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桃金娘多糖的分离纯化及其化学结构研究 摘要 对桃金娘果实中水溶性多糖进行提取与分离纯化，分别对多糖的提取过 程、粗多糖纯化组分的物理化学性质和低分子糖的组成进行了研究。 首先，采用有机溶剂加热回流的方法对原料进行脱脂，并先后用冷水及 热水对多糖进行抽提。然后采用s e v a g e 法除去蛋白质，并用乙醇溶液沉淀 多糖。将真空冻结干燥得到的粗多糖样品进行化学和仪器分析，测定粗多 糖的总糖、半乳糖醛酸及蛋白质含量，并利用气相色谱对其构成糖进行分 析。 通过与自然风干的桃金娘果实中多糖的性质进行对比，结果表明：桃金 娘果实中的果胶物质在自然风干过程中被微生物或酶大量分解。同时，对 低分子糖进行薄层层析，结果表明：冷水低分子糖的主要成分为半乳糖； 热水低分子糖的主要成分为阿拉伯糖。 用d e a e c el iuio s e ( h c o 型) 对热水抽提的粗多糖样品h w p 进行纯化。 得到纯化后组分h 0 ；h o 经d e a e - c ei iuio s e ( b , 0 7 p 型) 再次纯化得到组分 h o _ a 。h o - a 的构成单糖主要为阿拉伯糖和半乳糖，它们的构成比例约为 2 1 ：1 ，其余单糖均未检出。h o - a 在s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝较层析柱的洗脱 图显示，h o _ a 为均一多糖。与分子量标准物质的洗脱体积对比，计算其平 均分子量为2 7 ，0 0 0 。 h 0 _ a 的化学组成、构成单糖和红外光谱显示，它有可能是一种a 一构型 的阿拉伯半乳聚糖糖蛋白( a g p s ) 。 关键词：桃金娘多糖阿拉伯半乳聚糖糖蛋白 t h ei s o l a t l 0 n 州ds t r u c t u r er e a s e r c ho nt h e p o l y s a c c h a rid e sinr h o d o m y r t u st o m e n t o s af r u it a b s t r a c t i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o n o fw a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s i n r h o d o m y r t u st o m e n t o s aw e r es t u d i e d m e t h o d s f o rt h ep o l y s a c c h a r i d e s e x t r a c t i o na n dp u h f i c a f i o n ，c h a r a c t e r so fc o m p o s i t i o na n dc o n s t i t u t e so f m o n o s a c c h a r i d ew e r ei n v e s t i g a t e d a f t e rt h em a t e r i a lw a sd e g r e a s e db y o r g a n i cs o l v e n t ，p o l y s a c c h a r i d e sw e r ee x t r a c t e db y c o l dw a t e ra n dt h e nh o t w a t e r p r o t e i nw a sr e m o v e db ys e v a g em e t h o da n dp o l y s a c c h a r i d e sw e r e s u b s i d e db yg r a i na l c o h 0 1 a f t e rb ef r e e z e - d r i e d ，t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e sw a du s e dt oa n a l y z e t h ec o n t e n to fs u g a r ，g a l a c t u r o n i ca c i da n dp r o t e i n t h e na n a l y z e dt h e g l y c o s y ic o m p o s i t i o nb yg a s - - l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t sc o m p a r e dw i t ha i r - d r i e df r u i t si n d i c a t e dt h a tt h ep e c t i nw a s b r o k e nd o w nd u r i n gt h ed r y i n gc o u r s e t l ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eb a s i s o fc w s ( m o n o s a c c h a r i d ee x t r a c t e db yc o l dw a t e r ) a n dh w s ( m o n o - s a c c h a r i d ee x t r a c t e db yh o tw a t e r ) i sg a l a c t o s ea n da r a b i n o s e c r u d e p o l y s a c c h a r i d e s w e r et h e n p u r i f i e db y i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yo nd e a e c e l l u l o s e ( h c 0 3 。