（运筹学与控制论专业论文）连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本文以甘油为底物、采用微生物歧化方法生产1 ，3 丙二醇的连续发酵过程为背景， 基于连续发酵酶催化动力学模型，考虑胞外甘油在还原路径中的三种不同的跨膜运输方 式，建立连续发酵酶催化复杂动力系统，并研究系统的基本性质。基因调控连续发酵动 力系统的建立和研究为实验上采用基因敲除等技术培养高产量新菌种提供理论指导。本 课题受到国家“十五”科技攻关计划项目“发酵工程生产1 ，3 丙二醇 ( 编号为2 0 0 1 b a 7 0 8 8 0 1 0 4 ) 和国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) “生物柴油与1 3 一丙二醇的联产工 艺( 编号为2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) 的资助。此项研究将为实现1 3 丙二醇的产业化生产提 供理论指导，因此，该项目研究具有重要的理论意义与应用价值。本论文的研究内容与 取得的主要结果可概括如下： 1 、对还原路径中克雷伯氏菌胞外甘油和胞内1 3 丙二醇的跨膜运输机理进行分析和 推断。在假设胞内1 3 丙二醇的跨膜运输方式为主被动结合的条件下，分别考虑胞外甘 油的三种不同的跨膜运输方式( 主动、被动、主被动结合) ，根据米氏方程建立连续发 酵酶催化复杂动力系统及其参数辨识模型，证明了系统的基本性质( 解的存在性和唯一 性) 和辨识模型的可辨识性。构造优化算法，依实验数据求得最优辨识参数。辨识后的 模型中1 ，3 丙二醇的计算值与实验值之间的相对误差为3 0 左右，根据实际问题可知建 立的模型适合描述连续发酵过程。 2 、提出生物鲁棒性分析方法。根据模型的稳定性严格依赖于动力系统敏感参数的精 确数值，从对参数进行扰动的角度，建立定量的鲁棒性能指标及其优化算法。对连续发 酵酶催化复杂动力系统中的三个模型分别进行鲁棒性分析，依照目标函数值，选取合理 的模型去更好地反映胞外甘油的跨膜运输机理。复杂动力系统中的三个模型的鲁棒数值 结果表明，参数辨识性能指标作为选取合理系统的唯一标准是不完善的，因而对模型进 行鲁棒性分析是非常必要的。 关键词：复杂动力系统；参数辨识；鲁棒性分析；连续发酵；跨膜运输 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析 p a r a m e t e ri d e n t i f i c a t i o na n dr o b u s ta n a l y s i so fc o m p l e xd y n a m i c a l s y s t e m si nm i c r o b i a lc o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n a b s t r a c t t h ee x i z y m e - c a t a l y t i cc o m p l e xd y n a m i c a ls y s t e m so fb i o - d i s s i m i l a t i o no fg l y c e r o lt o1 , 3 p r o p a n e d i o lb yk l e b s i e l l ap n e u r n o n i a ea r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r b a s i n go ne n z y m e c a t a l - y t i ck i n e t i cm o d e lo fc o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n ，c o n s i d e r i n gt h ed i f f e r e n tt r a n s p o r tw a y so fe x t - r a c e l l u l a rg l y c e r o lo nt h er e d u e t i v ep a t h w a y ，t h ec o m p l e xd y n a m i c a ls y s t e m si n c l u d i n gt h r e e m o d e l sa r ee s t a b l i s h e da n dt h ep r o p e r t i e so fs o l u t i o n sa r es t u d i e d t h es t u d yo ft h en e wm o d e l c a l ln o to n l yb eh e i p f u lf o rd e e p l yu n d e r s t a n d i n gm e t a b o l i ca n dg e n e t i cr e g u l a t i o no fd h ar e g u l o no fg l y c e r o lm e t a b o l i s m , b u ta l s op r o v i d ec e r t a i nr e f e r e n c ef o rg e n e t i cm o d i f i c a t i o no fk 1 e b s i e l l ap n e u m o n i a e 。