南京大学生化分析实验讲义.doc

生化分析实验讲义罗喜牛编2007学年下半学期2007.9.8一2008.1.8同学上课所用讲义实 验 一紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线1、实验目的与要求： （1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。 （2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。 （3）、了解和掌握蛋白质的定性原理。2、实验原理： 蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够产生及n类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280 nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。3、实验仪器与器材：3-1、实验仪器：（略）3-2、实验器材：（略）4、试剂及配制：4-1、 牛血清白蛋白标准溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：准确称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度为1.0 毫克/毫升的溶液。4-2、 测试的蛋白质样品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：准确称取测试蛋白质样品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度为1.0 毫克/毫升的溶液。5、操作步骤：5-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定：采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白标准品或测试样品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水为空白溶液，调仪器零点（具体方法详见仪器操作说明书）。标准品或测试样品溶液在250300 nm波长的范围内，以每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值。在每次更换测定波长时均需要重新调节仪器“零点”后，方能测定。对测定波长的范围和间隔大小，可根据不同样品的实际情况和要求加以确定（加大或缩小间隔）。5-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作： 以测定的波长为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标对应作图。然后分别将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中最大吸收峰值所对应的波长即为蛋白质最大吸收波长。6、实验结果：（1）、牛血清白蛋白标准品或测试品溶液在不同波长测定吸光值结果表1。牛血清白蛋白样品溶液在250300 nm各波长吸光值结果表波长（nm）250.0255.0260.0265.0270.0275.0275.0吸光度(A)波长（nm）277.5280.0282.5285.0290.0295.0300.0吸光度(A)（2）、牛血清白蛋白的紫外吸收光谱曲线的制作友情提醒我之见：（1）、需要强调的是：紫外、可见分光光度法测定样品时都需要用一个“空白管”，它主要是用于仪器校“零点”用。空白管一般又习惯称“零管”和“对照管”。（2）、能作为“零管”溶液的条件？一般要求是：被测定的溶质的溶剂作为零管溶液，但是如果实验本身要求不高或所用溶剂与蒸馏水在某一特定的波长吸光度差异很小（已比较过），也可以直接用蒸馏水甚至自来水代替。（3）、在特征吸收峰附近波长间隔尽量要小，否则会错过真正的特征吸收峰值。特征吸收峰通常又称最大吸收峰，如蛋白质、核酸分别在280nm和260nm时的吸收值最大。（4）、在吸收光谱曲线及含量的测定中，要达到结果的准确性，除了自身的操作水平外，还要保证分光光度计的波长精度(除校正外，还有厂质，所以要写仪器型号，厂名)，以及有关测定样品的溶剂，pH,离子强度，温度以及其他相关条件的一致性,否则会给实验结果带来差异，既不一致性。（5）、一般需要精确定量测定，均需用定量瓶（或称容量瓶）及校准过的量器配制溶液。 实 验 二荧光光度法测定核黄素含量 1、实验目的和要求：（1）、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。（2）、学习荧光光度计的操作和使用。（3）、掌握荧光定量分析的工作曲线。