f o r m ) t h ef r a c t i o no b t a i n e d h 0 h 0w a st h e n p u r i f i e db y i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o n d e a e c e l l u l o s e 0 3 4 0 产f o r m ) ，a n dh 0 aw a so b t a i n e d i t sg l y c o s y l c o m p o s i t i o nw a sa r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e t h e r a t i oo ft h e mw a s a p p r o x i m a t e l y 2 1 ：1 f r o mt h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fh 0 一ao nas e p h a c r y ls - 2 0 0 ， t h ee l u t i o n p r o f i l e s s h o w e da s i n g l e a n d s y m m e t r i c a lp e a k t h e w e i g h t a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to fh 0 - aw a s2 7 ，0 0 0 t h er e s u l t so fo n rr e s e a r c hs u g g e s t e dt h a th 0 - aw a sp r o b a b l ya n a r a b i n o g a l a c t a n p r o t e i n s ( a g p s ) k e yw o r d s ： r h o d o m y r t u s t o m e n t o s a ；p o l y s a e c h a r i d e s ； a r a b i n o g a l a c t a n p r o t e i n s ( a g p s ) 广西大掌硕士学位论文橇金娘多糖的分离纯化a 其化学结构研究 第一章前言 1 1 多糖的研究概述 糖类化合物是自然界中最多的有机化合物，几乎所有的微生物、动物和植物中都含 有糖。糖类的研究已有百余年的历史，1 0 0 多年前德国著名科学家e m i lf i s c h e r 就开始 了对糖类的研究。早期的研究只是证明糖类物质是构成生物体的基本骨架；1 9 4 3 年，多 糖开始被作为药物使用；6 0 年代以后，多糖作为广谱的免疫促进剂才开始引起人们极大 的兴趣。在经历了一个相对寂静的时期之后，近年来糖类的研究又开始活跃起来。近3 0 多年，特别是近1 0 年的研究，彻底改变了人们对糖的原有认识。随着对糖和糖复合物 ( 如糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖等) 的分离、纯化以及结构鉴定技术的进步，人们才开始 认识到糖的结构要比核酸和蛋白质的结构复杂很多，并逐渐发现生物体中的多糖及糖类 复合物在生物体内的作用复杂而神奇。于是，人们不断的探索糖类在生物体中的各种生 物学机理。有关的研究渗透到生物学的各个领域。为此，1 9 8 8 年英国几位多年从事糖类 研究的学者首次提出了“糖生物学”这一名词。继之国际上又发行6 1 y c o b i o l o g y 和 t r e n d si ng y c o s c i e n c ea n dg y c o t e c h n o o g y 等杂志，标志着生命科学中- - f 3 新的前 沿学科糖生物学的兴起“1 ，它被称为“生物化学最后的巨大前沿之一”。 由于糖类的结构复杂，难以研究，所以比起蛋白质和核酸的研究进展，糖类的研究 显得远远落后。1 9 9 8 年4 月，国际生物大分子精细结构的数据库中，蛋白质、肽、病毒 的三维结构已达6 6 1 7 个，核酸5 3 6 个，而糖只有1 2 个。但是随着糖生物学的不断发展， 人类对糖的认识正逐步加深。目前，糖生物学研究所积累的可喜研究证据已经表明：糖 是除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质，多糖、寡糖以及它们与蛋白质、酯类等 结合形成的糖复合物涉及到细胞，特别是多细胞生命的全部时间和空间控制过程，首先 它们作为信息分子参与细胞的各种识别过程：传递生物信息、参与机体的免疫调节与细 胞分化、受精、胚胎发育、血液系统、感染、衰老等多方面功能密切相关。