（生物化学与分子生物学专业论文）还原脱氯微生物的生物固氮研究.pdf

摘要 摘要 大量人为及自然产生的氯代有机物被源源不断地释放到环境中，这些化合 物大部分都是有毒的，并且在环境中不断蓄积，它们的广泛分御对人类公共健 康和环境产生了潜在威胁。许多有机氯代物都能对抗好氧微生物的降解代谢， 主要是由于氯位取代阻止了氧化酶的攻击。幸运的是还原脱氯微生物在厌氧环 境下，通过还原脱氯的方式来降解氯代污染物，厌氧的环境主要包括厌氧的土 壤、地下水以及沉积的淤泥等，而由还原脱氯产生能量耦连代谢生长的过程称 为“脱氯呼吸”。根据微生物富集、碳同位素分离以及分子生物学的研究，已经 发现还原脱氯微生物在自然界中广泛分和，暗示它们在生物修复和全球氯循环 方面起着重要的作用。在国际上，研究含氯有机物在环境中的归宿及生物降解 己成为近年来微生物生态学及环境科学的重要方向。中国人口众多，自然资源 有限，环境生态问题尤为突出，环境质量和人们的生存及可持续发展密切相关， 因此，加强这些方面的研究已显得刻不容缓。 生物固氮是在共生、联合或自生固氮微生物的作用下，将空气中的氮气直 接还原成氨的过程，对生态平衡的维系、全球农业以及全局性的氮循环方面影 响重大。尽管在真核生物中没有发现固氮现象，但已经发现的固氮微生物广泛 存在于细菌和古细菌中，揭示了固氮微生物的生物多样性。这种重要的生理学 特征在还原脱氯微生物中还尚未发现，根据三种还原脱氯细菌全基因组测序的 结果，在dh a f n i e n s es t r a i n y 5 1 和d e h a l o c o c c o i d e ss t r a i n1 9 5 中都发现了固氮相 关的基因，而在d e h a l o c o c c o i d e ss t r a i n c b d b l 基因组中没有发现固氮相关基因， 本课题的研究任务就是找到还原脱氯微生物进行尘物固氮的依据。 在厌氧脱氯微生物的作用下，有机氯代化合物可通过还原脱氯反应，转化 成无毒或低毒产物，还原脱氯细菌生态、生理以及遗传学的重要进展揭示了它 们在生物修复和全球的氯循环方面起着极其重要的环境学意义。目前通过富集、 分离以及纯化等手段已经获得了多种能进行纯培养的还原脱氯微生物，而对这 些还原脱氯微生物进行生物固氮的研究不仅有助于阐明其生理、生化特性，揭 示其在进化上的意义，而且有助于调节还原脱氯微生物治理污染环境中的功能。 我们首次利用己分离纯化的多种具有代表性的还原脱氧微生物为研究材料，在 生理水平和分子水平来研究它们固氮活性，并通过对其在不同生长环境下固氮 摘要 活性的检测以及固氮基因表达的定性定量研究，阐明还原脱氯反应与固氮是否 具有相关性，进而理解还原脱氯微生物的进化原理和固氮基因的来源。 在我们的研究中，首次从生理学和分子生物学水平揭示了还原脱氯微生物 进行固氮功能的依据，并发现3 一氯苯甲酸还原脱氯细菌( d e s u t f o m o n i l et i e d j e i d c b 一1 ) 和2 一氯苯酚还原脱氯细菌( d e s u l f o v i b r i od e c h l o r a c e t i v o r a r 聃s f 3 ) 在特定电 子供体存在的情况下，固氮与还原脱氯之问呈现币相关，即固氮生长促进还原 脱氯反应。同时在d e s u 扣v i b r i od e c h l o r a c e t i v o r a n ss f 3 基因组中克隆到两种n f h 基因同源体，这两种n f h 基因在不同的生长代谢方式下呈现表达差异。这些现 象的发现为我们理解微生物在重要遗传特性的协同进化和功能行使方面提供重 要帮助，并为环境污染的原位修复治理开辟更广泛、更高效的途径。为深入探 讨还原脱氯微生物的固氮分子机制和解释上述重要的发现，根据固氮代谢基因 在基因组上呈簇分布的特征，我们构建了还原脱氯微生物基因组人工染色体文 库( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m el i b r a r y ) ，从该文库中筛选包含固氮酶基因簇矿 g e n ec l u s t e r ) 的克隆并测序，从序列水平剖析参与生物固氮过程中的功能基因和 调节基因，从而为揭示还原脱氯微生物生物固氮的机理和调控机制提供可能。 关键词：还原脱氯生物固氮 口胃基因逆转录p c r 固氮基因簇生物修复 b a c 文库 a b s 乜 a c t a b s t r a c t aw i d er a n g eo f m a n - m a d ea n dn a t u r a l l yp r o d u c e dc h l o r i n a t e dh y d r o c a r b o n s h a v eb e e nr e l e a s e di n t ot h ee n v i r o n m e n t , a n dm o s to f t h e mw e r et o x i ca n d e n v i r o n m e n t a l l yp e r s i s t e n tp o l l u t a n t st h e i rw i d ed i s t r i b u t i o nc a u s e das i g n i f i c a n tr