（发育生物学专业论文）claudin3在小鼠围着床期子宫中的表达与调节.pdf

摘要 摘要 封闭蛋白3 蛋白是紧密连接的组成成分之一。紧密连接对于溶质在细胞旁的扩散形成了 一个初级屏障，并且在基底外膜侧和顶端之间起到了一个屏障的作用，来建立和维持上皮细 胞和内皮细胞的极性。在妊娠早期过程中，为了保护胚胎免受母体不利环境的侵害，子宫内 膜细胞在胚胎的周围形成了一个短暂的渗透屏障。正常情况下，极性化的上皮细胞可以调节 物质透过紧密连接而进行沿细胞侧面的转运，所以这些细胞可以作为一个渗透屏障来保护胚 胎。本实验利用原位杂交技术，研究了封闭蛋白- 3 在围着床期子宫内膜中的具体表达定位。 我们又利用人工诱导蜕膜化、假孕、延迟着床以及激素处理等各种小鼠模型，研究了封闭蛋 白3 在小鼠子宫中的表达与调节。实验结果表明，在正常妊娠过程中，封闭蛋白一3 在妊娠第 3 和4 天的子宫内膜腔上皮和腙上皮中强表达，子宫内膜基质中没有表达。另外，在妊娠第 五天围绕胚胎的腔上皮和第六天的初级蜕膜区有微弱的表达，而在妊娠第1 、2 、7 和8 天的 子宫中基本检测不到表达信号。在假孕模型中，封闭蛋白3 的表达情况与正常妊娠第l - 5 天 的表达情况基本相同，在第1 和2 天没有表达信号，第3 和4 天表达量达到最高，但在第5 天的子宫内膜腔上皮中有较弱表达，腺上皮中没有信号。在激素处理模型中，封闭蛋白- 3 在 对照组和孕酮处理组的子宫中没有表达，而在雌激素处理组和雌激素与孕酮共同处理组中表 达信号较强。在延迟与激活模型中，在围绕激活胚胎的子宫腔上皮中有较弱信号。在胚胎发 生延迟的子宫内膜中没有检测到信号。在人工诱导蜕膜化的子宫中，实验组有较弱表达，而 在对照组中没有表达。这些结果表明，封闭蛋白一3 在小鼠早期妊娠子宫内呈时期特异性表达， 并受胚胎和雌激素等因素调节，可能参与小鼠胚胎的着床过程。 关键词：封闭蛋白3 ；紧密连接；着床；蜕膜化 e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fc l a u d i n - 3i nm o u s e e n d o m e t r i u md u r i n ge a r l yp r e g n a n c y a b s t r a c t c l a u d i n - 3i so 馏o ft i g h tj u n c t i o nc o m p o n e n t s a sap r i m a r yb a r r i e r , a 咖j u n c t i o np l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei nc y t o p i a s m ad i f f u s i o nb yp a r a c e l l u l a rp a t h w a y , a n di tc a np l a ya saf e n c eb e t w e e n b a s a lr e g i o no fl a t e r a lm e m b r a n e sa n da p i c a lr e g i o nt oc o n s t i t u t ea n dm a i n t a i nt h ep o l a r i t yo f e p i t h e l i a lc e l l sa n de n d o t h e l i a lc e l l s d u r i n ge a r l yp r e g n a n c y , t h ee n d o m e t r i a lc e l l sc a nf o r ma t e m p o r a lp e r m e a b i l i t y b a r r i e ra r o u n dt h ee m b r y ot op r o t e c ti tf r o mt h em a t e r n a lh a r m f u l e n v i r o n m e n t n o r m a l l y , t h ep o l a r i z e de p i t h e l i a lc e l l sc a nr e g l | l a t et h et r a n s p o r to f f l u i d st h r o u g ht h e l a t e r a lt i g h t j u n c t i o a s 。