“1 其次，糖 的结构也影响到与其相连的蛋白质的功能，如影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗 原性以及生物活性等。“糖与核酸、蛋白质并列为生命体中最重要的3 种大分子”的概 念已经被越来越多的人所接受。 广西大掌硕士掌位论文犍金娘多糖的分离纯化及其化掌结构研究 1 2 多糖的多种生物活性 大量的药理和临床研究表明，植物多糖是一种免疫调节剂，它具有抑制肿瘤生长、 激活免疫细胞、改善机体免疫功能的作用。女贞子多糖、商陆多糖等能增强细胞免疫功 能：波叶大黄多糖、板蓝根多糖等对体液免疫有促进作用0 1 。王本祥等研究发现人参多 糖对实验性小鼠肿瘤有明显的抑制作用“1 。耿长山等报道枸杞多糖能提高小鼠白细胞介 导素一2 ( i l 一2 ) 的产生，而使老龄小鼠产生i l 一2 的能力提高到正常水平“1 。薛惟建等人 研究了昆布多糖及褐藻淀粉对小鼠实验性高血糖的防治作用，注射后小鼠血糖水平明显 降低”1 。彭红等人研究发现南瓜多糖能提高动物对高糖的耐受力；且与胰岛素有很好的 协同作用：它对正常动物血糖的影响不明显“1 。百合多糖降血糖能修复b 一胰岛细胞、增 强分泌胰岛素功能和降低肾上皮质激素分泌，以及促进肝脏中血糖转化为糖原的联合作 用，从而使血糖降低，对治疗糖尿病有显著的效果”1 。刘晓莉等人研究发现，枸杞人参、 银杏叶、天麻水提液均可降低小白鼠体内m d a 的含量。人参对脑和心肌中m d a 含量的抑 制率最高，分别为2 0 6 和2 1 3 ；天麻对肝和肾组织中m d a 含量的抑制率最高，分别为 1 4 5 和1 3 6 “1 。魏文树等对云芝多糖生理活性研究证明其对活性氧有清除作用。实验 结果显示，以生理盐水为对照，0 3 2 0 的沙棘多糖溶液就已有明显的抗氧化作用( p 0 0 1 ) ，随着浓度的升高，抗氧化作用明显上升嘲。张熙等研究发现，枸杞多糖能有效 对抗自由基过氧化，使受损膜电学功能发生逆转，这是其抗衰老的原因之一“”。另外， 莲子多糖也具有较好的清除羟基自由基( o h ) 的功效，最高清除率可达2 9 1 1 。 目前，慢性肝炎已经成为困扰很多人的顽症，许多研究发现，植物多糖对于慢性肝 炎也具有一定的治疗功效。例如，预先腹腔注射黄芪多糖对内毒素造成的小鼠肝内明矾 沉淀类毒素( a p t ) 水平、电子偶联( e c ) 值下降具有明显的拮抗作用。香菇多糖肯定 对慢性肝炎有免疫调节作用，主要是促进t 细胞活性，对辅助性t 细胞及杀伤性t 细胞 的促进作用尤为显著，具有抗病毒及诱生干扰素保护肝脏的作用。另外，香菇多糖还能 降低肿瘤相关抗原( t 从) 和氢化泼尼松等引起的血清谷一丙转氨酶( s g p t ) 升高，可使 小白鼠肝匀浆细胞色素p - 4 5 0 含量增加。用猪苓多糖注射液治疗慢性病毒性肝炎5 3 8 例， 对改善自觉症状、s g p t 恢复j 下常等验证均有显著性差异，乙肝表面抗原滴度下降及抗原 转阴率达3 5 4 3 8 6 ，均优于对照组，具显著性差异“”。 除了上述功效外，y ey i n 1 等又研究了植物多糖在胃肠道及肝病中的新作用“。文 章指出：植物多糖对胃肠道具有保护和修复功能，治疗胃肠和肝脏的紊乱、溃疡及肿瘤。 j 西大学坷e 士掌位崔! 文 期啊釜娘多糖的分离烈呵匕及其化学结相句院 例如：糊精、人参果胶这2 种植物多糖对大鼠实验性胃溃疡( 消炎痛型、应急型、幽门 结扎型及醋酸型) 均有不同程度的抑制作用。红藻类多糖也具有抗溃疡作用。另据报道 褐藻淀粉、海带淀粉有明显的抗凝、解痉、解聚、降压降脂、降低血粘度及扩张血管和 改善微循环的功能，从而达到抗心血管疾病的作用。同时海藻及海带多糖具有对有毒重 金属( 如p b 、s n 、c d 等) 的阻吸功能和抗辐射功能。 总之，植物多糖具有许多生理活性和保健功能。植物来源的多糖类化合物由于它们 的独特功能和很低的毒性，随着植物多糖研究的不断深入，其在临床应用和保健食品开 发上将有很广阔的前景。 1 3 植物多糖的结构和构效研究进展 多糖的结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂，可以说是最复杂的生物大分子。糖的 结构分类沿用了蛋白质和核酸的分析方法，寡糖和多糖的结构可分为一级、二级、三级 和四级结构。同时，多糖的构效关系也极为复杂。研究多糖的构效关系十分有意义，具 有何种结构的多糖才具有生物活性，结构的改变如何影响多糖的活性，诸如此类的工作 都是为了解释多糖的结构和功能关系，是寻找具有生物活性多糖药物开发的基础。 真菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构是指 其单糖残基的组成、排列序列、连接方式等；二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形 成的各种聚合体，这只关系到其分子主链的构象，不涉及侧链的空间排布；三级结构是 指由多糖中糖残基中的羟基、羧基、氨基及其他功能团通过非共价作用而导致的有序、 规则而粗大的空间构象；四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集 体“”。关于真菌多糖的化学结构和生理活性之间的关系一直是人们关注的焦点。