2、实验原理： 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的而氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：核黄素二氢核黄素 核黄素的激发光波长范围约为440 500nm(一般规定为440nm),发射光波长范围约为510550nm(一般规定为520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，由还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。3、实验仪器与器材： 3-1、实验仪器：（略） 3-2、实验器材：（略）4、试剂与配制：4-1、试剂： （1）、连二亚硫酸钠（保险粉） （2）、核黄素 （3）、冰醋酸4-2、试剂配制： （1）、连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠： 直接用固体。（2）、36%醋酸溶液的配制： 取冰醋酸36.0毫升,用蒸馏水稀释至100.0毫升，混匀即可。 （3）、核黄素标准品溶液的配制： 准确称取核黄素10.0毫克，放入预先装有少量蒸馏水（50ml）的1000.0毫升容量瓶中，加入5.0毫升36%醋酸溶液，再加约 800.0毫升蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水再定容至1000.0毫升，混匀后，即为：10.0ug/ml浓度，再按表1稀释成六种不同浓度的标准溶液。（4）、核黄素测试品溶液的配制：将被测试的核黄素样品参照表1标准品溶液的含量范围和溶剂体系配成测定溶液。对于食物和生物材料中的核黄素测定，一般需要事先经过抽提，或分离、纯化处理后，方可用此方法进行含量测定。表1、核黄素标准品及测试品溶液的配制表步 骤 / 管 号 0 1 2 3 4 5样品标 准 品 母 液（ml）2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.25蒸 馏 水（ml）7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 9.75总 体 积（ml）10.010.0 10.0 10.0 10.0 10.0核黄素 含量（ug/ml）2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.255、操作步骤： 5-1、荧光测定： (1)、选用滤色片： 参照附录中荧光光度计的使用说明，选用滤色片。核黄素荧光测定的激发光波长为455nm，射波长为523nm。因此可选用带普通型400nm（兰字）滤色片，选用截止型510nm滤色片为发射光滤色片，同时启动仪器进行预热20分钟。（2）、调仪器满刻度：待仪器预热后，用2.5ug/ml（含量最高的）的溶液调荧光光度计相对荧光强度，既调到满刻度读数为“100%”，反复多次，直至数据稳定为止。调好的满刻度，在整个实验结束之前，不可随意重新调满刻度。（3）、核黄素标准品和测试样品的荧光强度测定：A、未还原时核黄素标准品和测试品溶液荧光强度的测定( F1 )：调好满刻度之后，按表1所配制的标准品和测试品溶液的浓度分别依次从高到低测定各自浓度溶液的荧光强度，同时记录各自的读数于表2中。需要特别注意的是：在每一份溶液测定完后，必需重新倒回到各自的原试管内，供测试溶液还原用。在测定中如果测试溶液的荧光强度超出100%，则需要重新稀释。B、还原后核黄素标准品和测试品溶液荧光强度的测定 ( F2 )：再在上述已测定并倒回到各自试管内的溶液中，分别加入连二亚硫酸钠（保险粉）约10.0毫克，经溶解混匀后，再重新测其各自荧光强度，并将读数记录于表2中。5-2、数据处理：每一个测定溶液的实际荧光强度校正公式为： F = F1 - F2 F : 校正后的实际荧光强度F1 ：未还原时测定的荧光强度F2 ：还原后测定的荧光强度 经校正公式校正后的核黄素各浓度实际荧光强度（F）的读数亦记于表2中。6、实验结果：6-1、核黄素标准品及测试品溶液的测定结果：表2.核黄素标准品及测试品溶液的测定结果表步 骤 管 号 0 1 2 34 5样品核黄素 含量（ug/ml） 2.52.01.51.00.50.25未还原时荧光强度 F1还原后 荧光 强度 F2实际 荧光 强度 F6-2、核黄素标准曲线的绘制： 以核黄素标准品溶液校正后的荧光强度为纵坐标，相应含量为横坐标，制作核黄素标准曲线。图1：核黄素标准曲线图6-3、未知核黄素样品含量：从标准曲线图中查出未知核黄素样品的含量为： 毫克/毫升。实 验 三离 子 交 换 柱 层 析 法 1、实验目的与要求：本实验是采用阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的pH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、收集、测定等离子交换柱层析技术的要点。