t h u st h e s ec e l l s 啪p r o t e c tt h ee m b r y ob ya c t i n ga sap e r m e a b i l i l yb a r r i e r i n t h i ss t u d y , w eu s e di ns i r eh y b r i d i z a t i o nt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fc l a n d i n - 3i nm o a s e p e r i i m p l a n t a t i o ne m i o m e t r i n m f u r t h e r m o r e , w ee x a m i n e dt h ef a c t o r sw h i c ha f f e c tt h ee x p r e s s i o n o fc l a m i i n - 3i nm o u s ep e r i i m p i a n t a t i o ne n d o m e t r i m nb yu s i n ga r t i f i c i a ld e c i d u a l i z a t i o n , p s e u d o p r e g n a n c y , d e l a y e di m p l a n t a t i o na n do v a r i e c t o m i z e dm i c e 田幛r e s u l t ss u g g e s t e dt h a td t a n g t h en o r m a lp r e g n a n c y , t h eh i g h e s tl e v e lo fc l a u d i n - 3e x p r e s s i o no c c m r e do nd a y s3a n d , a n dt h e s i g n a ll o c a t e do nl u m i n a le p i t h e l i u ma n dg l a n d u l a re p i t h e l i m n , b u tc l a u d i n - 3e x p r e s s i o nw a sn o ti n e n d o m e t r i a ls t r o m ac e l l s aw e a ks i g n a lw a sd e t e c t e di nt h el u m i n a le p i t h e l i u ms u x r o u n d i n gt h e e m b r y o o nd a y 5 a n d i n t h e p r i m a r y d e c i d u a l i z e d z o n e o n d a y 6 o nd a y s l 。2 ，7a n d 8 0 f p r e g n a n c y , r i os i g n a l sw e r ed e t e c t e d i nt h ep s e u d o p r e g n a n tm i c e , t h ee x p r e s s i o np a t t e r no f c l a d u i n - 3w a sa l i k e n o r m a lp r e g n a n c y i nt h eo v a r i e c t o m i z e dm i c e , p r o g e s t e r o n eh a dn oe f f e c t so nc l a u d i n 一3e x p r e s s i o n , b me s t r o g e no f ac o m b i n a t i a no f e s l r o g e na n dp r o g e s t e r o n eu p - r e g u l a t e dc l a u d i n - 3e x p r e s s i o n i n t h eu t e r u su n d e rd e l a y e di m p l a n t a t i o n , n os i g n a lw a sd e t e c t e d a f t e rd e l a y e di m p l a n t a t i o nw a s a c t i v a t e db ye s t r o g e n , c l a u d i n - 3e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nl u m i n a le p i t h e l i u ms m r o u n d i n gt h e e m b r y o i nc o n c l u s i o n , o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tc l a u d i n - 3h a das t a g e - s p e c i a le x p r e s s i o np a t t e r n i nm o a s ep e r i - i m p l a n t m i o ne n d o m e t r i u ma n dw a sr e g u l a t e db ye m b r y o sa n de s t r o g e n c l a d u i n - 3 m a yb ec l o s e l yr e l a t e dt oe m b r y oi m p l a n t a t i o na n dd e c i d a a l i z a t i o n 。 