就其一 级结构而言，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一些官能团对其生物活性都有影响。 j h o m s o n 测定小核菌多糖结构，发现它是分支的b ( 1 3 ) d 一葡萄糖，具有抑瘤活性，而 d ( 1 3 ) d 一葡萄糖没有抑瘤活性。另外，”cn m r 分析推断，连接在b ( 1 3 ) d 一葡萄糖 上的多羟基基团对抗肿瘤活性起重要作用。多糖立体结构中b 螺旋具有较强生物活性， 可拉伸状有一定的生物活性，而其它两种结构无生物活性。有报道香菇多糖的b 三维螺 旋一旦破坏，免疫活性随之消失“”。目前，对于这种细微结构的影响机理，仍不甚了解。 高级植物多糖的结构比真菌多糖要复杂的多。目前，许多具有生理活性的植物多糖 及糖蛋白的基本构造已得到证实。如从枸杞中提取的阿拉伯半乳聚糖糖蛋白( a g p s ) “”、 桃金蛾多糖的分离纯化及其化学结构研究 从c a l e n d u l ao f f i c i n a l i s 分离出的阿拉伯半乳聚糖“”、从灵芝中提取的阿拉伯木聚葡 糖“”、从茯苓中提取的b d - 葡聚糖“”、从肉苁蓉中提取的支链含有阿拉伯糖和木糖的 葡聚糖。1 、从褐藻中提取的岩藻聚糖。o 以及从榆耳中提取的葡萄糖半乳聚糖恤1 等。另外， 半乳糖醛酸聚糖也是被证明具有生物活性。曾有人报道，人参中的r g 多糖具有生物活 性，但并未解释其活性中性所在。 有学者指出，多糖中可能存在活性中心，也就是一些特异的寡聚糖片断。它们的特 殊构造形似开口水槽，并称之为“凹形结构”。”如植物中对植物细胞有明显保护作用 的葡七糖就具有典型的凹形结构，对细胞具有保护作用汹1 。从漆树的体液中分离出的漆 多糖具有凝血剂作用汹。 多糖的结构及构效关系的研究是多糖生物学的一个主要领域，至今还不完善，通过 得到活性多糖较为准确的一级结构，将特定的物理常数计算和现代分析方法联合，推测 多糖的高级结构，并利用多糖高级结构模型与生命细胞受体模型推断多糖的作用方式， 可为人们筛选活性多糖，改造多糖为更具活性的物质提供必要的理论基础。 1 4 植物多糖的发展前景 经过半个多世纪的发展，植物多糖的研究取得了重大进展。建立了一系列多糖的提 取、纯化方法、生物活性测试方法、结构分析方法，发现了许多具有重要生理活性的多 糖，研究的广度和深度在不断发展。随着多糖化学和糖生物学的深入研究，植物多糖的 研究将会进入一个崭新的时代，必将为人类的健康和安全提供更为有力的帮助。 1 5 中草药多糖研究的发展 中草药是中华传统文化的重要载体。但随着时代的变迁，传统中药在生产与使用中 的一些缺陷和弊端日渐突出，已经步能适应现代医学的要求，必须进行深刻改革，采用 新的研究方法对其药效成分进行深层的研究。我国的药用资源总数达1 2 8 0 7 种，其中药 用植物1 1 0 0 0 多种。”。中草药是中药发展的基础，但目前有些中草药，特别是野生中草 药仍未被合理开发。中草药作为药物开发及理论研究，主要是中草药的提取和成分分析。 日本早在6 0 年代就开始对中草药多糖的开发和l 临床药效进行研究。在这方面，我国明 显已落后于日本、韩国。“” 中草药的提取有着久远的历史，汤剂和酒剂就是典型的代表，但传统的丸、膏、丹 - - 西大学顾士掣位谶- 文期竹 娘多糖的分离爿玳a 善p f 撑鲒- 柯研究 等多数剂型是由中药饮片不经提取或仅经过粗提而制成的，随着时代的发展，其弊端逐 步突出。为了提高中药疗效，拓宽给药途径，中草药有效成分的提取已经日渐重要。 随着糖类生物化学研究的不断深入，中草药多糖逐渐成为研究的热点。国际上至今 已报道了1 0 0 多种具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、延缓衰老、抗感染等多种 生理活性的中药多糖。有的已在临床上被用于肿瘤、肝炎、心血管疾病的辅助治疗和康 复啪。中草药的主要免疫活性物为多糖或糖缀合物，包括糖肽、蛋白多糖等。多糖类 成分是增强机体免疫的物质基础，对促进和恢复机体免疫机能作用极为明显。o ”日本从 6 0 年代就开始研究担子菌多糖的药物活性，有的多糖已成为有名的药物。我国近年来对 中草药多糖的药物活性也有了广泛的报道。李广宙等d 2 1 了研究香菇多糖可显著提高荷瘤 小鼠肠系膜淋巴和脾脏n k 细胞活性。曾淑宝等0 3 1 通过实验证实：云芝多糖( p s k ) 对多 种癌细胞具有明显的抑制作用，并且能能延长荷瘤小鼠的生命。近年来，硫酸化多糖用 于治疗艾滋病已引起了人们的广泛关注。许多经硫酸酯化的多糖，如香菇多糖、地衣多 糖的硫酸酯有明显的抑制h i v 一1 活性，其作用机理是干扰h i v 一1 对宿主细胞的粘附作用， 抑制逆转录酶的活性，抑制h i v 诱导的合胞体的形成等m 1 。如香菇多糖在浓度达 5 0 0ug m l 时，对h i v 无抑制作用，但硫酸酯化香菇多糖在1 0ug m l 时就能强烈抑制 眦v 抗原的合成】。 至今，许多中草药多糖免疫调节剂的结构与功能的关系仍不是十分清楚，但高级结 构对功能的影响比一级结构还重要，这一点已成为科学家们的共识，而决定高级结构的 重要因素是多糖分子链内和链外的氢键。除了立体构型是决定多糖生物活性的决定因素 之外，多糖的分子量、取代基、溶解度、粘度，甚至给药剂量、给药途径等也能影响其 生物活性。