2、实验原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基团，例如SO3H；COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如： RSO3H + M+ RS3M + H+或 RNH3OH + CL RNH3CL + OH这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普谝的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。3、实验仪器、器材与装置：3-1、实验仪器：（略）3-2、实验器材：（略） 3-3、实验装置：（附图1）4、试剂与配制：4-1、实验试剂：（1）、 阳离子交换树脂（2）、 天门冬氨酸（3）、 赖 氨 酸（4）、 无水乙醇（5）、 95%乙醇（6）、 氢氧化钠（7）、 柠 檬 酸（8）、 茚 三 酮（9）、 浓 硫 酸（10）、盐 酸4-2、试剂配制：（1）、洗脱溶液的配制（0.45mol/L;pH5.3,柠檬酸缓冲）：称取柠檬酸2.85克，氢氧化钠1.86克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，再加浓硫酸1.05毫升，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、盐酸（0.02mol/L HCL）溶液的配制: 吸取1.0 mol / L HCL,1.0 毫升，用蒸馏水稀释至50.0毫升，混匀即可。（3）、样品溶液的配制（LASP和LYS）：分别称取赖氨酸和天门冬氨酸各7.0毫克，然后加0.02 mol / LHCL10毫升溶解即可。（4）、60%乙醇溶液的配制： 取95%乙醇63.0毫升，加蒸馏水至100.0毫升，混匀即可。（5）、显色剂的配制：称取茚三酮2.0克于一烧杯中，然后加无水乙醇100.0毫升溶解即可。5、实验操作步骤：5-1、树脂的处理：有关市售新树脂的处理和树脂浮选的方法参见本讲义，本实验采用已处理好的树脂。5-2、装层析柱： （依次排队轮流装柱，不允许各自分取，避免浪费）（1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好。将选择完好的层析柱垂直装在台式铁架上，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1.0 cm高）洗脱液。（2）、将烧杯中已处理好的树脂，加适量的洗脱液，搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心的加至适当高度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。（3）、待树脂在柱子底部有明显沉积（10分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的洗脱液，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度达6.0厘米为止。（4）、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。（5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。（6）、在装柱的同时应将其他仪器设备（如：自动部分收集器，恒流泵等）电源接通，并按实验要求进行预热和调试。 5-3、层析柱平衡： 层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以 0.4 ml / min 的流速进行平衡，直至流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（大约2-3倍柱床体积）。5-4、层析柱加样：（1）、 移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时，即行关闭。（2）、打开自动部分收集器电源开关，按 4.0 ml / 10.0 min / 管的条件开始进行收集。（3）、自动部分收集器电源开关打开后，用自动吸管吸取0.5毫升氨基酸混合样液沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时，即行关闭。 5-5、层析柱洗涤：用自动吸管（或滴管）吸取适量（0.5ml）洗脱液，重复上样方法反复洗涤层析柱内壁四周2-3次，当最后一次洗脱液面流至与树脂表面相平时即行关闭柱底端出口。5-6、层析柱洗脱： 用自动吸管（或滴管）吸取洗脱液，沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加至约2-3厘米高后，接上移去的层析柱上端出口塞，同时打开层析柱底端出口和已调好流速的恒流泵开关，开始进行自动洗脱。5-7、收集样液：以每管4.0毫升的条件进行收集，约需收集12-15管即可。也可一边收集，一边测定，根据测定结果来确定收集的管数，即结果所显示的第二样品峰完全洗脱完毕。此时即可停止收集。友情提示：在平衡结束前10分钟，打开自动部分收集器电源开关，按 4.0 ml/ 10.0 min / 管的条件开始进行收集，也就是多收集一管（目的有利于洗脱峰图谱的美观）。