i s k t op u b l i ch e a l t ha n dt h ee n v i r o n m e n t m a n yo f t h e s ec o m p o u n d sw e r er e s i s t a n tt o a e r o b i cm i c r o b i a lm e t a b e l i s mo f t e nb e c a u s et h ec h l o r i n es u b s t i t u t i o nb l o c k e d o x y g e n a s ea t t a c kf o r t u n a t e l y ，r e d u c t i v e l yd e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i aw e l - ec a p a b l eo f t r a n s f o r m i n gc h l o r i n a t e dh y d r o c a r b o n st h r o u g h r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o ni na n a e r o b i c e n v i r o n m e n t ss u c ha sa n o x i cs o i l s ，g r o u n d w a t e r sa n ds e d i m e n t s ，i na n e n e r g y g e n e r a t i n gp r o c e s st e r m e dd e c m o r i n a t i n gr e s p i r a t i o nb a c t e r i a lc u l t u r e ，c a r b o n i s o t o p ef r a c f i o n a t i o na n dm o l e c u l a rb i o l o g ys t u d i e sh a v es h o w e dt h a th a l o r e s p i r i n g a n a e r o b e sa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r e ，i m p l y i n gt h e i ri m p o r t a n te n v i r o n m e n t a l r o l e si nb i o r e m e d i a t i o na n di nt h ee 丑o b a jc h l o r i n ec y c l e b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o nw a st h ec o n v e r s i o no fa t m o s p h e r i cn i t r o g e ni n t o a m m o n i ab ys y m b i o t i c ，a s s o c i a t i v ea n df r e e l i v i n gb a c t e r i a , w h i c hp l a y e da t r e m e n d o u sr o l ei ne c o l o 百c a ls u s t e n a n c ea n dw o d da g r i c u l t u r en i t r o g e nf i x a t i o n w a sa ni m p o r t a n tp a r to f g i o b a ln i t r o g e nc y c l e sa si tr e p l e n i s h e dt h eo v e r a l ln i t r o g e n c o n t e n to f b i o s p h e r ea n dc o m p e n s a t e df o rt h el o s s e st h a tw e r ei n c u r r e do w i n gt o d e n i t r i f i c a d o na l t h o u g hn i t r o g e nf i x a t i o nw a sn o tf o u n di ne u k a r y o t e s ，i tw a sw i d e l y d i s t r i b u t e da m o n gt h eb a c t e r i aa n dt h ea r c h e r a ，r e v e a l i n gc o n s i d e r a b l eb i o d i v e r s i t y a m o n gd i z a o t r o p h i co r g a n i s m st h i ss i g n i f i c a n tp h y s i o l o g i c a lf e a t u r eh a sn o tb e e n r e v e a l e di nr e d u c t i v e l yd