目前，无论是国内还是国外，中草药免疫调节剂的研究领域里存在几个重要 问题有待于进一步深入研究：一是目前用于实验药理学研究的中草药免疫调节剂大多数 处于一些粗制剂阶段，这使得要在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机制受到了很 大的限制：二是国内虽有不少的中草药多糖免疫调节剂已应用于临床，但由于其化学结 构不明确，质量也很难控制，造成药效重复性较差；三是作为中草药免疫调节剂的多糖 及糖苷类化合物的结构测定本身因分离、纯化及研究技术的限制仍有很多困难，所以其 立体结构、结构与功能的关系等未得到阐明汹1 。因此，有关中草药多糖的结构以及构效 关系的研究还有待进一步深入。 广冒。犬掌硪士掌岱潞文柱金l 多囊的分离眦a 其化掌堵拍研完 图卜t 桃金娘 f i g t lr h o d o 口y r t u st o l t o s s ( a i t ) h a s s k ，西大学田e 士掌位甚姨橇馘多耱的分离蜊批占摸刖撑结构司院 1 6 桃金娘简介 桃金娘( r h o d o m y r t u st o m e n t o s a ) ( 见图卜1 ) ，又名稔子、山稔、当梨子( 广东) ， 岗稔( 两广) ，桃娘、唐莲( 福建) ，是桃金娘科桃金娘属常绿多花小灌木。生于阳光充 足的丘陵地带及旷野间，常与铁芒萁等形成优势群落，广泛分布于我国福建、台湾、湖 南、广东、海南、广西、贵州、云南等省( 区) ，印度、日本、菲律宾也有分布o ”。桃 金娘植株高1 2 m ，叶对生，叶柄长4 6 c m ，革质，椭圆形或倒卵形，叶长4 6 c m ，宽 1 5 3 c m ，表面深绿色，下面灰绿色，密被灰白色茸毛。春末开花，花期为5 7 月， 花有红、粉红、白等多种颜色，聚伞花序腋生状似梅花。浆果近球形或卵形，长1 1 6 c m ， 直径可达1 4 c m ，仲夏陆续成熟，果期为7 9 月，熟果由土黄变紫黑色汹1 。 桃金娘是一种常见的中草药，全株可供药用。另外桃金娘果实也可鲜食，果肉呈 紫红色，肉质多汁，汁液呈紫红色。同时，桃金娘果实含有较为全面的营养成分( 见 表卜1 ) m 1 ，富含黄酮甙、酚类、氨基酸、有机酸、糖类等多种有效成分“”( 见表卜2 ) ， 尤其粗纤维的含量3 4 9 7 ，v c 的含量高达2 8 8 0 m g l o o g ，b 一胡萝h 素含量为 0 3 9 m g l o o g 。是一种难得的药膳同源新资源，具有较高的开发利用价值。 表卜1桃金娘果实中主要营养成分的含量( ) 。” t a b l e l 一1t h ec o n t e n to fm o s t l yn u t r i e n tc o m p o n e n ti nr h o d o m y r t u st o m e n t o s a 表卜2 桃金娘果实其它主要成分的含量( 占鲜重) “” t a b l e l 2t h ec o n t e n to fo t h e rc o m p o n e n ti nr h o d o m y r t u st o m e n t o s a 据表卜3 可知，桃金娘果实中含有1 8 种氨基酸，总量为4 3 5 3m g g ，其中包括人 体所必需的八种氨基酸，必需氨基酸的含量为1 3 4 7m g g ，占氨基总量的3 0 9 4 。桃 y - - 西大掌硕士掌位论文 裢金娘多锫的分离纯1 匕a 其化学结构研究 余娘果实中谷氨酸的含量最高，占总量的2 0 5 ，谷氨酸在人体代谢中具有重要意义， 为脑组织生化代谢中首要氨基酸，参与多种重量活性物质的合成，在大脑、肌肉、肝脏 等组织中发挥解毒作用。同时我们注意到苯丙氨酸、酪氨酸的含量也较高，而豆制品、 乳制品中的苯丙氨酸较缺乏，牛奶、鸡蛋中不含酪氨酸，因此，桃金娘果实与豆制品、 乳制品等有良好的蛋白质互补作用。 表卜3 桃金娘果实的氨基酸含量( m g g ) 。” t a b l e l 一3t h ec o n t e n to fa m i n oa c i d si nr h o d o m y r t u st o m e n t o s a 桃金娘果实的矿质元素的含量也极为丰富，在常量元素中k ，c a ，p 的含量高于一 般的果品，这些元素是构成人体内多种酶的成分，与人体新陈代谢、智力发育等一系列 生命活动密切相关，而n a 含量极低，桃金娘果实这种高钾低钠的特点具有重要的应用 价值。桃金娘果实中的微量元素含量各异，但f e ，z n 元素含量突出。近年来的研究表 明，硒参与谷甘胱肽过氧化物酶的合成，具有抑制过氧化反应，清除自山基、分解过氧 化物和修复分子损伤的作用。桃金娘果实中硒含量为o 1 2 p p m ，同时有害微量元素p b ， c r ，h g 的含量低微。 j 。西大擘啁匣士学位崔汶期：蕾够糖的分离爿弭及擞珂匕学罐占槽研究 表卜5 桃金娘果实中微量元素的含量( p p m ) 。” t a b l e l 一5t h ea o n t e no fm i c r o e l e m e n ti nr h o d o m y r t u st o m e n t o s a 1 7 桃金娘的利用及研究概况 桃金娘作为中草药很早就被加以采收利用。