（分析化学专业论文）蛋白质与荧光探针的作用及其分析应用研究(1).pdf

摘要 蛋白质是重要的生物大分子。人们对蛋白质的研究，主要集中在蛋白质定量分析和作 用机理两个方面。蛋白质定量测定既是生物化学和其它生物学科中经常涉及的分析内容， 又是临床检验中诊断疾病及评价疗效的重要指标，同时也是许多生物药物分离提纯中质量 检验及食品检验中常见的分析项目。荧光分析方法由于其灵敏度高、选择性好、方法简便 等优点，在生物大分子定量测定中备受青睐。近年来荧光探针染料与蛋白质结合后的荧光 特性、动力学特征、电化学特征、自聚特征等受到关注，并以此为基础建立分析方法。荧 光探针技术最大的特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围，进一步建立高灵敏 度、低检测限的荧光探针定量测定蛋白质的方法具有重要意义。 本论文主要包括以下两个方面的内容： 1 概述了蛋白质化学基础，综述了蛋白质定量分析的主要方法及其在生物化学、药学、 食品和临床医学等方面的应用。 2 探索新的性能优良的荧光探针。 以阴离子染料4 ，5 二溴荧光素( 简称r ) 为荧光探针，基于r 与蛋白质结合使r 在荧光最大 发射波长5 3 0 n m 处的荧光强度降低，其降低程度与蛋白质浓度在一定范围内成线性关系建 立了一种新的快速简单的荧光猝灭测定蛋白质的方法，该法线性范围为o 1 5 m 扎，检测 限为4 毗l ，对1 0m g l 的h s a 的1 1 次平行测定相对标准偏差为3 6 ，说明本法准确可靠。 以酸性染料铝试剂作为测定牛血清白蛋白的荧光探针。在b s a 浓度为o 5 0 m l 范围内， 该体系荧光强度与b s a 浓度之间存在良好的线性关系。测定b s a 的检测限为8 毗l ，对3 0 m g l 的b s a 的1 1 次平行测定相对标准偏差为4 3 。该法用于实际样品的测定，与考马斯亮 蓝法测定的结果相吻合。 二聚体荧光染料作为一类新的荧光探针近年来引起了人们极大的兴趣。本论文以阳离 子染料碱性藏花红( s n 在阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠( s d b s ) 存在下形成的现场 弱荧光二聚体为荧光探针，建立了测定蛋白质的新方法。研究发现，s 1 在s d b s 的作用下， 自聚程度增加，体系荧光降低。而加入蛋白质后体系荧光增强，且增强程度与体系中的蛋 白质的量呈线性关系。方法的线性范围为o 4 0 m g 几，检出限为3 劬g l ，将其直接应用于 人血清蛋白的测定，结果令人满意。以4 ，5 二溴荧光素在阳离子表面活性剂溴化十六烷基 三甲基胺存在下形成的现场弱荧光二聚体作为测定人血清总蛋白的荧光探针，方法的线性 范围为o 2 0m g 几，检出限为5 g l 。对1 5 om 班的h s a 的1 1 次测定结果平均值为1 4 8 1 t m l ，相对标准偏差为0 9 4 。与经典的考马斯亮蓝法相比较，二者符合良好。 关键词：蛋白质；荧光探针；荧光猝灭；染料二聚体；表面活性剂 i i a b s t r a c t p r o t e i n sa r ei m p o r t a n tb i o l o g ym a c r o m 0 1 e c u l e s t h ed e t e 蛐i i l a t i o no fp r o t e i i l si sn o t0 n l y 靠e q u e n t l yt h ea i l a l y t i c a lc o n t e n ti nt h ef i e l d so fc h e m i s t r y ，b i o c h 啪i s t r ya n do t h e rb i o l o g y s u b j e c t s ，b u ta l s oa ni m p o n a n ti n d e xf o rd i a g n o s i n gd i s e a s ea n de v a l u a t i n gc u r a t i v ee f f e c t si d i n i c a lt e s t s ，a n ds i m u l t a n e o u s l ya l s oaf a m i l i a ra n a l y t i c a li t e mi nt h eq u a l i t yt e s to fm o s t s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nb i 0 1 0 9 ym e d i c a m e n ta i l df o o dt e s t s s 0i ti sv e r yi m p o n a mt of i d n e wn u o r e s c e n c ep r o b e sw i t h1 l i g hs e n s i t i v i t ya n dl o wd e t e 硝o nl i m “ 1 ht l l ep 印e r p m t e i i lc h e m i s t r yb a s ew a ss u m m a r i z e d ，a n ds o m em a j o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s m e t l l o d so fp m t e j na 】1 dt h e i ra p 辟i c