另外从洗涤开始正式洗脱之前，均以手动方式进行收集为妥，开始洗脱时，方才可以自动的方式进行收集。若每管少于4毫升太多，收集管数要增加 5-8、样液的测定：（1）、将收集的各管按序编号后，依次分别吸取各管收集液0.5毫升，于另一批同样编号的各对应的试管中。（2）、然后各管分别加入洗脱缓冲液1.0毫升和茚三酮溶液0.5毫升,混匀后于100度沸水浴中加热20分钟左右，然后用自来水冷却至室温。（3）、再在各管分别加入60%乙醇溶液3.0毫升，用混合器混匀，即可。（4）、混匀后的各管样液，以“0”号管为对照管于570 nm 处进行比色。同时将所测定的数据记录之。（5）、按所记录的数据，以光吸收值为纵坐标，收集的管数（或体积）为横坐标绘制洗脱曲线图，同时书写出结论性报告结果。友情提示：氨基酸茚三酮法显色最适pH在5.0左右，过高过低，需调整后，方可测定6、实验结果： 6-1、样品溶液测定方法和结果表1：样品溶液测定方法与结果表 管号 试剂012345678910样液/ml0.00.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5洗脱液1.51.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0茚三酮0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5100保温25min，冷却至室温60乙醇3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0A570nm 6-2、按表1记录的测定结果数据绘制洗脱曲线图1：LYS和ASP氨基酸分离结果图（或氨基酸洗脱曲线图）6-3、结果：友情提示：一定要有明确的文字叙述结果，如下： 由于Asp的pI为2.97，Lys 的pI为9.74，而整个层析体系的pH为5.3，因而Asp在此条件下带负电荷，与阳离子树脂无交换的可能而先流出层析柱，所以图1中的首峰应为Asp。又因Lys在此条件下带正电荷，与阳离子树脂有较弱的交换可能故后流出层析柱，因此图1中的次峰应为Asp。实 验 四凝 胶 渗 透 层 析 法 1、实验目的与要求： 用凝胶柱，分离一含有溶质分子大小不同的样品溶液。并绘出洗脱曲线。通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析的原理和实际应用。2、实验原理： 凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒外，因而所受到的阻滞作用小，先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。 3、实验仪器、器材与装置：3-1、实验仪器：（略） 3-2、实验器材：（略）3-3、实验装置图:（见图2）4、试剂与配制：4-1、试剂： (1)、葡聚糖凝胶 (2)、磷酸氢二钠 (3)、磷酸二氢钠 (4)、血红蛋白(5)、核黄素4-2、试剂配制： (1)、洗脱液（0.05 mol / L,pH 7.4磷酸缓冲）的配制： 分别称取磷酸二氢钠 克；磷酸氢二钠 克于一烧杯中，加蒸馏水 毫升，搅拌溶解即可。(2)、样品溶液的配制： 分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升，搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。 5、操作步骤：5-1、凝胶的处理：将凝胶放入过量的蒸馏水中浸泡6小时（沸水浴中2小时），使其充分溶涨，浸泡时搅 动凝胶再静置，等凝胶沉积后，轻轻倾去上层细颗粒悬浮液，如此反复数次，以除去凝胶中的细颗粒。新购凝胶的处理方法祥见教科书。5-2、凝胶静态预平衡：将经过浸泡处理的凝胶抽干，用约10倍量的洗脱液处理约1小时，方法同浸泡操作，每次均要将上层细颗粒悬浮液弃去。 5-3、装柱： 将层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱下端出口，加适量（约1.0厘米高）洗脱液，再在经预平衡处理的凝胶烧杯中加1.0倍量的洗脱液，搅成悬浮液，然后自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待柱底部凝胶沉积至12厘米高时，缓缓打开柱底端出口，随之继续添加凝胶悬浮液直至柱床体沉积至15.0厘米高度为止。柱内如有气泡、节痕和床表面不平整，必须重新装柱，直至无气泡、节痕和床表面平整为止。在装柱的同时应将恒流泵的流速调至0.5 毫升/分钟，以及电脑、色谱工作站等一切设备的连接与调试完毕，准备随时可以启用。需要注意的是，必须将恒流泵与层析柱的连接管道内的气泡全部排除，否则会影响层析效果。 5-4、平衡：柱装好后，使柱床体稳定5.010.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用2.0倍于床体积的洗脱液动态平衡，同时也使层析柱床体稳定。