蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的保护作用.doc

蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的保护作用【摘要】 目的 研究蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，采用MTT法测定不同浓度蒲黄提取物对HUVEC的影响。以蒲黄提取物(100，50，10 mg/L)预处理细胞24 h，再加入100 mg/L oxLDL造成细胞损伤，取培养细胞上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，HUVEC用于测定细胞细胞间黏附因子(ICAM1)、单核细胞趋化蛋白(MCP1)mRNA的表达。结果 各剂量蒲黄提取物有显著的促进血管内皮细胞增殖的作用。与正常对照组比较，HUVEC经oxLDL作用后，细胞活性显著下降，LDH的释放量和ICAM1、MCP1 mRNA的表达显著升高;100、50、10 mg/L 蒲黄提取物可显著降低LDH活性,下调ICAM1、MCP1 mRNA的表达。结论 蒲黄提取物具有促进脐静脉内皮细胞增殖的作用，并可抑制OxLDL诱导的HUVECs ICAM1、MCP1 mRNA表达的上调和LDH的释放，从而起到保护血管内皮细 【关键词】 蒲黄提取物;内皮细胞;氧化低密度脂蛋白;细胞间黏附分子1;单核细胞趋化蛋白1;乳酸脱氢酶 血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的始动环节1。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是低密度脂蛋白致AS的关键步骤,可作为心血管疾病独立的危险因素直接损伤血管内皮细胞(VEC)2，损伤后的VEC合成和分泌的血管活性物质和细胞因子间平衡遭到破坏，导致内皮功能发生障碍，促使单核细胞与VEC黏附，这些改变对AS的形成起着始动的作用。蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲、东方香蒲或其同属植物的花粉，具有活血化瘀、止血、通淋之功效，对AS等多种心血管疾病具有良好的疗效。以往研究表明3，4，蒲黄提取物其具有降血脂、抗血小板聚集与抗血栓、增加冠脉流量及通过降脂来保护内皮细胞等作用。本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用oxLDL造成内皮细胞损伤模型，通过测定内皮细胞形态及功能的变化，探讨蒲黄提取物保护血管内皮、抗AS的机制。1 材料与方法1.1 仪器 低温超速离心机(美国贝克曼公司);酶标仪(奥地利SUNRISE);DU800光分度计(美国贝克曼公司);PTC200 DNA扩增仪、凝胶图像分析系统(美国BIORAD公司产品);电泳仪(北京六一仪器厂)。1.2 试剂 蒲黄(四川中药饮片有限公司,由重庆桐君阁曾宪策主任中药师鉴定为正品);胰酶(美国Gibco公司);内皮细胞生长添加物(美国BD公司);DMEM低糖培养粉(美国Gibco公司);优级胎牛血清(美国Gibco公司);oxLDL(中山大学,含量:2 mg/ml);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所);四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSD)(美国Sigma公司)。1.3 蒲黄提取物的制备 取蒲黄200 g，分别用70%乙醇回流提取3次，溶剂用量依次为8,6,6倍体积，提取时间为60,60,30 min5。水浴浓缩得深褐色药液，真空冷冻干燥，得黄色粉末，放置4保存备用。用时溶于DMSO中，制成含药浓度为100 mg/ml的母液，再用细胞培养液按照一定比例稀释，使DMSO终浓度0.1%，用0.22 m滤器过滤除菌后使用。