a t i o nj 1 1t h e 矗c l d s0 fb i o c h 锄j s t m e d i c j n e ，da 1 1 d c l i n i c a lm e d i c i i l ew e r er e v i e w e di nd e t a i l s 2 s e a r j c hf o rt h en e wn u o i e s c e n c ep i o b e 4 ，5 一d i b r o m o n u o r e s c e j i l ( r ) b i n d i n gt op r o t e i n sc a u s e dad e c r e a s ei i lm en u o r e s c e n c e m a x i m u m0 fra t5 3 0 m ，t h ei n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gw a sd i r e c t l yp r o p o n i o n a l t o h u m a s e m ma l b m i n 咂s a ) n t e n t b a s e do t l l i s ，an e wf a s ta n ds i m p l cn u o r e s c e n c e q u e n c h i n gm e t h o df o rt h ed e t e m l i n a t i o no fp r o t e i i l sw a sd e v e l o p e d u n d e rt h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s ，m el i n e a rr a n g eo ft h i sa s s a yw a s0 1 5 m g ，la n dt h ed c t e c t i o nl i l n i tw a s4 毗l t h em e t h o dh a db e e na p p l i e dt ot l l ea i l a l y s i so fh 啪a ns e m ms 砌p l e sa n dt h er e s u l t sw e r ei n a g r e e m e n tw e l lw i t ht h o s eo b t a i n e d b yt h ec o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg - 2 5 0 ( c b bg 一2 5 0 ) m e t h o d ， w h j c hj n d i c a t e dt h a tt h em e t h o dw a sn o to n l ys e n s i t i v eb u ta l s or e l i a b l e t h ee l l a i l c e m e n to f t h en u o r e s c e n c ed u et ot t l ei n t e r a c t i o no fa u r i n t r i c a r b o x y l i ca c i d ( a t a ) w i t hb o v i n cs e r i l m a l b u m i n ( b s a ) w a si n v e s t i g a t e d i tw a sc o n s i d e r e dt h a tt h ei m e r a c t i o nb e 觚e e na t a a n db s a g e n e r a t e dc o m p l e x ，a tt h es 锄et i m et l l a tt h ee m i s s i o ns p e c t r u mo fa t a b s as h o w e dar e d s h i f t t h ej n c r e a s e0 fn u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h e m p l e x 、v a sl i n c a rw i t h 咖o u n to fb s a t 1 l ed e t e m i n a t i o nc o n d i t i o sw e r eo p t i l i z e d t h el i n e a rr a n g ew a so 5 0 m g 几a n dt h e d e t e c t i o nl 曲i tw a s8 0 lt h i sm e t h o dl l a db e e na p p l i e dt od e t e 瑚i n a t i o no fb s ai ns a m p l e s w i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e r ew a sas e l f - p o l y m e r i z a t i o ne q u i l i b r i u ms y s t e mb e t w e e nt h ec a t i o no ft h en u o r e s c e n t d y e s a f r a l l 血et a n di t sd i m m e li nt h ep r e s e c eo