k e yw o r d s ：c a i a u d i n - 3 ；啊g i n j m c i i o l l ；i m p l a n t a t i o n ；d e c i d u a l i z a t i o n p o s t g r a d u a t e ：h a nb i n g c h e n m a j o r ：d e v e l o p m e l l t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ry a n gz e i l g l i l i i l g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 挂；翅遣直基熊置噩挂型虚塑竣：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：百龟曙吼峄6 月功日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全都或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：互移而再 导师签名：勿拐馏 日期：昨钼2 徊 0 e i 期：如7 年胁日 1 前言 封闭蛋白3 ( c l a u d i n - 3 ) 是紧密连接的组分之一。对于上皮细胞和内皮细胞的生理功能 来说，紧密连接是一个必要的结构，能起到一个渗透屏障的作用。在妊娠早期过程中，为了 保护胚胎免受母体不利环境的侵害，子宫内膜细胞在胚胎的周围形成一个短暂的渗透屏障。 1 1 胚胎着床与子宫内膜蜕膜化 胚胎着床是一个复杂的过程，涉及到胚胎和子宫问的紧密相互作用。胚胎发育到胚泡阶 段的同时，子宫分化到可接受性阶段对于胚胎着床来说是非常重要的。在小鼠中，胚泡的着 床大约发生在妊娠第四天的午夜，此时胚泡分化出了滋养层和内细胞团。在着床过程以及随 后的胎盘形成过程中，主要是依靠滋养外胚层与子宫间的相互作用来实现的。在着床过程中， 有许多因素参与，如类固醇类激素、生长因子、细胞因子以及转录因子等。 在胚胎着床过程中，子宫状态可分为三个阶段：前接受态期( p r e - r e e e p t i v e ) 、接受态期 ( r e e p t i v e ) 和非接受态期( n o n - r e c e p t i v e ) 或不应期( r e l y t o r y ) ( p a r i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。确保子 宫内膜接受性的主要因素是卵巢类固醇激素一雌激素( e 2 ) 和( 或) 孕酮( p 4 ) 。这些激 素主要通过它们的核内受体一雌激素受体( e r ) 和孕酮受体( p r ) 而起作用。在成年小鼠 中，e 2 能引起上皮细胞的增殖，如果e 2 和p 4 共同起作用能引起基质细胞的增殖。在小鼠正常 妊娠过程中，在妊娠第一天e 2 能刺激子宫上皮细胞的增殖。在妊娠第二天，如果移除e 2 ，子 宫内膜上皮细胞会发生大量的凋亡。在妊娠第三天，新的黄体形成，p 4 得到大量的积累，引 起子宫基质细胞的增殖。而在着床之前的妊娠第四天e 2 的分泌进一步刺激了子宫基质的增殖 和分化，使得子宫对于胚胎着床处于可接收状态( h u e t - h u d s o ne ta l ，1 9 8 9 ) 。除了雌激素和孕 酮之外，还有很多分子在着床过程中起重要作用，如c o x - 2 、l i f i l - l l 等( l e ea n dd e m a y oe t a l , 2 0 0 4 ) 。 在哺乳动物的胚胎着床过程中，胚胎和子宫在形态和生化方面均发生了大量的变化。胚 胎必须发育到胚泡阶段，然后孵化并黏附到子宫腔上皮中。子宫必须进行分化以便自身变得 具可接受性，使得胚胎能黏附并发生着床。随后，在着床胚胎和子宫内膜之间发生“对话”， 胚胎才真正黏附到腔上皮上并在子宫中着床。子宫中的这些变化均受卵巢类同醇激素的调 节。基质中的成纤维细胞发生广泛的增殖，随后分化，这个过程称之为蜕膜化( f o u l a d in a s h t a e ta l ，2 0 0 4 ) 。子宫内膜的蜕膜化过程对于成功的着床和妊娠的维持是必需的。蜕膜化过程涉 及到子宫内膜基质细胞的分化和细胞外基质的重建。另外，子宫中的白细胞在数量和分布上 也有一个较大的变化蜕膜化的基质细胞在其形态上，从成纤维细胞变成较大的多核细胞 ( m o r t i c ee ta l ，2 0 0 1 ) 。 除在正常妊娠过程中发生蜕膜化过程以外，在啮齿类动物中，子宫内注射芝麻油、玻璃 珠以及对子宫的划伤等人工刺激也能使子宫发生蜕膜化( s h i m i z ue ta l ，2 0 0 5 ) 。正常妊娠蜕膜和 人工诱导的蜕膜在形态上有定的差异，但这种差异是非常细微的( b a n ye ta l 。2 0 0 6 ) 。在基因 表达方面，这两种蜕膜也是基本相同的。如可调节心脏发育的基因h a n d 2 和催乳素样蛋白j ( p l p - j ) 在这两种蜕膜中均有表达( t o i l e t a l ，1 9 9 9 ) 。