电镜切片样品制作步骤.doc

_扫描电镜样品的准备A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗12次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4静置沉降23天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。B贴壁培养的细胞：在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4 3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。C组织取材样品观察表面可达810mm2,高度小于5mm左右；样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗； 固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4固定3h以上，换PBS送检。附：2.5%戊二醛的配制Step 1:0.2M磷酸缓冲液的配制：- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）2.6克 磷酸氢二钠 (Na2HPO4.12H2O)29克 双蒸馏水 加至500毫升 pH调至7.4Step 2:戊二醛固定液的配制：- 25% 戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度2.5% pH值7.3-7.4 透射电镜样品的制备一、培养细胞 本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。1. 细胞数量：106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。2. 离心收集：消化或用细胞刮刮下细胞。如细胞状态一般或漂浮物较多，建议更换新培养基；如观察自噬，建议刮下细胞。3. 离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义，时间在5min内；4. 细胞团大小：细胞最厚处约0.51.5mm,或者参照1元硬币的厚度；5. 细胞离心成团后去除上清，加2.5%电镜用戊二醛500l固定，切勿吹悬，室温1h，4 3 h后，去除戊二醛加满PBS后4放置或送检。 注意：固定细胞不需要吹悬，细胞不宜过多，过多会导致固定液无法迅速渗透到底部细胞；二、生物组织迅速剪下/切下相应位置，在2.5%戊二醛中，依据不同组织和实验目的，用刀片修成1mm3的小块或_mm22mm长条或薄片状。在2.5%戊二醛室温1h，4 3 h，去除戊二醛加满PBS，4放置或送检。标本固定时，尽量修饰成合适的形状，对于需要定位的标本，离开实验室者后比较难以确认所需要的位置。使用2ml圆底或尖底的EP管，勿用500l以下的EP管。 块状标本基本包含的组织类型：脑、肾、肝、肺、心肌； 长条状、薄片状标本基本包括：骨骼肌、平滑肌：肌纤维方向与标本长轴平行或垂直（送样时说明方向）皮肤、毛囊：皮肤角质层与长轴平行；神经、直径在2mm内的小血管：其长轴与标本块长轴平行的长条消化道、大血管：长条片状，一侧是上皮、内皮细胞面，或依据目的去除无用的分层脑皮质、海马、耳蜗等：具有方向性或需横切或纵切面或需要组织中某一特定位置的标本；具体到某些组织，可能会有不同的要求，如观察海马CA1区，建议标本取片状或近似三角形的片状或梯形（比较好）。直观的说，小块直径约为1元硬币厚度；长度的