fa p p r o p r i a t ea m o u n t so fa n i o n i cs u d a c t a me g s d b s ，t h ea b o v em e n t i o n e de q u i l i b r i u mc o u l db ea d j u s t e db yt h eq u a n t i t a t i v ea d d i t i o no f l t l p r o t e i n ，t h u sl e a d i n gt oar e g u l 盯c h a i l g ei nn u o r e s c c n c ei n t e n s i t yo ft h es y s t e m b a s e do nt h i s p h e n o m e n o n ，m ep m p e r t i e so ft h ea b s o r p t i o ns p e c t m ma l l df l u o r e s c e n c es p e c t n l mo fs y s t e m w e r es t u d i e d ，a n dan e wf l u o f e s c e n c ep r o b eo ft h ed e t e m i n a t i o n0 fp r o t e i nw a se s t a b l i s h e d i t w a sf o u n dt h a ts tw a sa p tt od i me _ r i z em o r e e a s i l yi nt h es o l u t i o na d d e da p p r o p r i a t ea m o u n t so f a n i o n i cs u r f a c t a i l t b e c a u s eo ft h ed j m e r i z a t i o n ，i t sf l u o r e s c e n c ei l l t e n s i t yd e c r e a s e d ，w h e r e a s a d d i t i o no fp r o t e i nc a u s e dt h ed i m m e rt od e p o i y m m z ea i l dt h cs y s t e mn u o r e s c e n c ei n c r e a s e d a l i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e 血en u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e sa n ds e m ma l b u m i nc o n c e n t r a t i o nw a s f o u n di nt h er a n g eo fo 4 0 m 叽a i l dt l l ed e t c c t i o nl i m i tf o u n dw a s3 4 g 几1 1 1 es i g l l m c 趾t f e a t u r e so ft h i sm e t h o dw e r ci t sr 印i d i t yo fr e a c t i o n ，h i 曲s e n s i t i v i t y a c c u r a c ya i l ds e l e c t i v i t y t h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e m l i n a t i o no ft o t a lp r o t e i n si i lr c a lh u m a i ls e n l ma d s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 、e r eo b t a i n e d t h ei l ls i t u4 ，5 一d i b r o m o n u o r e s c e i n ( r ) d i m e rw i t hw e a k n u o r e s c e n c ei nt h es 0 1 u t i o no fc a t i o i l i cs u r f a c i a t ( 1 r 恒a bw a su s e da sak i n do ff l u o r e s c e n c e p r o b e t h el i n e a rr a n g ew a so 2 0 m g ，la n dt h cd e t e c t i o nl i m i tw a s5 舡lt h er s df o r t h e d e t e r m i n a t i o no f1 5 om g lh s aw a s0 9 4 s ot h em e t h o dw a sa c c u r a t ea n dr e l i a b l e t h e d e t e m i n a t i o nr e s u l t sa c h i e v e db yt h i sm e t h o dw e r ei ng o o da 掣e e m e n tw j t hd i n i c a ld a t a p m v i d e db yt h eh o s