然而，有些基因在这两种蜕膜组织中的 表达水平是不同的。如c a r l o n e 等研究发现的成纤维细胞生长因子2 ( f g f 2 ) 和干扰素d 诱导 蛋白( g 1 p 2 ，又称为1 s 0 1 5 ) 。f g f 2 在大鼠妊娠第六天的蜕膜细胞中表达，而在人工诱导的 蜕膜组织中却检测不到它的信号。在小鼠中，g i p 2m r n a 在正常妊娠子宫系膜对侧的蜕膜组 织中表达，而在诱导的蜕膜组织中的表达量比正常妊娠蜕膜差不多低十p 啬( a u s t i ne ta l ，2 0 0 3 ) 。 这两个分子在不同蜕膜中的差异表达暗示，有些基因在子宫蜕膜中的表达是受胚胎诱导的。 子宫内膜的蜕膜组织有其特殊的形态学特征。在人中，基质细胞的蜕膜化转化发生在月 经周期的2 3 天左右。这个过程开始于子宫内膜表层的螺旋小动脉和毛细血管，并在表面上皮 下面扩展( c h r i s t i a ne ta 1 2 0 0 d 。在超微结构水平上，基质的分化特征是渐进性的细胞增大、 细胞核的变圆、核仁数量和复杂性的增加、分泌部分的扩张并伴随其中的粗面内质网和高尔 基体复合体的膨胀，以及细胞质中塘原和脂滴的积累。多种细胞质突起在前蜕膜细胞的表面 出现，并穿过包绕的基层。这些突起自由地扩展到细胞外基质或者使邻近细胞的细胞质成锯 齿状。在基质细胞中有紧密连接，但不具有真正的桥粒。而且，在相同细胞的发展进程中可 能形成间隙连接。并且，蜕膜细胞有一个开放的囊状细胞核，如用h e 染色，会看到一个灰白 色的细胞质。因此，仅从组织学上就可鉴别蜕膜细胞涨i n g 2 0 0 0 ) 。在蜕膜化过程中，螺旋动 脉也发生转化。在增值期的动脉壁比较薄，随后在分泌期会变得越来越弯曲。并在其周围有 一个由肌动蛋白阳性细胞组成的较厚边缘，这种变化会持续到蜕膜早期( k a me t a l ，1 9 9 9 ) 。 一般认为，蜕膜化只发生在侵入性着床的物种中，而在非侵入性着床的物种中，如家畜 中，不发生蜕膜化( f a z l e a b a s e ta l 。1 9 9 7 ) 。8 但j o h n s o n 等的实验结果表明，在绵羊妊娠子宫的基 质部分有骨桥蛋白( o s t e o p o n t i r l o p n ) 的表达，丽此分子是子宫内膜基质细胞发生蜕膜化的 标志性分子。在绵羊子宫的基质中也发生了类似侵入性着床物种中发生的蜕膜化现象。因此， 子宫基质细胞的蜕膜化在具有不同胎盘形成类型的物种中是普遍的，只不过发生的程度不同 并且与着床过程中滋养层侵入的深度有关o o h n s a ne ta l ，2 0 0 3 ) 。 在小鼠中，胚泡在子宫腔上皮上的黏附发生在第四天晚上。随着着床过程的进行，位于 系膜对侧胚泡黏附位点的腔上皮逐步发生凋亡。相反，紧紧围绕着床胚泡的基质细胞进入广 泛的增殖，随后分化成一种特殊的细胞类型，同时获得了多倍性。在第五天下午和第六天早 晨，系膜对侧紧紧围绕着床胚泡的基质细胞停止增殖并进行分化，形成初级蜕膜区。初级蜕 膜区没有血管，呈上皮样细胞。初级蜕膜区的细胞随后发生掏亡，到第八天之前这种细胞基 本消失。然而，邻近初级蜕膜区的基质细胞继续增殖并分化成多倍性的蜕膜细胞，形成次级 蜕膜区。这种方式在第七和第八天一直持续进行。最后，次级蜕膜区细胞也发生凋亡，使着 床位点的腔隙增大以便容纳生长的胚胎( t a n e t a l ，2 0 0 4 ) 。与其他物种不同的是，在人类中， 不需要胚泡的黏附刺激来诱导发生蜕膜化。人的蜕膜化早在黄体期就已经开始，如果妊娠过 程建立，这个过程就持续下去( f i n ne ta l , 1 9 9 8 ) 。 在小鼠妊娠第五天上午，着床胚泡周围处于增殖期的基质细胞大量表达细胞周期蛋白 d 3 ，当第五天下午初级蜕膜区的细胞增殖停止后，细胞周期蛋白d 3 的表达量降低，而同一区 域中1 2 1 的表达量却增高。这个结果表明，t ) 2 1 参与指导细胞周期蛋白d 3 在蜕膜化过程起始时 在基质细胞增殖和分化中的作用。在第六天和第七天停止增殖的初级蜕膜区中。细胞周期蛋 2 白d 3 和p 2 1 都没有表达。而在次级蜕膜区，它们又有较强的表达，而且定位在同一区域。次 级蜕膜区由具多倍性的增殖细胞和分化细胞组成( 1 l 彻e ta l ，2 0 0 2 ) 。并且，在具多倍性的蜕膜 细胞中。d 3 和p 2 1 的表达与g 2 m 期的阻止和多倍性的增加有关这表明这两个分子在细胞的 多倍性发生过程中有重要作用。 。 对于启动蜕膜化的分子机制了解得还很少。不过已有的结果表明，子宫内膜基质细胞分 化成多倍性的细胞在蜕膜化的启动过程中起重要作用( g a h m a ne t a l ，2 0 0 6 ) 。在啮齿类动物中， 系膜对侧蜕膜细胞的发育伴随着多倍性的获得，这也是蜕膜化过程中一个独一无二的特征。 在小鼠妊娠第六天和第七天的次级蜕膜区中。大约有3 5 的细胞发生多倍性。当基质细胞的 多倍性减少时，蜕膜化过程受到抑制周期蛋白d 3 、p 2 1 、c d k 6 以及h b e g f 等分子参与了 基质细胞的多倍化过程( t a n e ta l ，2 0 0 2 ) 。 t a n 等的研究结果表明，l i b e g f 也参与蜕膜细胞的多倍性过程。