t 1 1 i sw o r kw a ss u p p o r t e db yt h et e n t h5y e a r s p r o j e c t so fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g ya d m i n i s t r a t i o no f c h i n a ”m i c r o b i a lp r o d u c t i o no f1 , 3 p r o p a n e d i o l ”( n o 2 0 0 1 b a 7 0 8 b 01 - 0 4 ) a n dn a t i o n a lh i g h t e c h n o l o g yr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n tp r o g r a mo fc h i n a ( 8 6 3p r - o g r a m ) ”b i o d i e s e la n d1 , 3 一p r o p a n e d i o li n t e g r a t e dp r o d u c t i o n ”( n o 2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) mm a i n r e s u k so b t a i n e di nt h i sd i s s e r t a t i o nm a yb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h et r a n s p o r tm e c h a n i s mo f g l y c e r o la n d1 , 3 一p da c r o s sc e l lm e m b r a n eo nt h er e d u c t i v ep a t h w a yi sa n a l y z e da n dd i s c u s s e d u n d e rt h ea s s u m p t i o nt h a t1 3 p dp a s s e st h ee e l lm e m b r a - n eb yb o t hp a s s i v ed i f f u s i o na n da c t i v et r a n s p o r t , c o n s i d e r i n gt h r e ed i f f e r e n tt r a n s p o r tw a y so f e x t r a c e l l u l a rg l y c e r o ls e p a r a t e l yw h i c ha r ea c t i v et r a n s p o r t ，p a s s i v et r a n s p o r ta sw e l la sa c t i v e a n dp a s s i v et r a n s p o r t , t h ee n z y m e c a t a l y t i c c o m p l e xd y n a m i c a ls y s t e m sa r ed e v e l o p e db y m i c h a l i s m e n t e nk i n e t i c s w ep r o v es o m eb a s i cp r o p e r t i e so ft h es y s t e m s ，s u c ha se x i s t e n c e a n du n i q u e n e s so ft h es o l u t i o n m o r e o v e r p a r a m e t e ri d e n t i f i c a t i o nm o d e l so fc o m p l e x d y n a m i c a ls y s t e m sa r ee s t a b l i s h e da n dt h ei d e n t i f i a b i l i t yo fm o d e l si sp r o