 北京化工大学硕士学位论文 b i o c h e m i c a lr e a c t i o na n dr e a c t o r , b u ta l s op r o m o t et h ed e v e l o p m e n to f o u rn a t i o n a lb i o c h e m i c a lr e a c t i o nt e c h n o l o g y k e yw o r d s ：c a r b o nf i b e r , l i p a s e ，c a r r i e r , i m m o b i l i z a t i o n ，a c t i v i t ya n d t h e r m a l s t a b i l i t y v i 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：盎氢趋日期：丝塑乏：望 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 导师签名： 哆矽 _ _ _ 一 日期：趁里查：生 e l 期_ 圣丑! ：丛生 第一章绪论 第一章绪论 酶是一类重要的生物催化剂，是具有活性的蛋白质，它的特点在于可以专一 地高效地催化特定的化学反应，且反应条件温和、反应消耗低、产物易纯化、污 染小、酶活易控制、操作简单。因此，它与传统的化学催化剂相比具有较强的竞 争能力。近年来，工业用酶广泛应用于医药、化学、纺织、日化、农业、能源、 食品、环保及化妆品等行业，已成为一门独立的科学体系一酶工程科学。也成为 了当今社会优先发展的高科技领域之一 】。 由于酶对反应环境十分敏感，实际应用中在高热、强酸、强碱等极端环境很 不稳定，而且容易造成浪费，回收困难。为了使酶在工业领域能更好的应用，形 成了酶固定化技术。即把游离酶固定在各种类型的载体上，并且也能有效地进行 酶催化反应。酶固定化技术已经成为近年来生物领域热点研究之一【肛”】。 1 1 酶工程及其应用 酶工程是在进行物质转化时利用酶催化作用的科学，是将酶学理论与化工 技术结合而形成的新技术。它的发展经历了自然酶的开发利用一固定化酶和固定 化细胞一多酶反应器仿生技术等几个阶段。主要应用于轻工业、食品工业、环境 治理、医药工业以及分析诊断中。在轻工业方面，制造洗涤剂、皮革脱毛、脱胶 等。在食品工业方面，制造麦芽糖、葡萄糖、糖浆，改善面包质量，保存食品等。 在环境治理方面应用广泛，处理各种工业废水和有机磷农药。在分析检测方面， 用作一些产品的抑制剂、辅助检测。在医药工业方面，可以治疗先天性缺酶病或 是器官缺损引起的某些功能的衰竭。可以预计，在2 1 世纪来临之际，酶工程和 固定化技术作为生物技术的一个重要组成部分，将得到迅速的发展。酶工程技术 必将在各个方面发挥的作用越来越大【1 6 - 1 9 1 。 酶的化学本质是一类具有催化作用的蛋白质，其特点是高选择性、高催化 活性、反应条件温和、环保无污染等。但是游离状态的酶在高热、强酸、强碱、 高离子强度、有机溶剂等条件下稳定性较差，容易失活，并且反应后混入催化产 物等物质，纯化困难，不能重复使用，不能回收。为了克服这些工业化中的困难， 酶固定化技术于2 0 世纪6 0 年代应运而生并发展起来。固定化技术的出现是推动酶 工程产业化，目前固定化酶方面在理论研究和应用研究方面都取得了许多重要成 果【2 0 1 。 北京化工大学硕士学位论文 1 2 固定化酶 1 9 6 9 年，日本首先成功研制固定化酶技术。固定化酶，即指在一定空间内 呈闭锁状态存在的酶能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化 酶与游离酶相比，具有下列优点：其一是酶可反复使用；其二是稳定性高，容易 将产物和底物分开；其三是产物纯度高；其四是生产可连续化和自动化；其五是 设备小型化以及可节约能源；其六是较游离酶更适合于多酶反应等【2 1 1 。 同时，仍然存在这一些缺点：其一是固定化时酶活力有损失；其二是增加 了生产的成本，工厂初始投资较大；其三是只能用于可溶性底物，而且适于小分 子底物，对大分子底物不适合。 1 2 1 传统固定化方法 固定化酶的制备方法通常有物理法和化学法两大类。物理法包括吸附法和包 埋发。物理法固定化酶的优点在于酶在固定化时不参加化学反应，整体结构保持 不变，酶的催化活性得到很好保留。但是由于包埋物或载体具有一定的空间或者 立体阻碍作用，因此对一些催化反应不适用。化学法包括交联法和共价法。化学 法是将酶在化学反应下通过化学键连接到天然的或合成的载体上，使用交联剂、 偶联剂等通过载体表面和酶分子的基团交联起来，而形成不溶于反应环境的固定 化酶2 2 1 。 1 2 1 1 吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称 为吸附法。吸附法是世界上最早最简单的酶固定化方法，包括物理吸附和离子结 合法。