有关其药用价值的记载很多，如：生 草药性各要“健大肠、亦治蛇伤”；纲目拾遗“养血、明目”；本草求原“止痢、 赤血带，生肌止血”；广东中药“治夜多小便，耳鸣遗精，炒黑治血崩”；南宁市药 物治“补血、收敛，治腰肾酸痛、水泻，疗妇人血崩” 4 1 o 民间常食桃金娘果实治疗 牙龈炎、牙周炎等，效果很好。在民间的疗法中，有人利用桃金娘与羊肉同煮制汤，用 于治疗哮喘病，效果比较明显“”。三神汤炖猪肚治疗小儿厌食症在闽南已是家喻户晓， 当患者面色少华时加入桃金娘果，具有酸甘化阴之意，清而不滋，养胃生津，可奏运脾 养胃之功“”。还有文献记载，民间常用桃金娘干粉防治新生儿褶烂“”。但长久以来桃金 娘一直未引起研究者过多的关注。 随着食品加工业的发展，人们开始寻找各种可供加工的新资源，因桃金娘果实酸甜 鲜美，汁液呈诱人的紫红色，而且具有很好的营养价值和保健功效，因此被逐渐用于果 汁及果酒的加工。刘芳等人利用多种配方研制的桃金娘澄清果汁，具有桃金娘汁特有的 广西大学嘎毗 掌位崔- 文毵蕾够糖的分离爿弭匕巩其喇掉结构研究 色泽和风味，酸甜适度“。江彩华等人使用桃金娘果汁、白糖、柠檬酸和柠檬酸钠等制 成了桃金娘保健饮料。他们认为，桃金娘有很好的药用价值，而且富含有机锰，对预防 肝癌、肝炎等疾病具有重要意义“”。吴文龙以桃金娘、枸杞、红枣为主要原料，以海藻 糖为主要辅料，在分析其营养成分的基础上进行配搭，经过原料处理、调配、均质和杀 菌，研制成了一种低糖的复合保健饮料。经过研究，当原料的配比为桃金娘汁：枸杞汁： 红枣汁为4 ：3 ：2 时，产品颜色、口感较理想“”。郑联合等研制桃金娘果汁的试验表明， 加热处理或加甘草汁可达到护色的目的，而加柠檬酸，护色效果不显著：桃金娘果的表 皮及果芯有苦涩味，会影响果汁的风味，去除果芯可以大大降低果汁的苦涩味，加入甘 草汁可以掩蔽果汁的苦涩味：用正交试验对甘草汁、蔗糖和蜂蜜、柠檬酸的调配比进行 试验，实验结果表明：最佳配方为甘草汁1 0 ，蔗糖6 ，蜂蜜0 1 5 、柠檬酸0 1 “”。 同时，桃金娘果是一种优质的果酒资源，具有汁多、可溶性固形物含量高、酸甜适 度、果香浓郁、色泽好、污染少、资源丰富等特点。桃金娘果酒的开发利用符合当今果 酒发展的四大特点，前景广阔。刘芳等人研制的桃金娘娘果酒品质优良，除了独特的感 官品质以及符合0 8 9 2 1 8 4 葡萄酒理化标准和卫生标准外，还含有独特的营养成分和药 用成分，如还原型v c 、氨基酸、黄酮类，适合于男女老青饮用。同时他们指出，因桃金 娘果含有较多的果胶物质和单宁，不适合加工全发酵型果酒，浸泡果酒酒味又不醇和， 因此选用发酵一浸泡配合法加工桃金娘果酒既可提高果酒的品质，又可以提高原料的利 用率“。胡丰林等人通过检验发现，桃金娘果皮上的酵母菌很少，因此不宜采用自然发 酵，以人工发酵为佳。同时对处理后原料酿酒适应性分析，确定了原料的最佳处理方式； 并通过正交试验确定了最佳发酵条件呻1 。 由于天然色素中紫红色素的紧缺，所以已经有人对其色素的提取及稳定性进行了初 步研究，高永辉等人以桃金娘果为原料，用酸性乙醇液浸提制得桃金娘色素，并对其稳 定性进行了研究。结果表明，该色素在酸性条件下对光、热、常用食品添加剂均具有较 好的稳定性”1 。钟海雁等人研究表明，桃金娘红色素与同类天然红色素相比，色价较高， 对光、热和a 1 3 + 等相对稳定。而且提制工艺简单，成本低廉，在水果饮料及其他果品中 着色，色调自然，具有一定的实用价值洲。但目前为止，但对桃金娘色素主要成分的分 析及应用研究尚未见报道。 近年来，药用植物的研究愈加深入。侯爱君等人从桃金娘叶中分离得到3 种黄酮苷 和1 种可水解丹宁，经化手和波谱分析，确定它们的结构分别为杨梅素一3 一俨n - l - 鼠李 糖苷，杨梅素一3 一伊q l 呋喃阿拉伯糖苷，杨梅素一3 一q - b d - 葡萄糖苷和2 ，3 - 六羟基 1 0 广西大掌硕士学位论文 槌金娘多糖的分离纯化反其化掌结构研究 联苷基一d 一葡萄糖，这些成分均为首次从该植物中得到”“。刘延泽等人利用d i a i o n h p 一2 0 ，t o y o p e a r li 1 j 一4 0 及m c ig e lc h p 一2 0 p 等反复柱层析，从桃金娘叶及根中分得9 种可水解丹宁，其中3 种为c 一甙可水解丹宁。经化学方法和波谱分析，分别确定 为：p e d u n c u l a g i n ( r t 一2 ) ，c a s u a r ii n ( r t 一3 ) ，c a s t a l a g i n ( r 2 9 ) 和一新的c 一甙 可水解丹宁( r t 一8 ) ，命名为山称甲素，这些化合物均为首次从该植物中得到”1 。 近年来，标准桃金娘油的研究逐渐深入。标准桃金娘油肠溶胶囊是为桃金娘科植物 桃金娘的叶片的标准提取物，主要成份为标准桃金娘油，含桉油精、柠檬烯等单萜，是 含挥发油的粘液溶解剂，具有独特的作用机理，能碱化、稀释粘液，刺激支气管纤毛摆 动，促进痰液的溶解与排出。朱国平研究表明，标准桃金娘油肠溶胶囊在治疗慢性支气 管炎感染加重期、改善患者临床症状中，具有确切的疗效；该药口服后有甘甜清凉感， 不含糖，服用方便，未发现明显副作用，易被患者接受，是l 临床上治疗慢性支气管炎驱 痰消炎的良药“。李再香研究表明，标准桃金娘油可作用于黏液纤毛清除系统的各个部 分，促进黏膜功能的恢复和重建，改善鼻腔和鼻窦的通气和引流，减少功能性鼻内窥镜 手术后复发和并发症，有利于术后清创处理，加速术腔恢复并缩短疗程”。 