v e d n l ef e a s i b l e o p t i m i z a t i o na l g o r i t h mi s c o n s t r u c t e dt of i n dt h eo p t i m a lp a r a m e t e r sf o r t h em o d e l si n a c c o r d a n c ew i t ht h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h en u m e r i c a ls i m u l a t i o ns h o wt h a tt h er e l a t i v ee r r o r s b e t w e e ne x p e r i m e n t a la n dc o m p u t a t i o n a lv a l u e so f1 , 3 - p di s3 0 o rs o a c c o r d i n gt ot h e a c t u a lb i o l o g i c a ls y s t e m ，t h em o d e l sp r e s e n t e di nt h i sp a p e ra r ef i tf o rf o r m u l a t i n gt h ef a c t u a l f c r m e n t a f i o r t 2 an e wa n a l y s i sm e t h o do fb i o l o g i c a lr o b u s t n e s si sp r o p o s e d a st h es t a b i l i t yo fm o d e ld e 一 一i i 大连理工大学硕士学位论文 p e n & c r u c i a l l yo nt h ep r e c i s eh u m e r i c a lv a l u e so fs e n s i t i v ek i n e t i cp a r a m e t e r s f r o mt h e p e r s p e c t i v eo fac h a n g emt h e s ep a r a m e t e r s ，aq u a n t i t a t i v ep e r f o r m a n c ei n d e xo fr o b u s t n e s s a n di t so p t i m i z a t i o na l g o r i t h ma r ee s t a b l i s h e d ，t h e nt h er o b u s t n e s so fe a c hm o d e li nc o m p l e x d y n a m i c a ls y s t e m si sa n a l y z e d a c c o r d i n gt ot h ev a l u eo fo b j e c t i v ef u n c t i o n , w ec a l ls e l e c ta r e a s o n a b l es y s t e mt or e f l e c tt h et r a n s p o r tm e c h a n i s mo fg l y c e r 0 1 t h en u m e r i c a lr e s u l t so f r o b u s t n e s si n d i c a t et h a tp e r f o r m a n c ei n d e xo fp a r a m e t e ri d e n t i f i c a t i o ni sn o tp e r f e c tt ob et h e u n i q u es t a n d a r dt os e l e c tar e a s o n a b l em o d e l ，r o b u s ta n a l y s i sf o re a c hm o d e l i sn e c e s s a r y k e yw o r d s ：c o m p l e xd y n a m i c a ls y s t e m s ；p a r a m e t e r si d e n t i f i c a t i o n ；r o b u s t a n a l y s i s ；c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n ；g l y c e r o lt r a n s p o r t a t i o n - 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。