f i b e g f 能增加基质 细胞的d n a 合成量，但细胞数量并不发生变化。h b - e g f 还能增加双核细胞的数量，而细 胞的双核化可以作为小鼠子宫基质细胞中多倍性发生的标志。h b - e g f 的这种作用是通过对 周期蛋白d 3 的上调来介导的。抑制周期蛋白d 3 后，将导致h b - e g f 对基质细胞多倍性的 诱导作用受阻( t a ne ta l ，2 0 0 4 ) 。 尽管在不同的物种中，蜕膜化的程度跟滋养层的侵入程度有关，但蜕膜的特定功能并不 清楚。一个可能就是蜕膜通过控制滋养层侵入到母体动脉中的程度来行使功能( o s t c c ne ta t , 1 9 9 8 ) 。如果这个侵入过程能正确发生，就会导致血管的电导率增加，使母体不会因为胚胎侵 入得太深而招致损害，胎儿会获得充分的营养。因此，准确的侵入程度使胎儿一胎盘的需求和 母体的完整性都得到满足。如果没有蜕膜的存在，滋养层就会不用首先越过蜕膜而直接侵入 到子宫肌层中。这样，侵入过程就不会放限制在肌层的内j 侧，将会导致肌肉组织的破坏和子 宫的破裂等。因此，蜕膜最重要的作用可能是作为一个屏障，使母体免受由胎儿的过渡侵入 所带来的损害。 另外，b e l l 等研究发现。蜕膜化反应是在血管周围启动，随后扩展到黄体晚期的基质细 胞中以及妊娠子宫内膜中。由于蜕膜化与血管有关，可能蜕膜细胞在募集白细胞和止血方面 起关键作用。蜕膜还可作为一个免疫屏障，使胎儿免受母体的排斥此外，蜕膜还与胎盘的 形成有关e 1 1e ta l ，1 9 9 0 ) 。 到目前为止，己证实有多种分子参与子宫内膜的蜕膜化过程中，包括细胞因子类、信号 转导分子、垂体激素、转录因子、免疫细胞等。 早期的研究发现胎盘蛋白( p p l 2 ) 是分泌期子宫内膜和早期蜕膜的分泌产物，现在鉴定 出p p l 2 是胰岛素样生长因子结合蛋白1 ( 1 0 f b p - 1 ) 。羊膜液体中，i g f b p - i 的浓度在妊娠 的第二个三个月达到峰值，达到峰值后在妊娠第1 5 周左右的血清中仍有较高的浓度。i g f b p - ! 主要分布在肝脏和子宫内膜中，但在这两个位点是由不同的启动子控制的。i g f b p - 1 的浓度 在蜕膜基质细胞中尤其高，是蜕膜化过程的标志分子之一( d t me ta l , 2 0 0 3 ) 。这个蛋白的确 切功能还不确定，它可能通过i g f 1 ( 被雌激素上调) 来调节潜在的生长诱导。 激活索( a c t i v i n ) p a 和d b 两个亚单位在子宫内膜中的主要来源是腔上皮和腺上皮细胞， 在蜕膜化起始时，这两个亚单位在蜕膜基质细胞中强烈上调( j o n e se ta l , 2 0 0 0 ) 。这表明 a c t i v i n 可能在蜕膜过程中起重要作用。迸一步的研究发现，a i i “、a c t r i i 和a c t r i i b 等a c t i v i n 3 的受体在蜕膜基质细胞中也强烈表达( j o n e so ta l ，2 0 0 2 ) 。在蜕膜化过程中，s m a d s 2 、4 、5 和 8 保持在一个恒定的水平，s m a d s l ( a m ps m a d ) 和s m a d s 6 ( 抑制性s m a d ) 表达量下调，而 s m a d s 3 的表达量上调。这些数据表明，a c t i v i a 信号通路中的所有成分都出现在子宫内膜细胞 中，并维持到蜕膜化过程中。另外，a c t i v i n a 能显著刺激m m p - 2 在蜕膜细胞中的表达( j o n e s e ta l ，2 0 0 6 ) 。已证实，m m p s 在蜕膜化过程中起重要作用。在大鼠的早期妊娠中，如果m m p 的活性得到抑制，蜕膜形成则会被严重损害( g h t m a a 武吐1 9 9 9 ) 。这表明，a c t i v i n 可能通过 m m p 在蜕膜化过程中起作用。 催乳素是子宫内膜基质细胞蜕膜化的标志性分子。在人子宫内膜的蜕膜化过程中，催乳 素是子宫内膜合成和分泌的一个主要蛋白质。在分泌中期和月经期之间，可检测到催乳素的 合成，这与蜕膜化过程中第一次组织形态变化相一致。在妊娠过程中，着床发生之后，蜕膜 催乳素的分泌稳定地增加。由蜕膜细胞从头合成的催乳紊，与垂体催乳素相比，无论在化学 上，还是在免疫学和生物学上，都没有太大的区别。催乳素在人子宫内膜中时间和空间上的 表达，表明它在着床和随后的蜕膜化以及胎盘形成中具有一定的作用( j a b b o u te ta l ，2 0 0 1 ) 。 另外，由人蜕膜产生的催乳素释放肽不会影响蜕膜催乳素的分泌( y a s u ie ta l 2 0 0 1 ) 。关于蜕 膜催乳素分泌的调节机制仍不清楚。 实验表明，n k 细胞从l h + 3 期开始数目增加，在蜕膜化开始发生之前就已经出现，并一 直持续到月经前几天。如果妊娠发生，n k 细胞在壁蜕膜中保持一个较大的数目，并在底蜕膜 ( 滋养层侵入的地方) 中尤其充足。典型的子宫n l 潮胞是一个较大的淋巴细胞，有一个肾形 的细胞核，并有明显的细胞质颗粒。这种结构特征在分泌中期和后期的子宫内膜和蜕膜中非 常明显，而在增殖期则不明显。