e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i ar e s u l t sf r o ms e q u e n c i n go f t h r e e w h o l eg e n o m e so f t h ed e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i ad e s u l f i t o b a c t e r i u mh a f n i e n s ea n d d e h a l o c o c c o i d e si n d i c a t e dt h a tn i t r o g e nf i x a t i o n r e l a t e dg e n e sw e r ef o u n di nd h a f n i e n s es t r a i n y 5 1a n d d e h a l o c o c c o i d e ss t r a i n1 9 5 ，b u t w e r e m i s s i n g i n d e h a l o c o c c o i d e ss t r a i nc b d b1i nt h i sr e s e a r c h ，w ep r o v i d e de x p e r i m e n t a le v i d e n c e t h a tr e d u c t i v e l yd e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i aw e r ec a p a b l eo f f i x i n ga t m o s p h e r i cn i t r o g e n s i g n i f i c a n ta d v a n c e si nt h ee c o l o g y , p h y s i d o g y ，a n dg e n e t i c so fr e d u c t i v e l y i i a b s 仃a c t d e c h l o r i n a t i n g b a c t e r i ah a v er e v e a l e dt h e i r i m p o r t a n te n v i r o n m e n t a l r o l e si n b i o r e m e d i a t i o na n di nt h eg i o b a lc h l o r i n ec y c l ei no u rr e s e a r c h ，w ef i r s t l ys h o w e d p h y s i o l o g i c a la n dm o l e c u l a re v i d e n c et h a tr e d u c t i v e l yd e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i aw e r e c a p a b l eo ff i x i n ga t m o s p h e r i cn i t r o g e n i ns o m eo ft h e s ed e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i a ，n z f i x a t i o ns t i m u l a t e dr e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o n a n d 聆归h o m o l o g o u se x p r e s s i o n d i s c r e p a n c yu n d e rd i f f e r e n tg r o w t hc o n d i t i o n s ，w h i c hs h o u l dh e l pp r e d i c ta n d r e g u l a t et h ee n v i r o n m e n t a lf u n c t i o no fd e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i ai n 加s t u b i o r e m e d i a f i o no fc h l o r i n a t e dp o l l u t a n t st h e s er e s u l t si m p l i e dt h a tn zf i x a t i o ni n d e c h l o d n a t i n gb a c t e r i ai n t e r a c t e dw i t ho t h e rb i o g e o c h e m i c a lc y c l e st oc o n t r o lt h e n i t r o g e ns t a t u so f t h ea n a e r o b i ce c o s y s t e m i no r d e rt of u r t h e rs t u d yt h em e c h a n i s m sa