，与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：蒸缓丝醛复盎盘左菱殖叁鍪盛望刍垒盔丝越 作者签名：逢盛窒日期：趔年厶月生日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间论 文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有权保 留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印、或 扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：垒缱玺嗑复盔邈查盘殖墨叁鳢丛鱼皇堡丝金插 作者签名：叠盛望 日期： 垫旦仝年厶月三l 日 锄纵：鼻扯嘲：斗年月斗日 大连理工大学硕士学位论文 1 绪论 1 1微生物发酵法研究概况 1 1 1 微生物发酵过程简介 在微生物发酵过程中，常用的有三种方法【1 1 ：间歇发酵( 培养) ，连续发酵和批式 流加发酵。 间歇发酵是把一定量的微生物菌种和一定浓度的底物( 本文中指甘油) 放在同一个 发酵罐中搅拌均匀后进行培养，并给予微生物生长所必需的条件，如供氧，适宜的温度 等，在底物甘油的作用下，微生物通过自身代谢迅速生长，代谢的产物包括1 ，3 丙二醇 ( 1 ，3 p d ) 和其他副产物( 如乙酸和乙醇等) 。经过一段时间打开发酵罐，微生物培养 成功。微生物的间歇发酵培养中，底物的浓度逐渐减少，间歇发酵操作简单，可以得到 较高的产物浓度。但生产强度较低，实际生产中很少直接采用，一般是作为连续发酵和 批式流加发酵培养的基础。在底物的浓度达到1 5 0 毫摩尔升时开始进行批式流加培养。 批式流加是先往发酵罐中加入一定量的微生物和底物，进行一段时间的间歇发酵， 然后再往发酵液中加入底物，再进行间歇发酵，如此数次，直到加到预定的体积为止。 批式流加发酵能够得到较高的产物浓度，而且能提高底物的利用率。但是这种培养方式 自动化程度低，操作麻烦。 连续发酵是指连续不断地向发酵罐注入底物，同时提供各种辅助条件，又连续不断 地从发酵罐中取出发酵液，整个过程中保持发酵罐内发酵液的体积不变，并使得培养过 程连续化。连续培养有利于提高生产强度，但产物的浓度较低。由于它具有操作简单、 自动化程度高等优点，是产业化设计理想的生产方式，因此探讨微生物连续培养具有一 定的实际意义。 连续发酵的培养器是由三个相连的容器组成( 如图1 1 所示) 。第一个容器内装有 供微生物生长足够的底物，且底物甘油浓度南。保持不变：底物以常数稀释速率d 被抽到 第二个容器，即发酵罐，发酵罐中装有待培养的微生物菌种，并设有搅拌器和供养装置， 在发酵罐中，微生物将甘油发酵成产物；同时，以常数稀释速率d 将发酵罐中的发酵液 抽到第三个容器中，以保持发酵罐中的液体体积不变，并且在整个过程中，假设所有影 响微生物生长的参数，如温度、酸碱度、含氧量等都保持不变。这样由这个装置制成的 微生物( 含产物) 都在第三个容器中。 间歇发酵和批式流加发酵的培养器只由连续发酵中的前两个容器组成。而间歇发酵 本身，主要还是利用第二个容器的。 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析 图1 1 简易培养示意图 f i g 1 1 i l l u s t r a t i o no fs i m p l ee h e m o s t a t 1 1 2 微生物发酵生产1 3 一丙二醇的研究现状 l ，3 丙二醇和其他二醇( 如乙二醇、l ，2 丙二醇等) 都是重要的化工原料，主要用作 聚酯和聚氨脂的单体以及溶剂、抗冻剂和保护剂等【2 】。早在1 8 8 1 年，就有关于将甘油转 化为1 3 丙二醇的描述，但没有引起人们太多的关注，直到一个世纪后，逐渐发现由1 ，3 丙二醇和另一种化工原料合成的聚酯较之其他原料合成的聚酯具有许多更优良的特征， 因而成为人们研究的一个热点。 目前工业生产中，1 。3 p d 的生产方法主要是化学合成法，需要在高温、高压及贵重 催化剂下进行，产品除1 3 p d p b 还有其他性质相近的副产品，致使产品分离、纯化较困 难，生产成本相应较高，操作条件恶劣，也就限制了1 ，3 p d 生产的发展。为寻求新的生 产方式，人们开始关注由微生物发酵将甘油转化为1 ，3 p d 的方法。虽然微生物发酵法生 产1 3 p d 目前尚处于实验室研究阶段，但它是以生物技术为特征的“绿色工业向传统 石油化工提出了强有力的挑战，因而具有重要的现实意义。与化学合成法相比，微生物 发酵法具有利用可再生资源、选择性高、分离纯化简单、无环境污染、成本低等优点， 这都为1 3 p d 的产业化提供了广阔的前景，也引起了人们的极大关注。通常可以将微生 物生产法分为两类：一是以葡萄糖为底物用基因工程菌生产1 , 3 - p d ，二是用肠道细菌( 如 肺炎克雷伯氏菌) 将甘油歧化为l 。