平衡好的柱子在上样之前，除了用眼观察无误（无气泡和“纹路”，床表面平整）外，最好还要用兰葡聚糖2000进行层析行为的检查。在层析柱内加入1.0毫升兰葡聚糖2000溶液（2.0毫克/毫升），然后用洗脱液进行洗脱（流速不变）。在层析中移动的指示剂色带狭窄均一则表明装柱良好。检查后，再重复步骤5-4进行重新平衡，方可使用。 5-5、加样：打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内液体流至床体表面相平时，关闭层析柱底端出口，吸取样品溶液0.5毫升，沿柱内壁缓缓加入，尽量不要破坏柱表面，加样完毕后，先启动已调好的电脑-色谱工作站，然后打开层析柱底端出口，自然流出，当样品溶液流至床表面相平 时，再次关闭层析柱底端出口，但色谱工作站继续工作。 5-6、洗涤： 吸适量洗脱液（约1.0毫升/次）如同加样方法，反复洗涤层析柱床体表面2-3次，完毕后，将层析柱内再加入洗脱液至3.0厘米高，目的是防止柱床体表面被冲坏。 5-7、洗脱： 此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基线后，继续洗脱10分钟，停止洗脱（约6080分钟）。5-8、保存和打印实验结果：停止洗脱后,将实验结果保存到老师规定的文件中，同时打印实验结果报告，并给出结论性的结果。 5-9、清洗仪器及相关装置：（1）、先从仪器装置中移去层析柱，并回收柱内的填充凝胶，然后用自来水冲洗层析柱，洗净后的层析柱再用蒸馏水荡洗一遍，方可。（2）、将紫外检测仪比色管道的出口端（上部）与所用其他管道相连接，再把恒流泵管道的进口端放入一干净盛有蒸馏水的烧杯中，同时将另一烧杯放在管道的出口端，收集流出的废液。启动恒流泵，冲洗管道15分钟，方可。5-10、结束本次实验：将所有的仪器设备的电源开关关闭，完毕后，清洗所有用具和台面。6、实验结果：（1）、血红蛋白和核黄素分离效果曲线图（2）、结果实 验 五DEAE 纤维素梯度层析实验 1、实验目的与要求：通过DEAE-纤维素阴离子交换剂，采用一条线型离子强度和恒定pH洗提曲线，对鸡蛋白蛋白（CEA）样品进行分级分离，以了解梯度洗提的层析方法。2、实验原理：DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基团的弱碱性阴离 C2H5 子交换剂（纤维素-O-CH2-CH2-NH ）。它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、 C2H5酶等大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这时可采用梯度洗提（装置见图1-2）。即利用一定的样品离子在不同的离子强度（或pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过不断改变洗提的离子强度（pH不变）根据实验的具体情况，也可同时改变离子强度和pH，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当A1=A2时，产生线形梯度；当A1A2时，产生凹型梯度；当A1A2时，产生凸型梯度（见附图1）。不同的样品，应根据实验情形，选择合适的梯度洗提曲线。3、实验器材与装置：3-1、实验仪器：（略）3-2、实验器材：（略）3-3、实验装置图（见附图3）4、试剂与配制：4-1实验试剂：（1）、三羧甲基氨基甲烷（Tris） （2）、鸡蛋白蛋白（CEA） （3）、DEAE-52 （4）、盐 酸（5）、氯化钠4-2试剂配制：（1）、Buffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制：称取Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀HCl调至pH8.0，最后加蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、Buffer B的配制：取Buffer A 50毫升，加氯化钠（1.0M）2.9克，溶解混匀即可。（3）、CEA样液的配制：20.0mg CEA+1ml Buffer A5、方法与步骤：（1）、DEAE-纤维素处理：本实验采用20 mMol/L ,pH8.0 Tris-HCl平衡好的DEAE-纤维素。*新DEAE-纤维素的处理详见本讲义附录（2）、装柱：将处理好的DEAE-纤维素置于烧杯中，并加有约1倍体积的Buffer A，用玻棒搅匀，随即缓缓倒入垂直架好并底端出口关闭的层析中，静置约5分钟，打开层析柱底端出口，吸取过多的柱内上清液，继续添加纤维素悬液，直至沉积高度为10.0cm。在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整。友情提示：在装柱的同时应将电脑色谱工作站、紫外检测仪和恒流泵等装置的电源接通，并进行调试，备用。（3）、平衡：柱装好后，接上调好流速的恒流泵。用Buffer A以0.8ml/min流速，平衡30分钟既可。