n dr e g u l a t o r yn e t w o r k so fn 2 f i x a t i o n i n d e c h l o r i n a t i n gb a c t e r i at h a te x h i b i t e ds o m ei m p o r t a n tp h e n o t y p e su n d e r n ：- d e p e n d e n tg r o w t h ，t h es u p p o s e dn f g e n ec l u s t e r sw e r eb ec l o n e db yc o n s t r u c t i n g a n ds c r e e n i n gg e n o m eb a cl i b r a r i e s ，a n ds e q u e n c e d t h e s eg e n e sw e r ea n n o t a t e d a c c o r d i n gt ob i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n da f t e rt h a t , t h ef u n c t i o n so ft h e md e s i g n a t e d i nt h en 矿g e n ec l u s t e r sw o u l db ee x p e r i m e n t a l l yi d e n t i f i e d k e yw o r d s ：r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o n ；b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o n ；n f - g e n e ；r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n a lp c r ；m f g e n ec l u s e r ；b i o r e m e d i a t i o n ；b a cl i b r a r y i i 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 静 一卿 第1 章绪论 第1 章绪论( 还原脱氯微生物生物固氮研究进展) 1 厌氧微生物的还原脱氯 1 1 引言 含氯有机化合物作为生产溶剂、润滑剂、导热和绝缘介质以及农药、杀虫 剂、除草剂等重要原材料大量应用于农业、工业和洗染业，因此广泛散布于自 然环境中。并且多数氯代有机物具有良好的化学稳定性和热稳定性，不易被分 解或生物降解，因而会在自然界中长时间滞留。多数氯代有机物还具有较高的 毒性和较强的“致癌、致畸、致突变”的作用，且容易通过食物链在生物体内 富集，严重的威胁着自然生态和人类健康，因此氯代有机物的控制早己成为人 们关注的热点。1 9 7 7 年美国环保局颁布的“清洁水法”( p l 9 2 5 0 0 ) 修f 案中明 确规定了6 5 类1 2 9 种优先控制的污染物，其中约7 0 种为氧代有机物。从结构 上分析，氯取代基会影响烃链或苯环上电子云密度的分布以及c c 或c 与其他 原子键的极性，同时氯原子的存在还会抑制苯坏裂解酶和氧化酶的攻击，从而 导致氯代有机物的生物降解，因此厌氧条件下的还原脱氯可以大大降低其生物 毒性，也便于进一步的生物降解。 现已有多种还原脱氯细菌被分离和鉴定，如3 氯苯甲酸还原脱氯细菌 ( d e s u i f o m o n i l et i e d j e id c b 1 ) ( s h e l t o na n dt i e d j e 1 9 8 4 ) 、2 - 氯苯酚还原脱氯细菌 ( d e s u ( f o v i b r i od e c h l o r a c e t i v o r a n ss f 3 ) ( s u ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 、三氯乙烷还原脱氯细菌 ( d e h a l o b a c t e rs p t c a l ) ( s u ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 、四氯乙烯还原脱氯细菌 ( s u l p h u r o s p i r i l l u mm u l t i v o r a n s ) ( s c h o l z m u r a m a t s uh e ta 1 ，1 9 9 5 ) 、及3 氯一4 一羟基 苯乙酸还原脱氯细菌( d e s u 历t o b a c t e r i u md e h a l o g e n a n s ) ( u t k i ne ta l ，1 9 9 4 ) 等。同时 随着工农业的迅猛发展和自然气候的不断变化，自然产生的和人为生成的氧代 污染物源源不断地释放到环境中，导致氯代污染物数量和种类在环境中不断积 累，驱动了脱氯微生物的进化，最终导致了代谢底物和系统发生的多样眭( s m i d t a n dd ev o s ，2 0 0 4 ) 。 