综上所述，桃金娘具有很高的开发利用价值，但桃金娘目前还处于野生状态，分布 不集中，成熟期也不完全一致，为了保证加工原料的品质及长年生产的需要，必须进行 贮藏，如果贮藏不当，桃金娘果中所含有的大量红色素( 花色苷) 会被大量损失，从而 使其加工产品色泽暗淡，感官质量大大降低，因此，好的贮藏方式应能很好地保持桃金 娘的天然色泽。胡丰林等以桃金娘果中花色苷的变化作为判断指标，对桃金娘果实贮藏 方式进行研究。实验及分析得出结论：桃金娘果实贮藏时，干藏是一种很好的贮藏方式， 具有色素保存率高、贮藏成本低、处理简便、运输及使用方便、贮藏安全等优点”1 。为 扩大桃金娘的种植范围，杨治国对桃金娘的扦插繁殖进行了研究。用经两年驯化的桃金 娘嫩枝和硬枝作插穗，采用砻糠碳黑等5 种扦插基质，用不同浓度的6 号a b t 生根粉处 理插穗进行比较试验，得出用砻糠碳黑做基质采用嫩枝扦插方式育苗能显著提高成活率 “。桃金娘扦插繁殖的成功，可以将桃金娘从野生状态引入大量种植状态，提高桃金娘 产量，从而应用到保健食品的开发。 j - - 西大掌硕士学位论文 槌金娘多糖的分离纯化及其化掌结构研究 1 8 研究的意义和目的 天然药物自古以来就为人类的健康服务，早在东汉时期，我们的祖先就汇编了第一 本有关天然药物的著作神农本草经。在中国，天然药物又称为中草药，它与中医一 起构成了中华民族文化的瑰宝，也是全人类的宝贵遗产。天然药物之所以能够防病治病， 其物质基础在于所含的有效成分。多糖就是中草药的有效成分，研究中草药多糖，目的 在于研究其化学结构、理化性质与生物活性之问的关系，逐步阐明其防病治病的原理。 桃金娘是一种常见的中草药，果实营养成分丰富，具有良好的营养保健价值，氨基 酸、粗纤维、无机元素、维生素等项目的测定结果，表明了桃金娘果实能够发挥促进人 体生长，预防和治疗多种疾病等多方面的生物学功效，若能将它开发成新型的果汁饮料、 果酒和保健食品，必将具有一定的市场前景。另外，桃金娘生长迅速，光合效率高，抗 逆长强，适应性广，栽培条件不高，便于推广种植发展。因此，具有很高的开发利用价 值。 广西的桃金娘资源丰富，为了拓展中草药多糖的研究，并针对我国丰富的中草药资 源及广西植物资源现状，本文选取桃金娘为研究材料，意在解释其多糖的分子构造，并 以此为依据，探究其活性中心结构，解释其作为药用植物对人体产生生理活性作用的原 因所在。并进而将桃金娘多糖应用于生物制药和保健食品的加工。 犍= 嗑d 够糖的分离弭匕及其冲匕j 黼构研究， 2 1 实验材料及仪器 第二章材料与方法 2 i 1 实验材科 新鲜桃金娘果实( 2 0 0 2 年8 月购于广西南宁市) ，于- 2 5 c 冷冻保存，供本实验研究 使用。 桃金娘果实( 1 9 9 9 年9 月购于广西南宁市) 经自然风干后的干果，供本实验研究使 用。 2 1 2 实验仪器 ( 1 ) 紫外分光光度仪：u v - 1 6 0 1 p c( s h i m a d z u 日本岛津) ( 2 ) g l c ：g c 一1 7 a ( s h i d z u 日本岛津) 分离柱：s h i m a d z uc a p i l l a r yc o l u m nd b i ( 0 2 5 r a m x3 0 m ) 担体：1 0 0 - - 甲基聚硅氧烷 载气：n ： 检测器：氢火焰检测器( f i d ) ( 3 ) 透析袋( 美国) 规格：d = 4 4 ，3 2 ，2 4 m m ，可截流分子量3 0 0 0 ( 4 ) 冷冻升华干燥机：m o d e l7 7 5 0 0( l a b c o n c 0 美国) ( 5 ) 电脑恒温层析柜：c x g l( 上海精密科学仪器公司) ( 6 ) 超高速冷冻离心机：k u b o t a 6 8 0 0( s 眦m a d z u 日本岛津) ( 7 ) 傅立叶转换红外光谱仪：s p e c t r u mg x( 美国) ( 8 ) 旋转蒸发器：r ：2 0 1( 上海亚荣科学仪器厂) ( 9 ) 循环水式多用真空泵：s h b i i i( 郑州长城科工贸公司) ( 1 0 ) z 型层析柱：2 6 x 6 0 ，l 。6 x 6 0( 上海精密科学仪器公司) ( 1 1 ) 电脑全自动部分收集器：d b i 0 0( 上海沪西科学仪器厂) ( 1 2 ) 超声波药品处理机：j b t 0 0 0 3 2 0 0 2( 山东济宁金百特电子有限公司) ( 1 3 ) 电热沙浴锅：4 0 4( 上海亚荣科学仪器厂) - - - 西大掌硕士学位沦文 犍金娘多翱 的分离纯化覆其化学结构研究 ( 1 4 ) 电子天平：a y l 2 0 ( s h i m a d z u 同本岛津) ( 1 5 ) 磁力加热搅拌器：7 8 一l( 江苏金坛科学仪器厂) ( 1 6 ) 手提式压力蒸汽灭菌器：s g 4 1( 上海博迅) ( 1 7 ) 电热恒温水浴锅：h h s 2 1 4 ( 上海精密科学仪器公司) ( 1 8 ) 电热鼓风干燥箱：1 0 1 一i a b( 天津泰斯特公司) ( 1 9 ) 自动双重纯水蒸馏器：d 1 8 1 0 c ( 上海亚荣科学仪器厂) ( 2 0 ) 高速组织捣碎机：d s 一1 ( 上海亚荣科学仪器厂) ( 2 1 ) 多管架自动平衡离心机：t d z 5 一w s( 上海精密科学仪器公司) ( 2 2 ) 调温电热套：k d m ( 山东济宁金百特电子有限公司) ( 2 3 ) 不锈钢电热板：d b 一2( 江苏金坛江苏金坛科学仪器厂) ( 2 4 ) 电动搅拌机：d 2 0 2 f ( 江苏金坛江苏金坛科学仪器厂) 2 2 一般方法 22 1 糖的定性测定( m e is hr e a c t i o n ) ”1 原理：本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应，它利用糖在浓硫酸作用下形成的糠醛 及其衍生物与a 一奈酚作用，形成红紫色复合物来鉴定糖的存在。