1.4 HUVEC的培养及鉴定 取健康产妇分娩胎儿的脐带，75%酒精擦拭脐带表面及断端，剪去夹痕，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗静脉腔内残血，灌入预热0.25%胰酶和0.02% EDTA的混合消化液使之充盈，放置于37水浴箱中消化8 min后，收集消化液并用Hanks液冲洗静脉，合并两液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，以DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 g/ml、内皮细胞生长添加物100 mg/L)重悬细胞后，接种于培养瓶中，置于37、5% CO2的培养箱。待细胞贴壁后，换液1次，去除悬浮的死细胞和红细胞，以后每23天换液，细胞长至亚融合后，用含0.125%胰酶和0.01%EDTA的混合消化液消化传代，实验用第34代细胞。培养的细胞形态符合VEC特征，因子抗体免疫荧光染色阳性。1.5 MTT比色法检测蒲黄提取物对VEC的作用 将80%融合生长的VEC以混合消化液消化，收集细胞，完全培养基稀释后以2104/L的密度接种于96孔板。正常培养24 h后，洗去未贴壁细胞。换用无血清的培养基继续培养24 h，使细胞同步化。换用含5%胎牛血清的含不同浓度蒲黄提取物的DMEM培养液。蒲黄提取物以100 mg/L为最大浓度，依次为75、50、25、10 mg/L，共设5个浓度，每组8个复孔，并设对照组(含5%胎牛血清的培养基)及调零孔(5%胎牛血清培养基、MTT、二甲基亚砜)。培养24、48、72 h后，移出培养液，换入无血清DMEM培养液100 l/孔，并于每孔加入MTT(5 g/L)10 l。继续培养4 h后，吸弃原培养液，每孔中加入DMSO 100 l，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪490 nm波长处检测光密度值(OD值)。1.6 实验分组 按照随机化分组的原则，将细胞分为5组接种于24孔板，每组4个复孔。第一组为空白对照组：培养液为含5%血清DMEM液;第二组为oxLDL致伤组：培养液为含100 mg/L oxLDL的5%血清DMEM液;第三、四、五组为蒲黄提取物低、中、高剂量组：先用含10、50、100 mg/L 蒲黄提取物的DMEM培养液(含5%血清)预处理24 h，再加入100 mg/L OxLDL的培养液培养24 h;最后收集细胞及培养上清液待测指标。1.7 细胞培养上清液中LDH的测定 收集2.4项下实验留取细胞培养上清液，3 000 r/min，离心10 min。取50 l上清液，测定LDH含量(IU/L)，按试剂盒操作步骤进行。1.8 ICAM1、MCP1 mRNA表达水平的检测 按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，测定A260/A280为1.82.0。引物序列：ICAM1上游引物5GGCCAGCTTATACACAAGAACC3，下游引物5GCCATCCTTTAGACACTTGAGC3,长度为170 bp;MCP1上游引物5CAAACTGAAGCTCGCACTCTC3，下游5GCTGCAGATTCTTGGGTTGTG3,长度为361 bp。内参GADPH上游引物5GGAGAAGGCTGGGGCTCAT3，下游引物 5TGATGGCATGGACTGTGGTC3，长度为230 bp。反应体系为：ICAM1、MCP1和actin上下游引物各1 l，2Master混合物12.5 l，加双蒸水至总体积25 l。PCR条件为：94 3 min，94 30 s，58 30 s，72 1 min，30个循环，72 5 min，ICAM1 与内参GAPDH的退火温度为58，MCP1与内参GAPDH的退火温度为55。取扩增产物10 l，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，100 V 1 h电泳后，用凝胶图像分析系统进行灰度扫描及数据分析，以目的条带灰度值与内参GADPH条带灰度的比值表示ICAM1和MCP1 mRNA的相对定量。1.9 统计学分析 所有数据均以xs表示。采用SPSS13.0 软件对资料进行分析，多组均数比较采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)。