p i t a lw h e nt h i sm e t h o dw a su s e dt od e t e 珊i i l a t et o t a lp r o t e i n si nr e a lh u m a n s e m m s a m p l e s k e y w o r d s ：p r o t e i l l s ；n u o r e s c e n c ep m b e ；f l u o r e s c e n c eq u c n c h i n g ；d y ed i m m e r ；s u 血魄m t 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光， 而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。利用某些物质 被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光以进行该物质的定性分析和定量 分析，称为荧光分析。 荧光分析从一建立起，就引起人们普遍的重视，并很快在实际分析研究中推广使用。 荧光分析发展至今，己被广泛应用在工业、农业、医药、卫生、司法鉴定和科学研究等各 个领域中。可以用荧光分析鉴定和测定的无机物、有机物、生物物质、药物等的数量与日 俱增。荧光分析法越来越成为分析化学工作者所必须掌握的一种重要分析方法。 荧光分析法和一般的紫外一可见分光光度法相比，具有许多突出优点：( 1 ) 灵敏度高， 荧光分析法一般可超过一般光度法二至三个数量级，可达到1 0 培，甚至1 0 1 1 数量级；f 2 1 选择性高；( 3 ) 具有多种测定参数，如荧光寿命、荧光量子产率、荧光各向导性、激发波 长、发射波长等；( 4 ) 具有多种检测技术和方法，如同步荧光、导数荧光、偏振荧光、三 维荧光、时间分辨荧光分析法、荧光动力学分析法等吐正是由于荧光分析方法的灵敏度 高、选择性好、方法简便等优点，因而在生物大分子定量测定中备受青睐。而且随着荧光 技术的发展，荧光分析不再仅仅局限于一些具有强荧光的物质的分析，也开始广泛应用于 无荧光或弱荧光的有机和生物物质的分析，这就是利用某些试剂与非荧光或弱荧光物质以 共价或其他形式结合形成发荧光的络合物或聚集体进行测定，即所谓“荧光探针”技术。用 作探针的试剂必须具备以下条件：( 1 ) 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性结合， 且结合得比较牢固；( 2 ) 探针的荧光必须对环境条件灵敏：( 3 ) 结合的探针不影响被研究的 大分子的结构和特性。 近年来荧光探针与蛋白质结合后的荧光特性、动力学特征、电化学特征、自聚特征受 到关注，并以此为基础建立分析方法。其测定机理是根据蛋白质对探针分子荧光强度的影 响，探针分子荧光强度的变化与加入蛋白质的量有明显的线性关系，从而可以进行定量测 定。荧光探针的引入，也可使蛋白质分子发生荧光猝灭或荧光增强现象。荧光猝灭( 又叫荧 光熄灭1 是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理 或化学作用过程。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的 第一章绪论 过程。荧光猝灭主要分为静态猝灭和动态猝灭两种。前者是由于荧光发色基团与猝灭剂形 成了不发荧光的复合物而发生荧光猝灭，后者则是由于猝灭剂在激发态寿命时间内扩散或 插入到蛋白质的荧光发色基团中，使之不发射光予而直接返回到激发态。近年来，二聚体 荧光染料作为一类新的荧光探针引起了人们的极大兴趣。许多有机分子，尤其是荧光染料 在水溶液中浓度较大时或在极性较大的有机溶剂中能够形成二聚体【3 1 ，其紫外一可见吸收 光谱的共同特征是：( 1 ) 吸光度与浓度的关系偏离了朗伯一比耳定律；( 2 ) 二聚体吸收峰位 置相对单体吸收峰发生位移，但两者的吸收光谱重叠在一起。另外，二聚作用对染料的光 物理性质有较大的影响，二聚体激发态内转换作用速度很快，往往导致不发荧光或荧光很 弱，大大降低染料的荧光量子产率。二聚体的形成目前主要有两种方式：人工合成和现场 形成。文献资料表明1 4 一”，荧光染料二聚体作为荧光探针已用于d n a 的定量测定，具有灵 敏度高、线性范围宽的特点。蛋白质和d n a 都是生物大分子，荧光染料二聚体作为测定 蛋白质的荧光探针也有一些报道【8 _ 1 0 】，以染料二聚体作为荧光探针，建立蛋白质定量测定 的新方法具有一定的实用价值。 1 2 蛋白质的化学 蛋白质、核酸和多糖是三类主要的生物大分子，其中蛋白质是生物体的重要组成部分。 蛋白质在重量上占细胞干熏的一半以上。肌肉、皮肤、血液和毛发等的重要成分是蛋白质， 蛋白质参与几乎所有的生命活动过程。总之，蛋白质具有极其重要的生物学意义。 蛋白质是由不同的a 氨基酸按一定的顺序通过酰胺键( 蛋白质化学中专称肽键) 缩 合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的生物大分子。其生物功能主要表现在： 生命活动所需要的许多小分子物质和离子，是由蛋白质来运输的；生物的运动离不开蛋白 质；生物体的防御系统，用以防御致病微生物或病毒侵害而产生的抗体，也是一类高度专一 的蛋白质，起到保护机体的作用。另外，蛋白质还是一切生物体的细胞和组织的主要组成成 分，是生命活动的物质基础。生物的遗传性状都是通过生物自身合成的各种不同的蛋白质 互相作用表现出来的。