（5）、加样：加样前先启动已调试完毕的色谱工作站，如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置，整个装置处于工作状态，然后使柱内液面降至床表面，吸取1.0ml样液沿柱管内壁缓缓加入，加毕，打开层析柱底端出口，等液面降至床表面时，关闭层析柱底端出口。（6）、洗涤取少量Buffer A（1.0 ml），每次洗涤均需将液面降至床表面，如同上样方法，重复洗涤柱内壁2-3次，为防止冲坏床表面，最后一次洗涤完毕后，将溶液加至3cm高。然后层析柱接上恒流泵，用Buffer A以0.8ml/min流速，继续自动洗涤15分钟方可。（7）、洗脱：先将梯度混合仪混合阀门和输出阀门关闭（向左）,然后倒入 buffer B溶液60ml于梯度混合仪左杯中，打开混合阀门（向右），让溶液经过通道渗入右杯，立即关闭混合阀门,再将搅拌磁棒放入混合仪右杯中，同时，倒入 buffer A溶液60ml。再将启动的恒流泵进口端与梯度混合仪中盛有Buffer A的梯度杯底部出口端相连接，然后打开层析柱底部出口和梯度混合仪电磁搅拌器开关，同时再打开梯度混合仪的混合阀门与输出阀门，以调好的0.8ml/min流速和方向进行梯度洗提层析。在洗提中，随着Buffer A的烧杯中洗提液的减少，液面将下降，此时Buffer B的烧杯中溶液将由连通管虹吸到Buffer A的烧杯中来，以不断地补充和趋向平衡并且迅速搅匀，这样就产生了一种浓度以梯度形式不断增加的洗提曲线进行梯度洗提层析。待样液最后一个峰已回到基线时，继续 洗脱10分钟，结束洗脱。（8）、层析柱再生：以同样的流速，层析柱改用1.0 mol/L氯化钠溶液洗脱20分钟。 （X）（9）、保存和打印结果：层析完毕，将结果保存到老师要求的文件夹中（结果见图1），并给出结论性的结果（见实验结果6-2）。（10）、结束实验：最后移去层析柱，回收柱内的DEAE，清洗层析柱，同时用恒流泵输送蒸馏水清洗所有与紫外检测仪相连的管道10分钟。并将所有器皿也清洗干净（详细清理方法同凝胶实验中5-9所叙），结束实验。6、实验结果：6-1、DEAE-纤维素分离鸡蛋白蛋白效果曲线图6-2、结果 实 验 六疏 水 层 析 （HIC） 1、实验目的与要求:通过苯基琼脂糖疏水层析柱，采用阶段洗脱的方式分离血红蛋白，以此了解疏水层析的原理、方法和实际的应用。2、实验原理:疏水层析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) 是利用被分离样品中不同生物分子表面的疏水性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。疏水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体，如苯基琼脂糖（Phenyl Sepharose）, 辛基(Octyl),丁基(butyl) 琼脂糖等。对于不同的蛋白质和多肽而言，其分子表面一般有着不同的疏水和亲水结构区域，当将这些生物样品加入到含有高盐（高离子）浓度缓冲液的HIC 柱中时，由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用，降低了样品分子的溶剂化作用，从而增加暴露了样品分子表面的疏水区，这样就促使样品分子表面疏水基团与HIC 柱上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到HIC柱上。因此疏水层析亦称疏水相互作用层析。样品吸附在 HIC柱上的强弱程度，取决于样品本身的疏水性质和样品环境中盐离子的强度。一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度，疏水性弱的则需要较高的盐浓度如1.0 mol/L (NH4)2SO4。吸附在HIC柱上的生物分子，可以采用降低洗脱液中盐浓度的方法，使其从柱上洗脱下来，洗脱方法可以是梯度也可以是阶段洗脱的方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性强与弱从先到后，从而达到分离的目的。3、实验仪器与器材:3-1、实验仪器：（略）3-2、实验器材：（略）3-3、实验装置：（见图3）4、试剂与配制：4-1、实验试剂：（1）、牛血红蛋白 （2）、苯基琼脂糖 （3）、磷酸氢二钠 （4）、磷酸二氢钠 （5）、硫 酸 铵 （6）、无水 乙醇 4-2、试剂配制：（1）、Buffer A（0.02 mol/L pH7.2磷酸缓冲液含1.0 mol/L硫酸氨）的配制：分别称取Na2HPO4_ 克， NaH2PO4_克和NH4 2SO4_ 克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、Buffer B（0.02 mol/L pH7.2 磷酸缓冲液）的配制：分别称取Na2HPO4 _ 克和NaH2PO4_克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（3）、乙醇（20%）溶液：取20.0 ml无水乙醇，然后加80.0 ml蒸馏水，混匀即可。