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶等。吸附法 制备固定化酶，操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活。载体多是价廉易 得，而且可反复使用。但是酶与载体的结合不牢，由于离子键、氢键、偶极键及 疏水键固定的酶分子易受反应介质的p h 、离子强度等的影响而从载体上脱落， 所以它的使用受到一定的限制。 1 2 1 2 包埋法 包埋法是将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法。包埋法分为 网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和，同时可获得较高的酶活 力回收。包埋法载体主要有：明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺海藻酸钠、火棉 胶等。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在各种载体内部的微孔中，制成一定形状 2 第一章绪论 的固定化酶。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶。 但是，包埋法中载体中孔径尺寸选择性会影响大分子底物与产物的扩散。 1 2 1 3 交联法 交联法是借助功能试剂使酶分子之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。 最常用的功能试剂是戊二醛。用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用， 不易漏失，但由于固定化过程中酶分子发生了化学反应，导致酶分子比较容易失 、r 、佶。 包埋法和吸附法存在酶易从载体漏失或脱附的问题，交联反应激烈酶活力损 失较大。因此实际使用时常常两种或者几种固定化方法联合使用，如将酶先经凝 胶包埋后，再经交联等。这种采用两种或多种方法进行固定化的技术，称为双重 或多重固定化法，用此法制备的固定化酶活性高，机械强度好【2 3 1 ，增强酶的稳定 性。包埋交联法和吸附交联法都是常用的联用固定化法。 1 2 1 4 共价法 共价法指选择适宜的载体通过共价键或离子键与酶分子结合在一起而制成 固定化酶的方法。根据酶与载体结合的化学键的不同，结合法可分为离子结合法 和共价结合法。离子结合法通用的载体是各种离子交换剂，用离子键结合法制备 的固定化酶，操作简便，活力损失少，但是结合不牢固，在p h 值和离子强度等 条件变化时，酶容易脱落。共价结合法常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚 糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物，甲基丙烯酸共聚物等。用共价结合法制备的固 定化酶，结合牢固，酶不易脱落，可连续使用相当长的时间。 3 北京化丁大学硕士学位论文 黪母每 薰劂 鳓伪 图1 1 常见的酶固定化方法 ( 1 ) 离子吸附法( 2 ) 共价法( 3 ) 交联法( 4 ) 聚合物包埋法( 5 ) 微胶囊包埋法( 6 ) 脂质体包埋 f i g 1 1c o m m o n m e t h o d so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 2 4 】 ( 1 ) l o n i ca d s o r p t i o n ( 2 ) c o v a l e n ta t t a c h m e n t ( 3 ) c r o s s l i n k i n gw i t hr e a g e n t ( 4 ) p o l y m e re n t r a p m e n t ( 5 ) m i c r o e n c a p s u l a t i n gw i t hl i p i db i l a y e rm e m b r a n e s ( 6 ) l i p o s o m ee n t r a p m e n t 四种酶固定化方法各有优缺点见表1 1 ，几种方法联用往往效果更好，无论 采用何种方法，固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。其次要注意酶、载体及试 剂的费用、操作难易，与工业化有关的因素也必须考虑。 表1 - 1 各类固定化方法的比较 t a b l e1 - 1c o n t r a s to fd i f f e r e n tm e t i l o d so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 4 第一章绪论 1 2 2 新型的固定化方法 近年来，固定化方法在原有的基础上发展了许多新型技术。 