3 p d 。美国杜邦公司和世界第二大工业酶生产商g e n e n e o r 国际有限公司在世界范围内申请了以葡萄糖作底物的基因工程菌生产1 ，3 p d 的技术 专利。但是这项技术离工业化生产还有相当大的距离，主要问题是糖的转化率和产物的 浓度均较低。例如，1 3 p d 在发酵液中的浓度仅为6 - 9 9 工。相比之下，肠道细菌的批 式流加发酵过程可以转化6 0 以上甘油，l ，3 p d 的浓度可以达到5 0g l 。有专利报道 以葡萄糖作为辅助底物可以将甘油的转化率提高到接近1 0 0 。因此，一些甘油过剩的欧 2 大连理工大学硕士学位论文 共体国家( 如德国、法国 正积极开展甘油转化1 , 3 - p d 和2 ，3 丁二醇的研究工作，并已 取得了许多可喜的成果。 就硬究现状来看，应用微生物发酵法生产l 。3 p d 普遍存在1 , 3 - p d 产量过低，生产强 度不高等问题。因此要实现微生物法向工业化的过渡，需要实现系统的可控性，以及尽 可能提高生产强度、甘油转化率和产物浓度。除了要不断改进生产工艺外，还应对发酵 所用菌种的代谢过程和基因调控机理进行深入研究，这有助于设计新的微生物发酵实验 方案和抑制不需要的微生物代谢产物的产生。近年来，在这方面也有较多的研究f 3 ，特 别是发酵过程中胞内生成1 , 3 - p d 的还原途径的研究，已经取褥一些成果l 黏u 】。其中，文 献5 1 对甘油歧化为1 ，3 p d 的胞内代谢途径和关键酶基因表达做了研究，文献 1 1 基于代 谢机理对一些新的菌种筛选和改造方法进行了讨论。这些工作对今后通过基因改造培养 新菌种实现提高l ，3 一p d 产量有着重要意义。 迄今为止，已有不少工作致力于通过数学模型来研究微生物生产l ，3 p d 发酵过程， 解释发酵过程中的各类现象并实现对发酵过程的最优控制。例如，曾安平、修志龙、k m e n z e l 1 2 。1 6 】等人通过对发酵机理的研究，建立了发酵过程的过量动力学模型，并利用模 型初步解释了实验中出现的振荡和多稳态现象。2 0 0 0 年，修志龙、曾安平等人瑟7 坡现， 虽然能用过量动力学模型描述甘油转化过程中底物、能量消耗，以及部分产物( 1 ，3 p d ， 乙酸) 形成的情况，但是当甘油的浓度变化速率较大时，动力学模型必须重新修正，这 时对细胞生长毒性较强的乙醇的形成不能再用过量动力学模型描述。另一方面，原有的 模型也难以描述或预测甘油转化过程中的滞后和多稳态现象。针对上述现象，结合实验 数据，修志龙用最小二乘法对过量动力学模型进行参数辨识，并研究其中的多稳态现象， 修改后的模型定性地描述了实验中的多稳态现象，但不能解释其中的持续振荡现象。孙 丽华、马永峰f 1 8 , 1 9 】等人在原有模型的基础上引入时滞，用泛函微分方程的h o p 盼叉理论 和数值计算方法，通过计算得出系统i 约h o p 纷叉值随操作条件的变化规律，并画出了在 给定参数下系统周期解的图形和相图。离彩霞【2 0 ，2 1 】拳】李晓红【2 2 2 4 1 等人对曾安平等人提漱 的间歇发酵、连续发酵和批武流加发酵的数学模型进行了参数辨识和最优控制，研究系 统解的存在性、唯一性、正则性。解对初值和参数的连续依赖性，取得了大量的成果。 孙亚琴 9 1 基于基因调控机理，在还原路径中建立了酶催化动力学模型去描述稳态下的连 续和间歇发酵过程。新建立的模型不仅将生物量、甘油、l ，3 p d 、乙酸、乙醇五种物质 考虑在内，而且将甘油代谢过程中的一些重要的中闻物质( - - 羟基丙醛) + ，胞内物质 ( 1 3 p d 、甘油、三羟基丙醛) 和酶( 甘油脱水酶、1 ，3 p d 氧化还原酶) 考虑在内，由 以前五维方程的研究拓展到了八维。同时，预测出了胞内甘油、3 - h p a 和胞内l ，3 一p d 的 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析 浓度，突破了实验条件中无法测验胞内物质浓度的问题，为实验研究提供有效的理论指 导。 1 2 参数辨识问题及其优化算法简介 参数辨识问题是系统建模中极其关键的一个环节。它是根据实验数据和建立的模型 来确定一组参数值，使得由模型计算得到的数值结果能最好地拟合测试数据( 蓝线拟合 问题) ，从而可以为生产过程进行预测，提供一定的理论指导。当测试值和仿真值误差 较大时，则认为数学模型与实际的生产过程不符或差距较大，进而修改模型，重新选择 参数。因此，参数辨识问题是一个逆问题，参数估计的好坏决定了用模型来解释实际问 题的可信度。 一般来说，基于实际问题提出的数学模型中的参数都是有实际意义的，如表示某一 反应的速率常数，因此一般都是有约束范围的。要确定参数值，使得测试值和仿真值拟 合得最好，即在最小二乘意义下求参数值，一般按照以下流程图进行( 如图1 2 ) ： 图1 2 参数辨识的流程图 f i g 1 2 p r o c e s sf l o wc h a r to fp a r a m e t e ri d e n t i f i c a t i o n 参数辨识过程中，优化方法的选取是非常重要的。