（4）、样品（10mg/ml）溶液：称取10.0 mg牛血红蛋白，加1.0 ml Buffer A溶液溶解如有不溶物质，需在8000rpm离心5分钟，取上清作为上柱样品，本品易溶。5、实验步骤5-1、苯基琼脂糖Phenyl Sepharose 凝胶的处理：商品化的Phenyl Sepharose凝胶颗粒保存在20%的乙醇溶液中，使用时取适量体积的凝胶在砂芯漏斗中用大于10倍凝胶体积的蒸馏水充分洗涤，然后将洗净的凝胶转移到含有Buffer A的烧杯中。5-2、装柱： （1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约1.0 cm高）洗脱液。（2）、将烧杯中已处理好的Phenyl Sepharose凝胶，加适量的Buffer A，搅成悬浮状，然后沿柱内壁细心的加至一定刻度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。（3）、待树脂在柱子底部有明显沉积（10分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的平衡液，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度为3.0厘米为止。（4）、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。（5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。（6）、在装柱的同时应将其他仪器设备接通电源，并按实验要求进行调试。5-3、平衡： 用5倍床体积的Buffer A缓冲液，以0.5 ml/min的流速，平衡30分钟，方可。5-4、加样：（1）、移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时即行关闭。（2）、打开自动部分收集器电源开关，以0.4ml / min的流速，按 4.0 ml / 10.0 min / 管的条件开始进行收集。（3）、自动部分收集器电源开关打开后，用自动取液器吸取样液1.0毫升沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时即行关闭。 5-5、洗涤：用自动吸管（或滴管）吸取适量（1.0ml）平衡液，重复上样方法反复洗涤层析柱内壁四周2-3次，当最后一次洗脱液面流至与树脂表面相平时即行关闭柱底端出口。然后再加入3.0 cm 高Buffer A缓冲液。接上恒流泵，仍以0.5 ml/min的流速，继续用Buffer A缓冲液洗涤直至穿过峰（第一个小峰）回到紫外检测仪基线，并稳定约10分钟后为止。5-6、洗脱：（1）、用Buffer B溶液洗脱凝胶柱：吸去柱内多余的平衡液，缓慢加入3.0 cm 高Buffer B洗脱液（防止柱面的破坏），用恒流泵以同样的流速0.5ml/min，进行洗脱直至所出现的峰（第二个大峰）回到紫外检测仪基线并稳定约10分钟后为止（此峰为血红蛋白组分）。（2）、用蒸馏水洗涤凝胶柱：吸去柱内多余的洗脱液，缓慢加入3.0 cm 高蒸馏水（防止柱面的破坏），用恒流泵以同样的流速0.5ml/min，进行洗涤直至所出现的峰回到紫外检测仪基线并稳定 约10分钟后为止。（3）、用20%乙醇溶液洗涤凝胶柱：吸去柱内多余的蒸馏水，缓慢加入3.0 cm 高20%乙醇溶液（防止柱面的破坏），用恒流泵以同样的流速0.5ml/min，进行洗直至所出现的峰回到紫外检测仪基线并稳定约10分钟后为止约6倍床体积，40分钟。5-7、保存和打印实验结果：将实验结果保存到老师规定的文件中，同时打印实验结果，并给出结论性的结果。 5-8、清洗仪器及相关装置：（1）、先从仪器装置中移去层析柱，并回收柱内Phenyl Sepharose凝胶，然后用自来水冲洗。层析柱，洗净后的层析柱再用蒸馏水荡洗一遍，方可。（2）、将紫外检测仪比色管道的出口端（上部）与所用其他管道相连接，再把恒流泵管道的进口端放入一干净盛有蒸馏水的烧杯中，同时将另一烧杯放在管道的出口端，收集流出的废液。启动恒流泵，冲洗管道15分钟，方可。5-9、结束本次实验：将所有的仪器设备的电源开关关闭，完毕后，清洗所有用具和台面。6、实验结果:6-1、Phenyl Sepharose 凝胶分离牛血红蛋白结果 6-2、结果实 验 七 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 1、目的与要求：用圆盘电泳的方法分离蛋白质样品，通过实验了解和熟悉应用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳进行分析的方法和实验过程。2、实验原理：聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳是以丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺，在催剂的作用下聚合而成的具有三维网壮结构的大分子凝胶作为支持介质的一种区带电泳。