实验时，在糖溶液与 浓硫酸两液面间出现紫色环带，因此又称紫环反应。 实验步骤：取样品液l m l 于试管中，滴加2 3 滴q 一奈酚溶液( 溶剂为9 5 的乙醇) ， 充分混合，沿试管壁缓慢加入浓硫酸2 3 m i ，观察两液面交界处是否有紫色环生成。若 有紫色环生成则表明m o l i s h 反应呈阳性，即表明样品中有糖类物质的存在；否则即呈 阴性。 2 2 2 总糖的测定( 苯酚一硫酸法：p h e n 0 i s u i f u r i ca c i dm e t h o d ) 原理：糖在浓硫酸作用下生成糠醛或糠醛衍生物，上述物质可与苯酚缩合生成橙色 物质，且呈色强度与糖含量成正比，并在4 9 0 h m 处有强吸收峰。 实验步骤：分别取标准样+ 和样品液0 5 m l 于试管中，加入5 苯酚溶液0 5 m l ，并 缓慢加入浓硫酸2 5 m l ，充分混合，静置3 0 m i n ，于4 9 0 n m 下比色。 标准样品：d ( + ) 一g l u c o s e ，d - g a l a c t u r o n i ca c i d ，d ( + ) 一g a l a c t o s e ( s i g m a 公司) f - 西大学两匣七掌锄叶每文 审0 盒确电多糖的分离量眦及羽；喇罐鼻结构研3 2 2 3 蛋白质的测定( 考马斯亮蓝法：b r s d f o dm e t h o d ) 汹“1 原理：考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定方 法具有超过其他方法的突出优点，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。考马斯亮蓝 g - 2 5 0 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由4 6 0 n m 变为 5 9 5 r 衄，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨 基酸( 特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。在5 9 5 n m 下测定的吸光度值与蛋白 质的浓度成正比。 考马斯亮蓝g - 2 5 0 蛋白试剂的配制：称取l o o m g 考马斯亮蓝g - 2 5 0 ，溶于5 0 r a l 9 5 的乙醇中，加入l o o m l8 5 ( w v ) 的磷酸，最后用蒸馏水定容到1 0 0 0 m l 。试剂的 最后浓度是0 0 1 ( w v ) 考马斯亮蓝g - 2 5 0 。此溶液在常温下可放置一个月。 实验步骤：分别取标准样和样品液0 i m l 于试管中，加入2 m l 考马斯亮蓝g - 2 5 0 反 应液，盖塞，将试管中溶液震荡摇匀，放置5 m i n 后，在5 9 5 n m 处测定吸光度值，以 蒸馏水加反应液为空白对照。 标准样品：牛血清白蛋白( s i g m a 公司) 2 2 4 半乳糖醛酸的测定( 咔唑硫酸法的改良法) “2 删 原理：半乳糖醛酸在浓硫酸作用下与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物， 该化合物在5 4 0 h m 处有强的吸收峰，其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比，可用比色法 定量测定。 0 1 2 5 咔唑的配制：称1 2 5 m g 咔唑，用l o m l 无水甲醇定容，震荡摇匀。 实验步骤：移取3 m l 浓硫酸于试管中，用流动水冷却，缓慢加入标准样品及样品 液0 5 m l ，混合均匀，并用玻璃球将试管盖住，置于1 0 0 c 水浴中加热l o m i n ，取出，用 流动水冷却后，加入0 i m l 咔唑( 0 1 2 5 ) ，此时溶液呈现紫红色，于1 0 0 c 水浴加热 1 5 m i n ，取出试管，置于流动水中冷却后，于5 4 0 h m 波长下比色。 标准样品：d - g a l a c t u r o n i ca c i d ( s i g m a 公司) 2 2 5 透析州 原理：透析法的原理是利用半透膜，将不可透析的大分子物质被截留于膜内，可透 析的小分子经扩散作用不断透出膜外，直到膜两边浓度达到平衡。本实验中使用的透析 袋可截留分子量为3 0 0 0 ，单糖等小分子物质可以透出膜外，而多糖被截留在膜内，从而 达到对多糖纯化的目的。 实验步骤：将多糖溶液浓缩后，装入透析袋中，排出空气，用橡皮筋扎口，悬挂在 广西大肆顷士掌位试- 文桃盖够辖的分离手e 化a 善0 f 匕掌群构研究 清水容器中，用流动水透析4 8 h 。取出，保藏。 2 2 6 构成糖的分析( b i a k e n e y 法) 慨6 町 原理：采