1 2 厌氧脱氯微生物功能和系统发生的多样 第1 章绪论 1 2 1 厌氧生态系统中的脱氯性 微生物还原脱氯也是近年束发现的种新的能量代谢方式，它是以含氯有 机化合物作为终端电子受体，有机物作为电子供体，通过呼吸链上的电子传递 完成脱氯呼吸( h o l l i g e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。它们可以通过脱氧一或完全的“矿化”一发 酵、氧化、或还原等多种方式来降解氯代有机物( d ew i l d e m a na n dv e r s t r a e t e ，2 0 0 3 ； d o l f i n g ，2 0 0 0 ) ，目前已知的还原脱氯的机制主要遵循以下几种模式：第一种是氢 解( f i g 1 1 a ，b ) ，即直接将一个氢替代氯；第二种机制是发生非芳香族氧代化 合物的脱氯，即双氯消除( f i g 1 1 c ) ，两个相邻的氯同时被除去，脂肪族的c c 键变成c = c 双键。因为双氯消除仅需要l 摩尔的氢气就能取代2 摩尔的氯，而 在氢解机制中则需要2 摩尔的氢气，因此双氯消除机制比氢解更易进行，但是 这种机制的作用底物非常有限。从热力学的角度来分析，氯代有机物的降解除 了还原脱氯以外，可以通过其他的方式进行降解，厌氧的微生物菌群也可以通 过有氧的或发酵的途径束脱氯。 a o h b ；鳞： ”t 笔”+ o h w r 氐。 ” cd i - c eh r 2 1 n 一+ h a 2 c o j f i g 1 1 e x a m p l e sf o rd i f f e r e n td e h a l o g e n a t i o nm e c h a n i s m sf o u n d i na n a e r o b i cb a c t e r i a ( a ， b ) r e d u c t i v eh y d r o g e n o l y t i cd e h a l o g e n a t i o no f 2 ，3 - d i c h l o r o p h e n o l ( 2 ，3 - d c p ) t o3 - c h l o r o p h e n o l ( 3 - c p ) ，a n dp c et ot r i c h l o r o e t h e n e ( t c e ) ；( e ) r e d u c t i v ed i h a l o e l i m i n a t i o no fi 2 - d c a ；( d ) c o m p l e t e o x i d a t i o no f 2 一c h l o r o e t h a n o l ( 2 - c e ) u n d e rn i t r i f y i n gc o n d i t i o n s 1 2 2 有机氯代物作为唯一的碳源和能源 氧化脱氯：在t h a u e r a ，p s e u d o m o n a s 和o c h r o b a c t e r i u m 属中大量能纯培 养的变形杆菌能完全“矿化”3 氯苯甲酸( s o n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) ，并且在反硝化的条 件下，利用广谱的氯代芳香族化合物作为碳源和能源。然而在产甲烷、硫酸盐 还原或f e 及m n 4 + 还原的条件下，迄今为止还没有发现任何一种纯培养物能氧 化脱氯，即使在这些条件下观察到很多氯代有机物被完全矿化，但那仅仅是在 混合的培养物中发现的( b r a d l e y ，2 0 0 3 ) 。 2 n 点h 椰 第1 章绪论 近年来，兼性厌氧的p s e u d o m o n a ss t u t z e r is t r a i nj j 是第一株被发现在厌氧及 硝酸盐还原的生长条件下进行2 氯乙醇的氧化脱氯的纯培养微生物( d i j ke ta 1 ， 2 0 0 3 ) ( f i g 1 1 ) 。这株微生物是分离于降解l ，2 - 二氧乙烷( 1 ，2 - d c a ) 的反硝化 富集培养物中，虽然表现为1 ，2 - d c a 的脱氯活性，但并不能完全归功于这株微生 物( g e r r i t s ee ta 1 1 9 9 9 5 。 发酵脱氯：目f j 富集分离到的两种低o c 含量、革兰氏阳性的同型产乙酸菌 在纯培养的条件下，可以将氯代脂肪族化合物作为唯一的碳源和能源，而 d e h a l o b a c t e r i u m 向r m i c o a c e 6 c u m 能将二氯甲烷发酵成乙酸和甲酸( m “a g l i ae ta 1 ， 1 9 9 6 ) ，a c e t o b a c t e r i u md e h a l o g e n a n s 使用氯甲烷并产生乙酸作为发酵的终产物 ( t r a u n e c k e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 。这两种微生物的脱氯过程都涉及到一个多酶复合体所催 化的甲基转移反应，这个复合体包含一个类咕啉辅因子作为原始的甲基受体。 此外，最近的研究发现了氯代乙烯和氯代乙烷的发酵脱氯的证据，主要包括氯 乙烯和1 2 - d c a ( b r a d l e ya n dc h a p e l l e ，19 9 9 ) 。 