在这种电泳中由于采用了凝胶孔径，pH值，缓冲液成分和电位梯度的不连续系统，因此它具有高分辨率的三种效应，即：浓缩效应，分子筛效应和电荷效应。在凝胶中当对被分析的样品进行这种电泳时，样品中的各成分首先经过浓缩，然后再根据他们各自所带电荷，分子量的大小以及形壮的差异，以不同的迁移率电泳分离而成带。因本实验是采用聚丙烯酰胺凝胶在垂直的小玻管中进行的，经电泳后分离触的样品带形似圆盘，因此称之为垂直管型聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（简称圆盘电泳）。下面就简要介绍一下这一电泳的大致过程：首先通过在小玻管中置三种不同成分的凝胶层（如图1），第一层为大孔样品胶，样品凝聚在这层胶中（这层胶亦可用加有样品的浓甘油或蔗糖溶液代替）；第二层为浓缩胶（亦为大孔胶），它的主要作用是使样品浓缩成一狭窄的区带；第三层为分离胶，这层胶的成分和pH皆与上二层不同，孔径较小，然后将这种凝胶管置于上、下两槽中充有Tris-gly电极缓冲液的电泳槽中，就形成了一个凝胶的孔径，缓冲液的组分及pH的不连续系统。这样在电泳一开始的过程中就会产生前导离子（Cl-）在前，样品（蛋白质）夹在中间，尾随离子（NH2CH2COO-）居后的迁移形式，致使产生低的电导区和高的电势梯度，使样品在浓缩胶中一开始就被浓缩为一窄带，然后再进入分离胶，根据电荷、分子大小和形状的不同电泳分离。电泳后，取出凝胶作固定染色处理，或用微量光密度计扫描，以显示出样品带的位置。3、仪器、器材与装置 ：3-1、实验仪器：（略）3-2、实验器材：（略）3-3、圆盘电泳槽装置：（见附图）4、试剂与配制：4-1、实验试剂：1制胶、电泳相关的试剂：（1）： 丙 烯 酰 胺（Acr）（2）： 甲叉双丙烯酰胺（Bis）（3）： 过 硫 酸 铵（AP）（4）： 四 甲基 乙二胺（TEMED），进口，液体，100ml/瓶N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin,分子式：C6H16N2,（5）： 三羟甲基氨基甲烷（Tris）（8）： 甘氨酸（gly）（9）： 溴酚兰（10）：盐 酸（11）：核黄素（12）：蔗 糖2配制染色、脱色液试剂：（13）：考马斯亮兰G-250 （14）：甲 醇（15）：冰醋酸 （16）：三氯醋酸3测定的样品试剂：（浓度均为：1.0 mg/ml），可以由实验给定（16）：牛血清白蛋白（BSA）；MW：66,200 道尔顿4蛋白质标准品：（浓度：小瓶/200 ul ）（17）：低分子量标准指示蛋白：分子量范围10000100,000兔磷酸化酶-B； Rabbit Phosphorylase b； MW：97,400 道尔顿牛血清白蛋白； Bovine Serum Albumin； MW：66,200 道尔顿兔肌动蛋白； Rabbit Actin； MW：43,000 道尔顿牛碳酸酐酶； Bovine Carbonic Anhydrase； MW：31,000 道尔顿胰蛋白酶抑制剂；Trypsin Inhibitor； MW：20,100 道尔顿鸡蛋清溶菌酶； Hen Egg White Lysozyme MW：14,400 道尔顿4-2、试剂配制：（1）、染色液的配制：（400毫升/组，由同学自配）称取考马斯亮兰G250 250毫克于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后分别加入冰醋酸9.0毫升,甲醇45.5毫升，最后用蒸馏水定容至100毫升，混匀即可。 （2）、脱色液的配制： 冰醋酸 ：甲醇 ：水 = 7.5 ：5.0 ：87.5 (V/V)(3)、固定染色液的配制：（固定染色后，就可省去染色和脱色的步骤）称取三氯醋酸15克加蒸馏水100ml溶解，加10%（10克/100ml）考马斯亮兰G-250溶液5.0ml，混匀即可。（3）、标准品、样品溶解（蔗糖）溶液的配制:称取蔗糖2.0 g，加蒸馏水10.0 ml（200 mg/ml），溶解混匀即可。（4）、标准分子量蛋白质样品溶液的配制：取标准分子量蛋白质样品1 支加上述（3）标、样品溶解缓冲溶液200ul溶解，溶解后放在冰箱中备用。加样前标准品管须加盖在沸水浴中加热3分钟和滴加少许溴酚兰，使最终浓度约为0.001%。（5）、测试蛋白质样品溶液(8.0ug/1.0ul)的配制：取测试蛋白质样品约80微克于小试管内，加蔗糖溶液10微升溶解（蛋白质浓度配成8.0mg/ml），溶解后放在冰箱中备用。加样前样品管须加盖在沸水浴中加热3分钟和滴加少许溴酚兰(浓度约为0.001%)。（6）、四甲基乙二胺（TEMED）溶液的配制：该试剂为液体溶液，直接取原液，无须配制。（7）、电极Buffer的配制：分别称取Tris：0.6g ， Gly：2.38g于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升，然后加0.001%溴酚兰溶液2.0 ml混匀（pH8.3）即可。提示：其它制胶相关的试