尤为突出的是，n k 细胞在动脉和腺体周围环绕。在分泌晚期， 有非常多的n k 细胞非常密集地散布在基质周围，并且在基质问室中占到大约3 0 - 4 0 的细胞 数目。异位蜕膜中，以具有c d 5 6 + n k 细胞为特征。相反，n k 细胞在异位妊娠的非蜕膜化子 宫壁中不存在，甚至在滋养层侵润的位点也不存在。相同的现象在小鼠中也有，当把滋养层 转移到异位位点，如肾脏中，不会引起颗粒子宫腺细胞的募集，这些细胞仅仅与蜕膜相关 ( s o l , i se ta l , 1 9 9 6 ) 。在人工诱导蜕膜化的子宫内膜中，也观察到持续的c d 5 6 + n k 细胞侵润 ( c r i t e h l e yo ta l , 1 9 9 8 ) 。 s t a t t u n i n 是一个可溶性磷蛋白，在细胞周期过程中调节微管的动态平街( y o s h i eo ta l , 2 0 0 6 ) 。在胚胎着床发生时和子宫内膜发生蜕膜化的大鼠妊娠子宫中，s t a f l u n i n 的表达量上调。 在油诱导的蜕膜中，s t a t h m i n 的表达量也上调( t a m r a o t a l ，2 0 0 3 ) 。在小鼠妊娠第七天子宫的 次级蜕膜细胞中，s t a t h m i n 有较强的表达，但在初级蜕膜细胞中没有表达。与未注油的子宫 相比，s t a t h m i n 在注油诱导的蜕膜化子宫中的表达量较高。然而，s t a t h m i n 缺失的小鼠并未显 示出着床和蜕膜化的缺陷，仅仅是新生幼仔的数量较之野生型相比减少，而且碱性磷酸酶、 结蛋白( d e s m i n ) 和细胞周期蛋白i ) 3 这三个蜕膜化的标志性分子的表达量在s t a t h m i n 缺失 的小鼠中下降。进一步的研究发现，在s t a t h m i n 缺失的小鼠中，s t a t h m i n 家族的其他成员 ( s c g l 0 、r b 3 和s c l i p ) 的表达量都比较高，甚至比野生型小鼠中的表达量还高( y o s h i ed a l 2 0 0 6 ) 这可能暗示在稚l l h m i n 缺失的小鼠中，s c g l 0 、r b 3 和s c l i p 等分子弥补了s t a t h m n 的缺失。在人子宫内膜中，s t a t h m i n 在腺上皮和基质细胞中表达，但在蜕膜组织中没有表达 4 s t a t h m i n 在蜕膜前持续表达而在蜕膜发生时表达下调的特殊表达方式，可能会促进基质细胞 的分化( t a m u r ae ta t , 2 0 0 6 ) 。对b 妇t h l l l i n 进行r n a 干扰后，能明显抑制蜕膜化，也降低了蜕 膜化的两个标志性分子i g f b p - 1 和p r l 的表达。因此。s t a f l u n i n 在蜕膜化过程中具有重要作 用( t a m u r ae ta 1 2 0 0 6 ) 。 子宫内膜的蜕膜化过程对于妊娠的建立和维持至关重要在子宫内膜的蜕膜化过程中， 每一个分子都不是孤立的，而是多个分子相互关联在一起。如c a m p 通过信号分子对它的激 活生成作为胞内第二信使，然后活化蛋白激酶a 。活化的蛋白激酶a 再进一步磷酸化其底物蛋 白而介导下游信号通路。h o x a l 0 与p g e 2 受体以及a c t i v i na 与m m p - 2 协同作用在蜕膜化过程 中发挥作用；s t a t h m i n 可调节蜕膜化的几个标志性分子如i g f b p - i 、p r l 等在蜕膜中的表达而 起作用。此外，已发现与蜕膜化相关的分子以及在蜕膜化过程中起调节作用的分子远不止上 述提及的这些，磷脂酶d i 、白血病抑制因子、环氧合酶2 ( c o x - 2 ) 等基因均参与蜕膜化过 程。但这些与蜕膜化相关的分子之间有何联系，以及这些分子在蜕膜化过程中的信号转导通 路等仍不清楚。 1 2 紧密连接 紧密连接( t i g h t j u n c t i o n ，t j ) 位于连接复合体的最顶端。电镜下，紧密连接将相邻细胞两层 质膜紧紧靠在一起，是一种细胞一细胞膜在空闯上的连接，之间无空隙，发挥着屏障的作用。紧 密连接主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成，细胞骨架( 主要是微丝) 也是组成紧密 连接的重要组成部分。 1 2 1 紧密连接的组成成分 封闭蛋白、o c c l u d i n s 和连接粘附分子( j u n c t i o n a d h e r e n c em o l e c u l a r , j a m ) 组成紧密连接 的跨膜结构。跨膜蛋白的细胞内部分与胞质附着蛋白相连，细胞外的部分与相邻细胞的跨膜连 接蛋白相互作用1 9 9 3 年。f u r u s e 等分离出第一个紧密连接跨膜蛋白，称为o c c l u d i n 。序列分 析发现，o c c l u d i n 是个分子量为6 0 k d 的蛋白质，其氨基端和c 端均位于细胞内，细胞外都分跨 膜4 次，形成两个环状结构，每个环1 1 4 5 个氨基酸构成。第一个环状结构主要由甘氨酸和酪氨酸 组成。