光合菌的脱氯：一些光合菌，包括r h o d o s p i r i l l u m 和r h o d o p s e u d o m o n a ss p p 能在厌氧条件下，对氯代羧酸或3 一氯苯甲酸进行光合脱氯，脱氯发生在还原的 过程，然而r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s 只能发生在3 氯苯甲酰辅酶a 的阶段 ( e g l a n de ta 1 ，2 0 0 1 ；l a r i m e re ta 1 ，2 0 0 4 ；m c g r a t ha n dh a r f o o t ，1 9 9 7 ；v a nd e r w o u d ee ta 1 ，1 9 9 4 ) ，对其他游离氯代有机物则没有作用。最为显著的特征就是大 多数实验室的rp a l u s t r i s 菌株都不能降解氯苯甲酸，包括对r p a l u s t r i ss t r a i n c d a 0 0 9 的全基因组的序列分析( e g l a n de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。但这些细菌在有机氯代物 中培养一段时间后，就能表现出脱氯的活性，这可能说明氯代有机物的诱导， 导致少数基因的突变是获得脱氯功能的原因，以及提供研究这种适应性的明确 证据( g i b s o na n dc ，2 0 0 2 ；g i b s o na n dh a r w o o d ，2 0 0 2 ；v a nd e rm e e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 1 2 3 还原脱氯微生物的脱氯机制 还原脱氯呼吸是近年来发现的一种新的能量代谢方式，微生物在厌氧条件 下的脱氯机制主要分为非生物性的、共代谢的以及代谢的脱氯，然而后者是在 还原脱氯微生物中发现的，主要是将特异且高亲和力的酶催化还原脱氯反应和 微生物的生长偶联。到目前为止，根据还原脱氯的机制推测，应该有两个脱氯 模式：其模型一如f i g1 2 所示，还原脱氯酶是催化还原脱氯反应的重要酶，定位 在细胞膜上，其活性位点是面向细胞质- - 目f j ( m o h na n d t i e d j e ，1 9 9 2 ) 。当进行还 3 第1 章绪论 原脱氯时，电子供体如氢气、甲酸、乳酸、乙酸以丙酮酸等在氢化酶或脱氢酶 的作用下，生成质子并释放电子( d o l f i n ga n dt i e d j e ，i9 8 7 ；d o l f i n ga n dt i e d j e ， 1 9 9 1 ) ，电子沿着分布在细胞膜上的电子传递链将电子传递到位于细胞膜上的还 原脱氯酶，在还原脱氯酶的催化作用下将氯代有机物还原。同时生成的质子释 放到胞质外而形成梯度，质子顺浓度梯度通过a t p 酶依赖的质子通道进入胞质 内，并驱动a t p 的生成，从而提供微生物生长代谢的能_ 霍| = 需求，实现了还原脱氯 和能量代谢的耦联。还原脱氯酶的催化活性位点是位于细胞膜的胞质侧，这就 意味着有机氯代物必须通过某种方式进入胞内方可实现还原脱氯( d e w e e r de ta 1 1 9 9 l ；s h e l t o na n d t i e d j e ，1 9 8 4 ；s u f l i me t a l ，1 9 8 2 ) 。 d 队o n o “r s “。 a 队c c c p l o r “s a p-_- f i g i 2t h em e c h a n i s mo f r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o no c c u r r e di nc y t o p i a s m 另一种脱氯模式( f i g1 3 ) 是根据对还原脱氯微生物d e h a l o c o c c o i d e s e t h e n o g e n e ss t r a i n1 9 5 的全基因组测序后推测的脱氯模型( s e s h a d r i e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。它 与第一种脱氯模型的主要区别是还原脱氯酶是定位在细胞膜上，但其催化位点 面向细胞周质侧，氯代有机物如四氯乙烯无需进入细胞内即可在细胞周质的区 域实现还原脱氯。定位在细胞膜上的氢化酶或脱氢酶可以将电子供体氧化释放 电子，电子通过电子传递链传递给还原脱氯酶，四氯乙烯在还原脱氯酶的作用 下被还原脱氯。在电子供体被氧化的同时，产生的质子形成膜内外的质子梯度， 质子通过a t p 酶依赖的离子通道顺浓度梯度进入胞内，并生成a t p 以提供还原脱 氯微生物生长代谢的能量需要，从而实现了还原脱氯与生长代谢的偶联。这个 4 第1 章绪论 模型还认为四氯乙烯同时还是作为诱导还原脱氯发生的信号分子，当胞外的四 氯乙烯积累到一定浓度时，便可透过细胞膜进入细胞内，将脱氯信号传递给胞 内的一种组氨酸激酶，激活的组氨酸激酶可以启动感应调节因子的表达，这种 调节因子是可以启动还原脱氯酶表达的转录因子，从而启动还原脱氯酶基因的 表达和定位，实现了胞外脱氯信号的传递及胞内脱氯酶基因表达的启动。 