1 2 2 1 定点固定化技术 定点固定化技术是通过分子生物学方法在酶蛋白上的特定位点与膜载体作 用，在载体表面形成一种高度有序的酶分子的二维阵列，使底物能充分接近活性 中心。与传统固定化方法相比，酶的活力和固定量都有显著提高，能有效克服传 统的固定化方法弊端，降低了底物接近酶活性中心时的空间位阻，使酶活力下降， 同时，使酶固定量得到提升。v i s h w a n a t h 等 2 5 】利用定点固定将b 半乳糖苷酶定点 固定在聚醚砜膜上，酶活力比传统固定化提高近二十倍。a m o u l l a s 等【2 6 】利用这一 方法成功地将葡萄糖氧化酶和过氧化酶固定在聚毗咯载体上，并通过固定化的亲 和素上剩余的结合位点识别固定生物素标记的酶分子，证明了定点固定化技术的 可行性。 1 2 2 2 多酶系统的共固定化 多酶共固定技术是指利用各种生物酶的功能协同催化复杂的生物转化过程。 将多种酶同时固定在载体材料上，是酶固定化研究的一个新方向。近年来，多酶 共固定技术用于膜生物传感器的研究十分活跃。c o n r a t h 等【2 7 】制成了用于检测无 机磷酸盐的电极，是在再生纤维素膜上将麦芽糖磷酸化酶、磷酸酶、葡萄糖氧化 酶和变旋酶同时固定。s p o h n - 等 2 8 】发现了用来检测谷氨酸、赖氨酸和黄嚓吟的新 技术，在载体材料上固定微生物过氧化酶与相应的氧化酶。另外，酶还可以与细 胞及其它一些生物分子共固定，构成更为复杂的生物转化体系。 1 2 2 3 酶结晶交联技术 先将酶结晶或沉淀，再对酶分子进行交联处理的固定化方法称作酶结晶交联 技术。这种方法优点稳定性好，酶活性损失较少，被认为是一种很有前途的酶固 定化技术2 9 , 3 0 。c a o 等报道对青霉素酞化酶使用酶结晶交联技术进行固定化， 得到了与游离酶活性相同的固定化酶，且在有机溶剂中也具有良好的稳定性。 z e l i n s k i 等【3 2 】使用酶结晶交联技术得到固定化酶，发现固定化酶的立体选择性增 强，这可能是由于酶的结晶过程除去了影响所需酶的杂质酶。 5 北京化工大学硕士学位论文 1 2 3 固定化酶的评价指标 游离酶被固定化以后，酶的催化性质也会发生变化。为考察它的性质，可以 通过测定固定化酶的各种参数，来判断固定化方法的优劣及固定化酶的实用性。 1 2 3 1 固定化酶的活力测定 固定化酶的活力是以反应初速率表示的，即每毫克( 干重) 固定化酶每分钟转 化1 p m o l 底物量或形成l t t m o l 产物的酶量为一个酶活单位，对于酶管、酶膜、酶 板等，则以单位面积的初速率表示。 固定化酶的催化性能还受酶的特性、酶固定量、催化反应条件及酶反应器构 型等影响。a k g o l 等t 3 3 1 将过氧化氢酶固定，在一定范围内，随着载酶量的增加， 酶的保留活性相应减少。这可能是由于膜微孔内的载酶量达到过饱和，阻碍了底 物的扩散所致。 1 2 3 2 酶活力回收率 固定化酶的总活力与用于固定化的酶的总活力之比称为酶的活力回收率。固 定化后酶保持的相对酶活是评价脂肪酶固定化效率的一个重要指标，从固定化脂 肪酶的活力看，一般只有几个到十几个单位，少数有几十到上百个单位，回收率 一般在0 - - , 3 0 ，少数效果较好的可达到百分之八九十。将酶进行固定化时，总有 一部分酶没有与载体结合在一起，测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果。 一般情况下，活力回收率应小于1 ；若大于1 j 多数是由于固定化活细胞增殖或某 些抑制因素排除的结果【3 4 1 。 1 2 3 3 稳定性 温度时游离酶应用时限制之一，而固定化酶催化反应的适合温度一般都高于 游离酶，说明固定化酶的热稳定性高于游离酶。 1 2 3 4 催化反应p h 值的影响 游离酶和固定化酶相对比来说，催化反应p h 值一般都发生偏离，这是因为 分配效应所致。载体如果带负电荷时，静电作用所致将溶液中的阳离子吸引到表 面，致使反应的微环境中阳离子浓度增加，反应溶液中的h + 浓度减少，从而使反 应溶液的p h 值偏高，最终导致催化最适合的p h 值向碱性偏移。反之向酸性偏移 3 5 , 3 6 。 6 第一章绪论 1 2 4 固定化酶的特性 生物酶被固定化后，酶催化反应的最适温度最适p h 值往往会发生一些变化。 影响因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 而生物酶经固定化后所引起的酶学性质的改变，一般认为其原因有两种，一是酶 本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。 1 2 4 1 固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比游离酶低。在同一测定条件下，固定化酶的 活力要低于游离酶的活力，其可能的原因是酶分子在固定化过程中，空间构象发 生了变化，活性中心的氨基酸也发生了变化；固定化后，酶分子空间自由度受到 限制( 空间位阻) ，会直接影响到活性中心对底物的定位作用，阻止底物分子与活 性中心的接近。