是细胞间形成紧密连接的主要部位( f u r u s ee ta l 。1 9 9 3 ) 。1 9 9 8 年f u r u s e 等又发现了两个 新的完整的紧密连接跨膜分子：封闭蛋白l 、封闭蛋白2 。封闭蛋白是一个多基因家族，至今 已发现超过2 4 个成员。封闭蛋白是小分子跨膜蛋白，分子量大约2 0 2 2 k d , 跨膜4 次。以二聚体 的形式存在。封闭蛋白在成纤维细胞上异位表达也能诱导类紧密连接结构，说明封闭蛋白参与 了紧密连接的形成，但与紧密连接的器官特异性无关( f u r u s ee t a l ，1 9 9 8 ) 。在哺乳动物内皮细胞 内，只有封闭蛋白l 和封闭蛋白5 存在，其中封闭蛋白5 主要存在于血管内皮细胞。特别是脑毛细 血管内皮细胞。封闭蛋白和o c c l u d i n s 形成了紧密连接的细胞外成分，在冰冻切片上可见封闭蛋 白与o c c l u d i n s 汇成杂聚物，形成膜内链，因此推测这些链包含水通道，它允许离子和亲水分子选 择性扩散( m a t t e ra n dn a l d a , 2 0 0 3 ) 。1 9 9 8 年m a r t i n - p a d u r a 等发现了另一个跨膜蛋白一连接粘附分 子o a m ) , 属于免疫球蛋白家族成员，包含j a m l 、j a m 7 、j a m 3 和e s a m 。j a m l 分子量大约 5 4 0 k d ，只有一个跨膜区域，其细胞外区域有2 个免疫球蛋白样环状结构组成。j a m i 可连接z 0 1 、 c i n g u l i n 、a f 6 和m u p p l 。j a m l 能增加细胞间距离，使紧密连接不能形成( m a r t i ne t a t , 1 9 9 8 ) 。 紧密连接的另外一个组分z o 属于胞质附着蛋白，z o 有3 个限制性区域：1 个s i - 1 3 区、i - 个g u k 区3 个p d z 区( p d z i 、p d z 2 、p d z 3 ) 这些区域对信号转导和锚定跨膜蛋白到细胞骨架非常 重要。并且在细胞质的蛋白质组装中起主导作用。p d z 区介导特异性结合到跨膜蛋白的c 2 端胞浆尾侧。p d z 区连到封闭蛋白，g u k 区连到o c c l u d i n 。7 _ , 0 2 1 、z 0 2 2 和z 0 2 3 的分子量依 次为2 2 0 、1 6 0 年：f 1 1 3 0k d 。z 0 2 1 、z 0 2 2 和z 0 2 3 的p d z 区与封闭蛋白的c 2 端直接相连。z 0 2 1 、 z 0 2 2 和7 - , 0 2 3 的谷氨酸激酶区与o c c l u d i n 的c 2 端相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一 起，并能识别紧密连接的位置及传递各类信号( i t , o h e ta l ，1 9 9 9 ) 1 2 2 紧密连接的调节 紧密连接不仅仅是被动结构，而且是动态的功能性实体。它能被许多信号机制调节，包括 酪氨酸激酶、蛋白激酶c ( p k c ) 、c a 2 + 、异源三聚体g 蛋白、钙调节蛋白、c a m p 、脂类第二 信使和磷脂酶c 。这些信号不仅可以控制紧密连接的组装和分解，还与肌动蛋白的改变相关联 ( h u b e r e t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 封闭蛋白3 的生物学特性 最初的封闭蛋白1 和封闭蛋白2 是从鸡的肝脏中分离出来的，分子量大约为2 3 k d ，其分 子链上有四个跨膜螺旋，两个短的胞外环，另外在胞质侧分别有一个短的n - 末端和一个短的 d 末端。尽管它们在拓扑学结构上与o c c l u d i n ( 紧密连接蛋白组分之一) 有相似之处，但它们 在氨基酸序列组成上并没有同源性( f u r u s ena l ，1 9 9 8 ) 。到目前为止，此家族己发现了2 4 个 成员( m o r i n , 2 0 0 5 ) 。这些成员在不同的组织中有明显不同的m r n a 表达方式，这可能暗示它 们在不同的上皮和内皮中具有不同的功能，但它们都是紧密连接的组成成分( m o r i t ae ta t , 1 9 9 9 ) 。紧密连接由三种主要的膜整合蛋白组成，包括o c c l u d i n 封闭蛋白和连接黏附分子。尽 管这些蛋白的确切作用还不是完全清楚，但己知的是，封闭蛋白形成了紧密连接链的骨架结 构。 在脊椎动物中，紧密连接在细胞间的封闭中具有重要作用，如在上皮细胞和内皮细胞的 胞间封闭中( g m n b i n e r , 1 9 9 3 ) 。对于上皮细胞和内应细胞的生理功能来说。紧密连接是一个 必要的结构，因为它兼具屏障和围栏作用。紧密连接对于溶质通过细胞侧面的扩散形成了一 个初级屏障，并且紧密连接在基底外膜侧和顶端之间起到了一个围栏的作用。来建立和维持 上皮细胞和内皮细胞的极性( t s u k i t a a n d f r o u s e , 1 9 9 8 ) 。紧密连接在内皮细胞中被认为用来 确定血管的渗透性。