f i g 1 3t h em e c h a n i s mo fr e d u c t i v ed e c hl o r i n a t i o no c c u r r e di np e r i p l a s m 1 3 还原脱氯微生物 在过去的二十多年的研究中，第一个分离纯化的还原脱氯微生物 d e s u l f o m o n i l et i e d j e i 将3 一苯甲酸还原脱氯成苯甲酸从而实现脱氯生长代谢( s m i t h e ta 1 ，1 9 9 0 ) ，从此揭开了厌氧微生物还原脱氯进行能量代谢生长方式的序幕。后 续的研究不仅集中在还原脱氯微生物代谢及进化的多样性上，而且还延伸到还 原脱氯酶的结构、功能以及氯代呼吸的调控网络等领域。现己知很多单氯代和 多氯代有机物能被脱氯微生物进行还原脱氯，主要包括氯代烷烃、氯代烯烃以 及氯代芳香族化合物( 氯代苯甲酸、氯酚、多氯联苯、二嗯英等) ( e lf a n t r o u s s i 第1 章绪论 e ta l ，。1 9 9 8 ) 。目前已经分离纯化的还原脱氯微生物在系统发生树上分布相对集中 ( f i g 1 4 ) ，这些能纯培养的还原脱氯微生物主要集中在a n a e r o m y x o b a c t e r 、 d e s u ! f i t o b a c t e r i u m 、s u l f u r o s p i r i l l u m 、d e s u t f o m o n i l e 、d e s u l u r o m o n a s 、 d e s u 怕v i b r i o 及t r i c h l o r o b a c t e r 属，它们大多都有广谱的电子供体和电子受体。 而在d e h a l o c o c c o i d e s 和d e h a l o b a c t e r 属中的一些还原脱氯微生物却严格依赖脱氯 呼吸的方式生长，并且大多情况下都是以氢气作为唯一的电子供体( s u n ge t a l ， 2 0 0 3 ) 。还原脱氯微生物可以从天然的和工程改造后的生态系中富集分离到，如 两株生理上完全一样的好乙酸四氯乙烯还原脱氯细菌d e s u 物r o m o n a s m i c h i g a n e n s i s 分别从不同的环境中分离，一种是从含有大量有机碳的原始沉积 物，另一种是后天营养不足的被污染的含水层。还有在系统发生树上很接近的 两株多能的四氯乙烯还原脱氯细菌s u i f u r o s p i r i l l u mm u l t i v o r a n s ( 原先命名为 d e h a l o s p i r i l l u mm u l t i v o r a n s ) 和sh a l o r e s p i r a n s ，就分别是从活性淤泥和厌氧的四 氧乙烯污染土壤中富集分离而来( l u i j t e n e ta l ，2 0 0 3 ；s c h o l z m u r a m a t s u he ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。上述现象说明有机氯代物的特异性和还原脱氯微生物的进化关系并没有 相关性，那些分布在所有主要属的还原脱氯微生物具备降解氯代烃和氯代芳香 族化合物的能力。最近发现的t r i c h l o r o b a c t e rt h i o g e n e s 是第一个能将三氯乙酸还 原脱氯成二氯乙酸的还原脱氯细菌，其电子是源于乙酸。有趣的是这株细菌的 代谢还涉及到硫一硫化物循环，这种循环可以实现乙酸氧化和还原脱氯过程中的 电子穿梭( d e w e v e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在上述提到的属中，大量能纯培养的还原脱氯 微生物都集中在低g c 含量的革兰氏阳一眭f f d e s u l f i t o b a c t e r i u m 属以及更深的 d e h a l o c o c c o i d e s 分支中，它们能使用多种氯代有机物作为电子受体，生长的速度 也较快，可以作为研究还原脱氯的模式系统，同时还可以通过一些失活或过表 达的遗传操作也被引进到这个领域。随着基因组测序技术的全面发展，一些模 式的还原脱氯微生物的全基因组已经被测序，可以从基因组水平深入理解还原 脱氯的途径( s m i d ta n dd ev o s ，2 0 0 4 ) 。 