不过也有特殊情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因是 偶联过程中酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶的稳定性。固定化对酶活性及 酶反应系统的影响十分复杂，常因酶的种类、反应系统的组成的不同而存在显著 的差异。 1 2 4 2 固定化对酶稳定性的影响 在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，表现在固定化酶的热 稳定性，对各种有机试剂的稳定性，对p h 的稳定性、贮存稳定性、操作稳定性 都有所提高。固定化酶稳定性提高的原因认为有以下几点：固定化后酶分子与载 体多点连接防止酶分子伸展变形，使酶活力得以缓慢释放；将酶与固态载体结合 后，导致酶分子失去了相互作用的机会，从而抑制了降解。 1 2 4 3 固定化酶最适温度的变化 酶催化的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶 的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常适合工业化得结果。当然， 也有酶经过固定化后最适温度不变或下降的。 1 2 4 4 固定化酶的最适p h 变化 酶固定化后，对底物作用的最适p h 和酶活力曲线常常发生偏移。偏移的原 因是微环境表面电荷性质的影响。般说来，用带负电荷载体( 阴离子聚合物) 制 备的固定化酶，其最适p h 比游离酶偏高，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液 中阳离子，例如h + 使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层h + 浓度比周围 的外部溶液高，即偏酸。这样外部溶液中的p h 必须向碱性偏移，才能抵消微环 境作用，使其表现出酶的最大活力。反之，使用带正电荷的载体其最适p h 向酸 7 北京化工大学硕士学位论文 性偏移。 1 2 4 。5 固定化酶的米氏常数( k m ) 变化 米氏常数用来表示酶和底物之间的亲和能力，k m 值越大，亲和能力越弱。 固定化酶的表观米氏常数k m 随载体的带电性能的变化而变化。当酶与带电载体 结合时，高级结构变化使载体引起酶与底物亲和力变化，从而引起k m 变化。如 载体与底物电荷相同，会造成固定化酶的表观l o 值显著增加。 1 2 5 固定化酶的应用 1 2 5 1 酶膜生物反应器 对于用酶进行催化反应的生物化工，目标产物的分离及酶的回收再利用是一 个很重要的问题。利用生物反应器可以将生物催化、产物分离和酶的回收等操作 结合成一个操作单元，从而使得这个问题得到解决。生物反应器己成为个非常 重要的生物化工研究领域【3 7 。4 0 1 。 1 2 5 2 生物传感器 生物传感器是以生物活性单元( 如酶、微生物、抗体或抗原、动植物组织切 片、核酸等) 作为生物敏感基元，与换能器( 如电极、热敏电阻、场效应晶体管等) 相配合组成的传感器。它的研究始于2 0 世纪6 0 年代。1 9 6 2 年c l a r k 等【4 l 】最先提 出酶电极的设想，利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应，与氧电极组合，制成了第 一支生物传感器。现在，生物传感器已广泛应用于环境检测、食品分析、生物医 药和军事等方面，其发展前景十分广阔【4 2 4 6 】。 1 2 6 固定化酶的制备原则 制备固定化酶时根据不同情况、固定化酶的应用目的、应用环境等，可以有 多种不同的方法来选择，但是都要遵循几个基本原则。 酶的催化活性保持专一性，酶蛋白的活性中心是酶的催化功能所在，使活 力与酶蛋白的空间构型密切相关。因此在酶的固定化过程中，必须注意酶与载体 的结合部位不应当是酶的活性部位，也就是酶活性中心的的氨基酸残基不发生变 化，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。 制得的固定化酶的操作稳定性决定这种种固定化方法能否付诸实用。若一 种固定化酶在反应器中能长期有效运转，工业化将有很好的前景。 8 第一章绪论 为了提高产品的产量，尽可能不妨碍酶与底物的接近，固定化酶应有最小 的空间位阻。 固定化酶对载体的要求 4 7 1 载体表面应具有多种化学活性基团，这些基团直接与生物分子偶联，或经过 较为温和的化学方法活化后与酶分子偶联，这是化学偶联制备固定化生物分子的 前提。 载体应是惰性的。载体的作用仅使酶分子固定化，而不应与底物、产物或反 应介质发生化学反应，有利于固定化酶保持稳定性。 载体应具有良好的生物相容性。 固定化技术是应用于生产，能够自动化和连续化实验。