封闭蛋白5 在内皮细胞中有广泛的表达，电镜结果表明它是紧密连接的 组成蛋白之一，并且它的表达仅仅局限于内皮细胞，而在上皮细胞中则检测不到任何表达信 6 号这些结果表明封闭蛋白5 是内皮细胞特异的紧密连接组分，并在血管通透性方面起作用 ( m o r i t a c t a l , 1 9 9 9 ) 。紧密连接、黏附连接和桥粒一起构成了上皮细胞和内皮细胞顶端连接复 合体。薪附连接和桥粒负责相邻细胞的机械黏附，而紧密连接负责细胞间的紧密缝合，这样 就可以控制沿细胞侧面的离子流，因此保持组织的稳态( t s u l d t a e ta l ，2 0 0 1 ) 。另外，紧密连接 蛋白还能募集信号蛋i 刍( m i t i ca n d a n d e r s t , 1 9 9 8 ) ，紧密连接还被认为参与到细胞增殖，分化 和其他细胞功能的调节过程中( m q l j np j ，2 0 0 5 ) 。 鉴于紧密连接参与到多种生物学过程中，而封闭蛋白- 3 蛋白又是紧密连接的组成成分之 一，因此我们推铡，封闭蛋白3 作为紧密连接的组成成分之一，可能参与多种生物学过程， 特别是在形成渗透屏障中起一定的作用。 1 4 封闭蛋白- 3 在雌性生殖系统中的表达 在大鼠的发情周期中，子宫内膜上皮细胞发生明显的结构变化。通过卵巢激素来保持子 宫适当的内环境对于受精以及随后的发育过程是非常重要的。子宫腔上皮细胞通过紧密连接 相关联在一起，可以调节离子和分子通过细胞侧面而进行的转运。研究结果表明，在发情前 期，封闭蛋白1 和封闭蛋白5 定位在紧密连接中，封闭蛋白- 3 和封闭蛋白7 在基底外侧分布， 在发情后期，在紧密连接区域没有这些蛋白的表达。在发情期和发倩间期，从基底外侧膜的 最底部到最顶部的表达是不同的。这些结果表明，在发情周期的不同阶段，紧密连接蛋白在 子宫腔上皮细胞中的表达是变化的，也表明紧密连接蛋白的表达为成功的受精提供一个适当 的环境( m e n d o z a r o d r i g u e ze ta l ，2 0 0 5 ) 。封闭蛋白一1 在大鼠妊娠第l 、3 和6 天子宫腔上皮 细胞质膜侧面顶端有较强的分布，在整个细胞质区域也有弥散性分布。可能在妊娠早期子宫 上皮细胞的动态紧密连接两络中起重要作用( o r c h a r da n dm u r p h y , 2 0 0 2 ) 1 5 封闭蛋白3 的调节 紧密连接蛋白的表达受到多种因素的调节，进而在多种生理过程中起作用。在患有慢性 代谢酸毒症的大鼠十二指肠中，封闭蛋白- 3 m r n a 的表达量明显升高。并且在馒性代谢酸毒 症中封闭蛋白3 的蛋自在细胞旁侧的细胞膜中表达量增强，尤其是在接近顶端的区域 ( c h a r o e n p h a n d h ue ta l ，2 0 0 7 ) 。这个结果表明，慢性代谢酸毒症能显著改变封闭蛋白- 3 等紧密 连接蛋白的表达方式。s n a i l 和相关的家族成员在物种问有高度的保守性，是胚胎发生的早期 所必需的c m ae ta 1 2 0 0 6 ) 。s n a r l 家族通过d n a 的e 盒成分来调节上皮，问质的转化，产生转 录抑制作用。通过抑制e 盒成分转染鼠或人的s n a i l 基因后，小鼠的封闭蛋白3 、4 ，7 基因 表达沉默( o h k u b oa n do z a w a , 2 0 0 3 ) 。封闭蛋白对细胞连接处选择渗透性的调节主要通过蛋 白激酶途径实现，蛋白激酶a ( p k a ) 或蛋白激酶c ( p k c ) 作用于封闭蛋白上特定氨基酸靶点， 一般以丝氨酸、苏氨酸为主。封闭蛋白磷酸化后，紧密连接功能下降，表现为氯化物渗透性 增加。可能原因是磷酸化的封闭蛋白干扰紧密连接的形成( g oe t a l ，2 0 0 4 ) 。不同蛋白激酶作用 于不同的封闭蛋白分子。在研究卵巢癌中封闭蛋白的调节机制时发现，当p k a 和p k c 激活后， 7 它们作用在不同的靶蛋白：p k a 作用于封闭蛋白一3 上c 2 末端第1 9 2 位氨基酸，而p k c 使封 闭蛋白4 磷酸化( w o l b u r ge t a l2 0 0 3 ) 。 1 6 封闭蛋白3 与肿瘤 在一些癌症中，组成紧密连接的两种主要跨膜蛋白o c c l u d i n 和封闭蛋白的表达发生了改 变。早期的研究表明，o c c l u d i n 在胃肠肿瘤中经常下调( k i m a e ta t , 1 9 9 7 ) 。同样，其他的研 究表明，在各种癌症中封闭蛋白的表达也是下调的。例如，封闭蛋白1 在乳腺癌中的表达量 减少( k r a m e re la 1 2 0 0 0 ；t o k e se t a l ，2 0 0 5 ) ，在结肠癌中也是如此( r o s n i c ke t a l 2 0 0 5 ) 。封 闭蛋白7 也发现在乳腺侵润性癌和颈癌中的表达量下调( k o m i m k ye ta l ，2 0 0 3 ；a im o u s f a f ae t a l , 2 0 0 2 ) 。这些在癌细胞中发生的紧密连接蛋白表达量的下降伴随紧密连接在肿瘤中发生破 裂，后者在癌细胞的丧失聚合力、侵袭力以及去分化等过程中起重要作用。除了蛋白水平的 表达量