6 第1 章绪论 f i g 1 4p h y l o g e n e t i ct r e eo fh a l o r e s p i r i n gi s o l a t e s ( i nb o l d ) b a s e do nb a c t e r i a ls s ur r n a s e q u e n c e sa l i g n m e n ta n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sw e r ep e r f o r m e dw i t ht h ea r bs o f t w a r e ，a n dt h e t r e ew a sc o n s t r u c t e du s i n gt h en e i g h b o r j o i n i n gm e t h o d t h er e f e r e n c eb a ri n d i c a t e st h eb r a n c h l e n g t ht h a tr e p r e s e n t s1 0 d i v e r s i t y 1 4 还原脱氯酶活性的调节 从实际应用的角度来看，解析还原脱氯微生物启动还原脱氯代谢过程的环 境因素是很重要的，因为很多还原脱氯微生物都是通过有机氯代物的诱导而激 活它们的脱氯活性( g e r r i t s ee ta 1 ，1 9 9 9 b ) ，但也有一些是被己经脱氯的产物所抑 f b l j ( h ea n ds a n f o r d ，2 0 0 2 ；m o h na n dt i e d j e ，1 9 9 2 ) ，例如这种活性抑制可能是由于 可替代电子受体或其他化合物的出现所致。还原脱氯酶活性潜在的抑制剂包括 硫氧阴离子，如硫代硫酸赫、亚硫酸盐，而亚硫酸盐的抑制是由于直接抑制还 原脱氯酶复合体所致( s m i d ta n dd ev o s ，2 0 0 4 ) 。一些广谱降解有机氯代物谱的还 原脱氧微生物，各种不同还原脱氯酶的表达完全依赖不同有机氰代底物的诱导 ( j a y a c h a n d r a ne ta l ，2 0 0 3 ；v a nd ep a s e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 第一个涉及调控还原脱氯酶基因表达分子基础的详细研究是在d d e h a l o g e n a n s 上实现的，通过转座子随机插入构建突变体，然后利用活性筛选的方法克隆到 d d e h a l o g e n a n s 还原脱氯酶基因簇，并从序列和功能上证实了这些基因的位置 和转录方向( s m i d t e t a l ，1 9 9 9 ；s m i d te t a l ，2 0 0 0 ) 。研究发现加入氯代底物3 0 分钟 内，编码还原脱氯酶的c p r b a 操纵子的转录水平被诱导上调到1 5 倍，同时伴有 脱氯活性的出现。根据对c p r t k z e b a c d 基因簇的表达分析及脱氯活性缺失突变 第1 章绪论 体的分离和分析，大量的证掘显示转录调节因子和环境感应因子涉及到脱氯呼 吸过程的调节( s m i d te ta 1 ，1 9 9 9 ；s m i d te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此外一些编码催化蛋白折叠 的基因，如分子伴侣( c p r d 。c p r e ) 和触发因子( c p r t ) ，都在脱氯呼吸的条 件下特异性地被表达，这些蛋白可能参与了还原脱氯酶复合体的加工和成熟( f i g 1 5 ) 。对推测的脱氯呼吸特异性的启动子分析发现c p r k 基因的产物是转录调节 因子c r p f n r 超家族的一员，它可能启动脱氯呼吸的特异性基因表达。所有鉴定 诱导脱氯呼吸转录本的上游都有一个f n r b o x 1 i k e 样的结合基序，就是所谓的 h a l o b o x e s ，它是c p r k 的结合位点。有趣的是通过d h a f n i e n s e 全基因组测序发 现至少有1 7 个c r p f n r 同源体，有5 个与dd e h a l o g e n a n s 的c p r k 高度相似， 但其中的个例外是它跟r d h a b 基因簇连在一起( k o r n e re ta l ，2 0 0 3 ；s m i d te ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。更多的h a l o b o x e s 在所有的脱氯酶基因簇的启动子区域被发现。从而支持 了它们在特异性地调节脱氧呼吸基因表达方面的作用。电泳迁移率变动分析确 认了c p r k 在d d e h a l o g e n a n s 中作为脱氯呼吸特异性的转录调节因子，通过体 外的异源过表达、纯化得到的c p r k 只能在氯代底物3 氯4 一羟基一苯乙酸存在的 情况下与推测的c p r 启动子结合，同时根据晶体学研也提供了结合的佐证( g a b o r e ta 1 ，2 0 0 6 ；j o y c ee ta 1 ，2 0 0 6 ；p o pe ta 1 ，2 0 0 4 ) f i g 1 5m o d e lf o rt h er e g u l a t i o na n df u n c t i o n a la s s e m b l yo f o g h o c p r dc o m p l e xi nd d e h a l o g e n a m m e ，m e t a li o n st h a tm a yb ei n v o l v e di nc o n t r o lo f g e n ee x p r e s s i o na n da l e i n c o r p o r a t e di nt h em a t u r ee n z y m ec o