生物体的代谢活动和各种生理现象都是种种功能不同的球蛋白参与 作用的过程。例如：酶的催化作用；蛋白质激素调节代谢的作用；运载蛋白质输导作用； 细胞色素蛋白质传递电子的作用；糖蛋白的细胞识别作用；免疫球蛋白抗感染的作用等等。 因此，蛋白质与生命息息相关，没有蛋白质就没有生命活动【1 1 】。 1 2 1 蛋白质的化学组成 2 第一章绪论 根据对蛋白质的元素分析表明，组成蛋白质的元素有：碳( 5 0 ) 、氢( 7 ) 、氧( 2 3 ) 、 氮( 1 6 ) 和硫( o 3 ) 。有些蛋白质还含有少量磷、铁、铜、碘、锰、锌和钼等元素。大多 数蛋白质含氮量比较接近而恒定，一般为1 5 1 7 ，平均为1 6 ，这是蛋白质元素组 成的一个重要特点，也是凯氏( 均e d a h l ) 定氮法测定蛋白质含量的计算基础：蛋白质含量= 蛋白氮0 1 6 。 1 2 2 蛋白质的结构 蛋白质的性质与功能决定于蛋白质的结构。深入了解蛋白质的结构对于生物化学和分 析化学都是十分必要的。因为对于生物化学家来说，不了解蛋白质的结构，就不能阐明蛋 白质分析方法的机理，也就不能对于蛋白质分析方法的改进与创新予以理论上的指导。 一、蛋白质结构的基本单位氨基酸( a m i n oa c i d ) 蛋白质是高分子有机化合物，结构复杂，种类繁多，但其水解的最终产物都是氨基酸。 天然存在的氨基酸约1 8 0 多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸只有2 0 种，这些氨基酸 称为基本氨基酸。除脯氨基酸外，这2 0 种氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的a 碳 原子上都有一个氨基，因而称为a 氨基酸。各种a 一氨基酸的区别在于侧链r 基的不同。 按r 基的化学结构，2 0 种氨基酸可以分为脂肪族、芳香族和杂环族三类，其中以脂肪族 氨基酸为最多( 1 5 种) 。但从光学性质来看，以芳香族的苯丙氨酸p h e 、酪氨酸t y r 和杂 环族的色氨酸1 却最为重要，这三种氨基酸在紫外区有吸收而且能发射荧光。 按r 基的结构和性质，2 0 种氨基酸可以分成四组：1 非极性r 基氨基酸；2 极性不 解离r 基氨基酸；3 酸性r 基氨基酸；4 碱性r 基氨基酸。其中，碱性r 基氨基酸值得 注意。这类氨基酸包括赖氨酸l y s 、精氨酸a 唱和组氨酸h i s 三种氨基酸。赖氨酸脂肪链 的e 位上有一个氨基；精氨酸含有一个带正电荷的胍基；组氨酸有一个弱碱性的咪唑基。 在p h 低于7 的酸性溶液中，这三种氨基酸的r 基质子化，从而使蛋白质带净正电荷。当 某些染料分子( 酸碱指示剂) 与带正电荷的蛋白质靠近时，可发生质子离解作用而使染料 的颜色发生变化，从而可用于蛋白质的分析。 二、多肽( p o i y p e p 廿d e ) 实验证明，蛋白质分子是由氨基酸构成，氨基酸之间是通过肽键相连的。一个氨基酸 的氨基同另一个氨基酸的羧基相连接可以使氨基酸相互反应形成肽。在这种反应中，来自 一个氨基酸的氨基( n h 2 ) 中的h 与另一个氨基酸的羧基( c o o 脚中的o h 结合生成h 2 0 ， 然后两个氨基酸残基通过肽键连接。肽键是蛋白质分子中基本的化学键，也称酰胺键。最 简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽，其中包含一个肽键。含有三个、四个、五个氨基 第一章绪论 酸的肽分别称为三肽、嬲肽、五肽。肽链中的氨基酸由于参与默键的形成已经不是原来完 整静分子，因兹称势氨潦酸残基。 氨基酸( 6 3 0 个残基) 通过肽键连接形成的短链称为多肽。当氨基酸遵接在一起的 数目达4 0 个或更多( 分子量5 0 0 0 以上) 时，其腻键就具有蛋囱质的性质。德是，在分予 量方瑶，多歉与蛋鑫痿并无绝对静分器线。一般认湾，多蔌稻爨鑫质的禳本麓副在于蛋良 质一般含谢a - 螺旋结构，这种结构的主要功能是稳定蛋白质的总的构象；多肽般没有a 螺旋，其构象有很大的w 交性和可塑性。 蛋鲁矮和多获是稳象、往质和功麓帮不霹静两炎物质。蛋鑫耩是生物体静功能大分子， 负责完成缴物体所需的备种功能，如飘的运输、嫩化反应的催化、肌肉收缩、免疫反应、 血液凝固簿；丽生物体内的活性多救则属于体内的化学信息传递物质，如生长、发育、生 殖殴及兴裔等生命现象，都需要多获激素( 信怠分子) 发挥俸掰。 三、蛋白质( p m t e i ) 的分子结构 生物器蛋自质的种炎在1 0 1 0 l o 舱数量级。造成糖类如此众多戆原因重要爨2 0 萃申氨基 酸在敢链中的捧列顺序不同，这种顺序异构现象愚餐自履生物功熊多样性和稀藩特异性的 基础。 蛋白黢分子没有严掺盼定义，一般逸说，它是舆骞完整生物功能瓣蛋白质豹羧小单位。 蛋白质分子其有一条或数条多放链。多获链不是一条直线，也不是任意的线溺，而是在三 维空间有特定的走向与排布。 蛋自璇是具有三缨空阉结构的赢分子物质，缎成蛋自质静肇体是氨基酸。数卡个或更 多个氨基酸残基缀成的脊确定梅象的多欣，通常称为蛋白质。戴基酸残蒸的封 列次序通常 称为“氨基陂序列”，亦称为蛋白质的级结构。鬣自质的许多性质和功能，决定于它的一 级结掏。一缀结构决定蠢级结掐，莰宠蛋包凌静生物学功麓。在永溶渡中，滋自震分子并 不是像一缀结构勇5 样以线性形状存在。实际上，鬣箔质链经过葳复的盘绕曲折，形成不同 层次的高级结构。首先朔邻近的一段肽链中的氨撩酸残基，经过一定程度的撤绕和折叠， 影残二级缝榴。