为此用于固定化的载 体应具有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎。 载体应能有利于固定化酶的反复使用，应有较大的表面积且不妨碍酶与底物 的接近，以有利于提高产物的量。 1 2 7 固定化酶中存在的问题 经过近半个世纪的研究和发展，酶固定化技术取得了很大的进步。现今固定 化技术已能得到稳定的固定化酶，改变生物酶的专一性、提高酶活力，从而改善 酶的种种酶学特性，使之更符合工业化的要求，而且还能创造适应特殊要求的新 酶。在酶的固定化方面，先后开发了多种固定化方法和性能多样的载体材料、固 定化生物催化剂反应器，可实现生产工艺的自动化操作，从而大大降低成本。固 定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。但是真正 投入工业化应用的固定化酶却不多见，主要是因为酶固定化的成本将直接影响其 应用。在工业化生产中，酶的固定化效率低、稳定性差、连续操作需要的设备比 较复杂，无形中会大大增加酶固定化的成本，从而限制了固定化酶的工业化应用。 生物催化剂不同于常规催化剂，三维构象对微环境的敏感性及其柔顺性是最 显著的特点之一。酶分子与底物分子接触进行催化反应的同时常需伴随着三维构 象的改变，因此其三维构象的柔顺性是影响其催化性能的重要因素之一。一些固 定化方法如吸附法，对酶分子的三维构象柔顺性等无明显不良影响，因而可获得 较高的固定化酶活性，但由于酶三维构象的变换自由度与游离酶相似，酶的稳定 性难尽人意，固定化酶很难具有理想的操作稳定性。其它一些固定化方法，由于 酶的三维构象及其柔顺性受到限制，常伴随酶活性的大量丧失。固定化载体也有 可能会触及到酶的活性敏感区，导致酶活性的下降。因此，如何获得具有理想的 三维构象柔顺性的固定化酶体系一直是生物催化剂多相反应体系研究中难以解 9 北京化工大学硕士学位论文 决的科学问题之一。 随着固定化技术的发展，酶固定化过程中不得不面对的另一难题就是如何避 免酶分子的微环境的改变，使酶分子的稳定性更高。当然酶的固定化技术还存在 一些其它方面的问题，如固定化酶寿命不长以及有些固定化酶难以与大分子底物 作用等等。因此，开发新型、高效固定化载体和酶反应器，进一步提高转化率和 生产能力，是未来研究的重点。 1 3 固定化酶载体的研究 1 3 1 固定化酶载体材料的性能要求 1 3 1 1 功能基团 基团o h 、c o o h 、c h o 能与酶分子发生反应，因此如果载体材料带有能 与酶分子发生反应的官能团，则可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时也 可提高固定化酶的操作性和稳定性。 1 3 1 2 溶解性 载体材料最佳是不溶于水的，可以防止酶失活，提高固定化酶的稳定性。 1 3 1 3 比表面积和粒径 载体材料的粒径越小，比表面积就越大，与游离酶接触的面积越大，固定 化程度就越高。若载体具有多孔结构，更易和酶相吸附，固定化率也就越高。 1 3 1 4 机械刚性及其稳定性 固定化酶的一个最大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚 性和稳定性都非常好。 1 3 1 5 对微生物的抵抗性 在溶液中长时间的使用时，载体材料必须可以抵制微生物的降解作用，对 微生物免疫的载体材料可以长时间的使用。 1 3 1 6 再使用性 若需要固定化的酶或所需要的载体材料较为昂贵，那么提高再使用性，就 会相应降低固定化酶的操作成本。 随着人们生活提高，对于大多数固定化领域都要求载体材料无毒、可降解， 1 0 第一章绪论 所以固定化酶对载体材料的要求是极其严格的，对于目前载体材料还没有很好的 能完全符合这些要求，酶固定化还存在很多问题。 1 3 2 固定化酶载体材料的研究现状 固定化酶的载体材料是影响固定化酶活性和稳定性的重要因素之一，酶与载 体之间的一些反应常常是降低酶活性的主要原因。不同的载体材料与酶分子之间 的作用能够使酶分子的三位构像和微环境都产生不同的变化，从而影响底物向活 性中心扩散速率。一些具有良好生物相容性的材料被广泛用于酶固定化载体，这 些材料能为催化反应提供一个有好的微环境。根据载体的化学组成和来源可以分 为无机材料、天然高分子、合成高分子、复合材料，近年来新型载体介孔材料。 1 3 2 1 无机载体 无机载体具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对 微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等。常见的载体 材料有多孔玻璃、硅凝胶、高岭石、氧化铝、无机硅藻土、金属氧化物【4 8 5 4 】等。 无机硅藻土或多孔玻璃比有机载体更耐微生物降解、更高热稳定性和更低的价 格。p a r r a d o 等【5 5 】用多孔玻璃作为载体固定化丝氨酸蛋白水解酶，固定酶的最适 反应温度由自由酶的5 5 升到6