方差齐时,两两间比较采用最小显著差(LSD)法,方差不齐时,两两比较采用Tamhane T法。2 结 果2.1 蒲黄提取物对HUVEC增殖能力的影响 MTT法证实蒲黄提取物的浓度在100 mg/L至10 mg/L时对HUVEC具有促增殖作用，24、48、72 h与同一时间点对照组相比,OD值显著增加(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。根据以上结果并参考相关文献，选用100、50、10 mg/L为后续实验的参考浓度。2.2 蒲黄提取物对oxLDL处理的HUVEC形态学的影响 光镜下观察，正常对照组细胞为单层，互不重叠，呈铺石状镶嵌排列，边界清楚;经与oxLDL共同孵育后，细胞间隙增宽，细胞收缩，胞膜皱缩，细胞边界不清，部分细胞脱落;蒲黄提取物各剂量组随着浓度增加，细胞间隙变窄，形态趋于正常。2.3 蒲黄提取物对HUVEC培养液LDH活性的影响 100 mg/L的oxLDL能明显增加HUVECs培养上清液中LDH活性，与空白对照组比较，具有非常显著性差异(P<0.01)。蒲黄提取物呈浓度依赖性地降低了LDH活性，与oxLDL模型组比较，具有非常显著性差异(P<0.01)，见表1。表1 蒲黄提取物对细胞培养上清液中LDH活性的影响模型组比较：1)P<0.01，下表同2.4 蒲黄提取物对oxLDL诱导HUVECs ICAM1和MCP1 mRNA表达的影响 与空白对照组相比，oxLDL能明显升高ICAM1和MCP1 mRNA的表达，具有非常显著性差异(P<0.01)。蒲黄提取物呈浓度依赖方式抑制ICAM1和MCP1 mRNA的表达(P<0.01)，见图1，表2。M：Marker;1：空白对照组;2：模型组(100 mg/L oxLDL);3：蒲黄低剂量组(10 mg/L)4：蒲黄中剂量组(50 mg/L);5：蒲黄高剂量组(100 mg/L)表2 蒲黄提取物对内皮细胞ICAM1和MCP1 mRNA表达的影响3 讨 论Ross指出，AS的发生是由于VEC和平滑肌细胞受各种危险因子如病毒、机械损伤、免疫复合物，特别是oxLDL的损伤，而使血管局部产生的一种过度的慢性炎性增生反应6。oxLDL不仅促进多种黏附分子和趋化因子的表达，有助于炎性细胞黏附于内皮，而且能作用于内皮细胞释放多种细胞因子，导致斑块的破裂、血栓形成以及冠脉痉挛79。本研究先采用MTT比色法测定不同浓度蒲黄提取物对人脐静脉内皮细胞的作用，再以人脐静脉内皮细胞oxLDL损伤模型来模拟动脉粥样硬化时血管内皮细胞的损伤，从细胞和分子水平来观察oxLDL损伤时人脐静脉内皮细胞ICAM1 mRNA、MCP1 mRNA和LDH表达的变化以及蒲黄提取物的影响，并初步探讨蒲黄提取物的分子作用机制。单核细胞黏附并迁移进入血管壁是动脉粥样硬化的早期事件之一。ICAM1是一种细胞表面的黏附分子，在血管内皮细胞表达最强，正常情况下仅少量表达。它可介导单核细胞与血管内皮细胞黏附，并进入内皮下间隙，促进炎症和血栓形成10，同时能促进内皮细胞合成MCP1。MCP1是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，使其迁移至内皮下形成泡沫细胞。最新研究发现，MCP1不仅是趋化激活剂，加速单核细胞的迁移过程，而且可以通过促进HUVEC的凋亡，血管平滑肌细胞的增殖，直接地参与AS及多种炎性疾病的发生和形成11。LDH是存在于内皮细胞的一种酶，当细胞损伤时细胞质内氧依赖性酶及细胞膜结构受到影响，细胞通透性显著增加，细胞内LDH产生增加，向细胞外的漏出也相应增加。因此,LDH释放量的多少可反映细胞膜损伤程度，LDH是细胞损伤重要指标之一。蒲黄具有活血、化瘀、通淋和缓解心腹疼痛的功效。由蒲黄和五灵脂为主组成的“失笑散”加味，对冠心病有很好的疗效。近年来，人们对蒲黄的药理成分进行了一系列较为深入的研究，所分得的化合物主要有以下几种：黄酮类、甾类、酸性成分、氨基酸类、多糖类成分及无机成分等。其中黄酮类化合物是蒲黄中的主要有效成分4。蒲黄乙醇提取物主要含黄酮类成分，它可以间接说明蒲黄的药理活性。既往研究表明，蒲黄的内皮保护功能是通过降血脂来实现的12，13。本研究表明，在受到oxLDL应激时，内皮细胞