其次，在形残二级缝糖瓣基础上，凝自矮分予遴一步盘绕秘掇燕，搜褥整 个分子呈现一定的外形，分子内部各个氨基酸残蘩之问，各段二缀结构模块之间形成一定 的空间布周关系，这就撼蛋白质的三级结构。许多鬣自质仅有一条肽链，到三缀结构为止， 魏：飘红鬃爨、溶墓酶笛。还有一些爨鱼凌由嚣条以上驮链缀成，每条获链郝有冀自身豹 一、二、三级结构，构成各自特征形状，然后，几条肽链之间还有一个空问稚简问题，形 成各条肽链之间相互关系的特定格局，使整个蛋囱质分子具有特定的形状，邀就是四级结 4 第一章绪论 构。有些较大的蛋白质分子有四级结构，如：血红蛋白、乳酸脱氧酶等。近年来，人们在 二级和三级结构之间又设置了两个结构层次，分别称为结构域和特征序列。它们包含若干 个二级结构成分，并与蛋白质分子的某种功能有关。 四、纤维状蛋白( 舫m sp r o t e i n ) 和球状蛋白( g i o b l l l e rp m t e i n ) 天然蛋白质按其分子外形的对称程度，可分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。纤 维状蛋白质分子的长短轴比一般大于1 0 ，外形类似细棒或纤维，对称性差，一般不溶于 水，不易为蛋白酶水解，有一定的弹性；其氨基酸组成亦不同于球状蛋白。它在动物体内 起着支持和保护作用。球状蛋白质长短轴相差较小，分子对称性好，外形接近球状或椭球 状。在球状蛋白分子中，多数非极性侧链藏于分子内部，而多数极性侧链基团则位于分子 表面而形成亲水区，故一般球状蛋白溶于水。这些极性基团的种类、数量和分布与蛋白质 的生物功能密切相关。球状蛋白分子表面还有一些特定的凹陷部位，可与非蛋白配体结合， 如酶的活性中心等。总之，球状蛋白的构象较纤维状蛋白复杂，一般天然存在的蛋白质大 多数属于球状蛋白，如酶类、血清白蛋白、免疫球蛋白、胰岛素等。 1 2 3 蛋白质的特性 一、蛋白质的变性 鸡蛋清能够溶于水，但经过煮沸之后就凝固。这是众所周知的蛋白质变性现象。蛋白 质的高分子特性形成了复杂而特定的空间构象，从而表现出蛋白质特异的生物学功能。某 些物理的和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失 和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。蛋白质变性之后，其物理性质 ( 如溶解度、结晶能力、旋光值、紫外吸收光谱和荧光光谱) 、化学性质( 如水解速度、 与某些试剂反应的能力等) 以及生物性质( 如酶的催化活性、激素的生理调剂能力以及抗 体与抗原的专一结合能力等) 都会发生变化。因此，蛋白质变性对于生物化学和分析化学 都是一个重要的问题。 能够引起蛋白质变性的因素是很多的。这里讨论如下几个因素： ( 一) 温度蛋白质在5 0 6 0 的溶液中，经过一定时间，往往发生变性。热变性有可逆和 不可逆之分，但多数是发生凝聚和沉淀的不可逆变性。温度升高使分子内的振动增强，从 而破坏了维系空间结构的次级键，使蛋白质变性。 ( 二) 酸、碱大多数蛋白质在p h 4 ，1 0 之间是稳定的，超过这个范围，就发生变性。酸碱 能引起蛋白质变性的原因是在蛋白质肽链上连接着酸性氨基酸残基( a s p 和g 1 u ) 和碱性 氨基酸残基( h i s 、l y s 和a 曙) ，因而在多肽链的不同部位的侧链基团之间存在着静电吸 e 第一章绪论 引或排斥作用。静电吸引有助于维持蛋白质的构象，静电排斥不利于蛋白质构象的稳定， 导致结构松散。由于蛋白质的结构不同，其电荷基团的分布不同，因而不同蛋白质对酸碱 的稳定性不同。 ( 三) 表面活性剂表面活性剂( 如十二烷基硫酸钠s d s ) 很容易与蛋白质结合。原因是 s d s 分子有一个非极性的脂肪族长链，还有一个带负电荷的硫酸根。s d s 的脂肪族长链 可与蛋白质内部的非极性基团相互作用，而带负电荷的硫酸根可溶于水中，在s d s 的作 用下，蛋白质分子的构象发生变化：寡聚体离解成亚基，亚基由球状变成杆状。杆状的 s d s 一蛋白质复合物，其表面上分布着大量的s d s 负电荷基团，因而易溶于水。阳离子 表面活性剂( 如溴化十六烷基三甲铵a 卟t a b ) 和非离子表面活性剂( 如t r i t o nx 一1 0 0 ) 对于蛋白质也有变性作用。 ( 四) 有机溶剂乙醇、甲醇等有机溶剂可以使蛋白质变性。一般认为，有机溶剂可以影 响蛋白质分子中的静电力、氢键和疏水作用力，从而导致蛋白质构象的变化，这种变化主 要表现为螺旋度的增加。 ( 五) 盐盐对蛋白质构象的影响也是一个值得注意的问题，因为在蛋白质的分离提纯、 结构与功能研究以及蛋白质的分析中，广泛地使用了各种盐以维持一定的离子强度。不同 的盐对蛋白质的构象有不同的影响。盐对蛋白质构象的影响机制有两种考虑：一是离子对 于蛋白质内部的极性基团有直接的作用，例如阴离子可以结合在带正电荷的氨基酸残基 上，从而影响蛋白质的构象；二是离子可以改变溶剂水的结构，从而影响水分子与蛋白质 极性基团的相互作用，间接地影响蛋白质的构象。 二、蛋白质的等电点 蛋白质是由氨基酸组成。氨基酸分子含有氨基和羧基，它既可接受质子，又可释放质 子，因此氨基酸是两性电解质。蛋白质分子中除两末端有自由的a n h 2 和a c o o h 外， 许多氨基酸残基的侧链上尚有不少可解离的基团，如一n h 2 、一c 0 0 h 、一o h 等，所以 蛋白质也是两性物质。蛋白质在溶液中的带电情况主要取决于溶液的p h 。使蛋白质所带 正负电荷相等，净电荷为零时溶液的p h ，称为蛋白质的等电点( p i ) 。各种蛋白质具有特 定的等电点，这与其所含的氨基酸种类和数目有关。一般地说，含酸性氨基酸较多的酸性 蛋白，等电点偏酸；含碱性氨基酸较多的碱性蛋白，等电点偏碱。当溶液的p h p i 时， 蛋白质带负电荷；p h p i 时，则带正电荷。体内多数蛋白质的等电点为5 左右，所以在 生理条件下( p h 为7 4 ) ，它们多以负离子形式存在。 蛋白质的两性解离与等电点的特性是蛋白质极重要的性质，对蛋白质的分离、纯化和 第一章绪论 分析等都具有重要的实用价值。 1 3 蛋白质定量分析研究进展 蛋白质是人体中重要的生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和必不可少的， 同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复制等都有密切关系。蛋白质 的功能很多，它与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质的逆转、遗传、生命的 起源和生物进化等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。正是由于蛋白质本身的重要 性，所以对它的研究一直受到人们的重视。人们对蛋白质的研究，主要集中在蛋白质定量 分析和作用机理两个方面。研究蛋白质与蛋白质探针的相互作用机理，能够间接地认识和 探索生物大分子的结构、性质和行为。蛋白质的定量分析是生物化学、药学、食品及临床 分析中常涉及的内容，也是临床诊断疾病及检验疾病治疗后的健康状况的重要指标。由于 蛋白质在体液中的含量可作为人体营养健康、疾病诊断的重要指标，如尿蛋白的含量是诊 断肾炎和糖尿病的依据之一，正常人2 4 h 尿中蛋白质的含量在2 0 8 0 m g ，超过了这一限 度为不正常值，是发病的征兆。又如血清蛋白是人体内的一种重要生命物质，它在体液中 的含量可作为人体营养健康、疾病诊断等的重要指标。定量分析蛋白质也是许多生化药物 的分离提纯和质量检验中最常用的手段，如酶、多肽、激素、蛋白质的分离、纯化等。因 此蛋白质的定量测定在生命科学、临床医学、食品分析和化学研究等领域占有十分重要的 地位。近年来，对蛋白质分离和分析方法的研究日益增多，引起了科学工作者的兴趣和广 泛关注；同时用于定量测定蛋白质的一些新的分析技术的出现，又促进了生命科学的不断 发展，所以蛋白质定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃。测定蛋白质含量的方法很 多，应用蛋白质内源光谱性质的分析方法只有紫外光谱法和荧光光谱法，两种方法在检测 灵敏度方面常常不能满足要求，为此，人们发展了各种光谱探针和荧光探针分析法。 蛋白质定量测定的方法很多，不同的方法各有其使用特点。本文较全面地介绍了蛋白 质的定量测定方法如最早的凯氏定氮法、浊度法和目前研究最多、应用最广、操作较为简 便的吸光光度法、荧光光度法，还有新近发展起来的共振瑞利散射法、免疫法、高效液相 色谱法、毛细管电泳分析法。 1 3 1 凯氏定氮法2 。”l 凯氏定氮法由k e l d a l l l 于1 8 3 3 年首先提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微 量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种。该法是利用一般蛋白质含氮量平均 7 第一章绪论 在1 6 ，可将测定的含氮量折算成样品中蛋白质的含量。其原理是：通过样品与浓硫酸 和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品 中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以 标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸的消耗量可计算出蛋白质的含量。凯氏法的优点是 适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定，但操作比较 复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高。 1 3 2 浊度法( 比浊法) 【1 4 】 利用沉淀剂与蛋白质反应产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白质浓 度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁，作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白， 该法因其操作简单、快速、试剂易购，目前仍为临床常规检查所用。 1 3 3 吸光光度法 一、双缩脲法陋1 6 】 此法是一种在临床中得到大量使用的蛋白质定量方法。由于蛋白质分子中含有肽键 ( c o n h ) ，与双缩脲结构相似，能发生双缩脲反应而生成紫红色配合物，根据该配合物 在5 6 0 m 处的吸光度来测定蛋白质含量。本法的缺点是灵敏度不高，干扰较大。郑铁生 等【1 7 1 根据双缩脲在碱性条件下除了能与c i l ( i d 形成络合物，还能与c o ( ) 、n i ( i i ) 、z 1 1 ( i i ) 等结合，建立了n i ( i i ) 一双缩脲反应测定血清总蛋白的方法，但灵敏度仍然不高。 二、酚试剂法【1 8 该法是利用蛋白质分子中的氨基酸的酚基与f o l i n 试剂中的磷铝酸或磷钨酸反应，生 成蓝色化合物，以分光光度法测定，从而确定蛋白质的含量。 三、l o w r v 法 1 4 【1 9 _ 驯 k l w r y 法是定量测定蛋白质的另一种常用方法。该法是结合双缩脲法中钼盐反应与 f 0 l i n _ c i o c a l t c a u 试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基1 姐和1 b 的迅速反应与肽链、 极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应，而把磷铝酸发色团还原成暗蓝色，反应产物的最 大吸收峰位于7 5 0 蛳处，在一定条件下，吸光度与蛋白质浓度成正比。l a r s o n 等【2 1 】利用 还原剂二硫苏糖醇( d r n 缩短了方法的分析周期且提高了吸光强度；康建等 2 2 】利用这一优 点，并作了某些修改，对巯基化合物的干扰清除效果较好；石磊掣纠用连二硫酸钠代替 d t t ，比d t t 体系显色稳定而且价格便宜。 四、直接法 该法是通过直接测定蛋白质水溶液在2 8 0 n m 处的光吸收进行定量分析，该法灵敏度 第一章绪论 不高且欠准确。 五、染料结合的光度法 在蛋白质的临床分析中，基于蛋白质与染料结合的反应是应用最为广泛的光度分析方 法，该法通常为测定白蛋白的方法，这是因为白蛋白含有碱性氨基酸残基，在酸性条件下 带正电荷，具有与阴离子染料结合的能力，而白蛋白以外的其它蛋白质缺乏这种性质。在 对白蛋白，尤其是血清白蛋白和尿蛋白的测定中，染料结合法具有简便、快速、经济、准 确的特点【川，受到人们的普遍关注，从而得到广泛的应用。目前，在染料结合法测定蛋 白质的方法中使用最多的染料主要有以下几类： ( 一) 酸性三苯甲烷类染料 1 、溴甲酚绿( b m m c r e s o lg r e e n ，b c g 法) b c g 是染料结合中使用最早也最为广泛的染料。在p h 为4 2 时，b c g 与蛋白质的 结合反应使溶液由黄变绿，最大吸收峰由4 4 5 砌移至6 2 8 n m 处，吸光度与蛋白质浓度成 正比【2 5 ，方法具有简便、快速、灵敏、精密度好、试剂稳定等优点，不足之处在于b c g 与白蛋白反应的非特异性【狮，有人利用这种非特异性反应，将b c g 用于总蛋白的测定【2 7 1 。 2 、溴甲酚紫( b m m c r e s o lp u r p l e ，b c p ) 法 a d r e w 【2 3 】证明了b c p 与白蛋白反应的特异性。b c p 法测定白蛋白具有特异性高，球 蛋白干扰小，瞬间反应，呈色稳定，线性关系及重复性好等特点网。 3 、考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c o o m e s s i eb r i l l i a n tb l u eg 2 5 0 ，c b b ) 法 c b b 在酸性溶液中呈红棕色，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰从4 6 5 n m 移至 5 9 5 n m ，在一定条件下，蛋白质的浓度与吸光度值成正比。该法具有灵敏度高，操作简 便，显色稳定，反应5 m i n 内完成，干扰少等特点【3 0 3 “，r e a d 等已提出不少改进方法1 3 2 1 ， 但仍有待于进一步研究。 4 、溴酚蓝( b r o 玎l p h o n 0 1b l u e ，b p b ) 法 b p b 【3 3 】与白蛋白的结合反应导致溶液吸收光谱发生变化，最大吸收峰位于6 1 0 砌处， 在一定条件下，吸光度值与白蛋白的浓度成正比，反应速度快，稳定性好。文献【3 4 】还报 道用“蛋白质误差”原理用于尿中总蛋白的测定。 ( 二) 氧杂葸类染料 在p h 为3 左右的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液中，藻红( e r y t h m s i nb ，e b ) 与蛋白质反 应导致溶液的最大吸收峰由4 9 8 衄和5 3 0 i l m 移至5 4 5 舯处，吸光度值与蛋白质含量成正 比 3 5 】，方法简单、快速、准确、重视性好、干扰小，但对反应酸度要求较为苛刻3 6 1 。 9 第一章绪论 ( 三) 羟基葸醌类化合物 在酸性条件下，茜素红与蛋白质的反应产物在5 4 0 n m 处有最大吸收，且吸光度与蛋 白质浓度呈正蚪朔，反应时间短，干扰少，操作简便，特异性强【3 8 】。 ( 四) 变色酸双偶氮类化合物 文献报道了变色酸双偶氮类化合物，如偶氮胂i 3 9 】、偶氮磺i i i 及溴偶氮磺i 【4 0 】， 以及氯磺酚s 【4 1 】与蛋白质作用的机理，灵敏度与b c p 法相近【“。 某些常见的染料测定蛋白质的吸光光度法见表1 1 。 六、金属离子一染料结合法 该法是借用金属离子一染料和蛋白质在适宜条件下反应，进而测蛋白质的方法。金属 离子一染料法中的金属离子一般使用含电荷高、离子外层含有较多空余的瞬间杂化轨道， 这样，当其与含有一o h 或= 0 的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利地进入杂 化轨道，形成稳定的配合物。由于这种结构易产生瞬时偶极，大分子复合物中的氢易解离。 当这种大分子复合物遇到结构不对称的蛋白质分子时，互相极化产生静电作用而结合成新 的大分子团。另外，大