正如w o l p e r t t 2 5 】所指出的，没有任 何一个数值优化算法对于所有问题而言都适合。优化算法的性能是与问题和数据本身有 关的，而且变化相当大。对于一般的非线性优化问题，当无法利用解析方法得到问题的 4 大连理王大学硕士学位论文 解或解的表达式时，求解方法以迭代形式的数值解法最为典型和常见。这种类型的算法 不仅能够计算比较复杂的非线性问题，而且求解速度快、效率高。根据迭代过程中搜索 策略的稳定性与否，这类方法分为两类：随机搜索型方向和确定型方法。 随机搜索型方法是人们受自然规律的启迪，裰据其原理模仿求解问题的方法。这类 方法采用随机搜索技术从概率意义上寻求问题的解，其搜索过程主要利用函数值信息而 不依赖于函数的梯度信息。这类方法的主要优点是能够找到全局最优解，从而保证算法 的收敛性，但其计算速度会比较慢。目前应用比较广泛的随机搜索方法主要有遗传算法、 模拟遗火算法和蚁群算法。 确定型方法根据利用函数信息的程度分为直接搜索型方法和梯度型方法。直接搜索 型方法在迭代过程中主要利用函数值信息，它主要适用于变量较少、目标函数结构比较 复杂且梯度不易计算的情形，该方法的鲁棒性较强。常晃的直接搜索方法主要有坐标轮 换法、模式搜索法和单纯形调优法等。梯度型方法在迭代过程中除利用函数值信息外还 需要函数在当前点或已产生点的梯度信惠。因此，这类方法与直接搜索方法相比，梯度 型算法一般具有快的收敛速度，而且更容易建立算法的理论性质。 在实际闻题中，特别是大规模的系统孛，如全细魏模型，系统往往有大量的动力学 参数需要估计。一般来说，很难有算法对所有的参数都能得到最佳估计。这主要是有以 下原因：第一，当参数很多时，初始猜测值离最优解很近的可能性就很小，丽很多算法 ( 如梯度型算法) 只有在初始猜测值离最优解很近时，才能得到好的收敛性；第二，对 于时间过程的数据而言，可能有些参数有相当大的变化，但时间过程并没有受到任何可 见的影响，群模型对这些参数并不敏感；第三，收集的观测数据太少，如用2 0 个样本估 计3 6 个参数，这样得到的参数估计结果往往不具有代表性。 以上的讨论都是在假设建立的系统模型本身是正确的情况下讨论的。但是，确定一 个生物系统的变量以及变量问的关系至今还存在很多技术困难，我们所建立和讨论的模 型也是有可能出现错误的，比如由于技术问题，有些重要的物质没有被观察到，或者是 有些物质之闻的关系推断错误。因此，当参数辨识的结果一直无法很好地拟合实测观察 数据时，就要考虑是否是模型本身出现了问题。于是，通过建立模型参数辨识检测 结果修改模型的过程来推断胞内各代谢物的关系，可以发现新的代谢物和代谢途径， 确定胞内代谢路径和调控机理。 。3 生物鲁棒性研究概况 从2 0 世纪末开始，生命科学特别是分子生物学发生了令世人瞩目的变化，在此基 础上逐渐产生出个研究细胞调控网络整体性质的交叉学科：系统生物学。系统生物学 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析 是科学假设驱动下的生物学研究，着眼于从系统的角度认识和理解生物系统，这里的生 物系统一般指从分子网络、细胞、组织、器官到个体行为水平。它是一个研究生物系统 中所有组分的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互作用关系的学科，最大的特点 是多学科、交叉性、定量性、综合性、可预测性和精确性。系统生物学以整体化和定量 化为特征，实现从基因到细胞、组织、个体等各个层次的关联信息的整合，其核心任务 是通过对生物系统结构和动力学的认识，最终实现对生命的控制和设计。 系统生物学研究通常分为四个阶段。第一阶段，对选定的某一生物系统的所有组成 进行了解和确定，描绘出该系统的结构，包括基因相互作用网络和代谢途径以及细胞内 和细胞间的作用机理等，构造出一个反映系统内组分及其相互作用的生物网络。以此为 基础，建立生物系统的理论模型。第二阶段，有系统地改变被研究对象的内部组成成分 ( 如基因突变) 或外部生长条件，然后观测在这些情况下系统组成或结构所发生的相应 变化，包括基因表达、蛋白质表达和相互作用、代谢途径的变化等，了解其动力学规律。 利用以上信息确定系统理论模型中的一些重要参数，模拟生物学过程。第三阶段，把理 论模型得到的结果与通过相关实验得到的数据进行比较，对理论模型进行修订和设计。 第四阶段，根据修正后的理论模型的假设或预测，设定和实施新的实验进行验证。重复 第二和第三阶段，不断地通过实验数据对模型进行修订和精炼。生物系统学的目标就是 要在掌握大量不同类型数据的基础上，通过系统的分析，建立针对不同生物学研究对象 的理想的理论模型，使理论预测能够反映出生物系统的真实性。 鲁棒性和稳定性是生物系统和细胞调控网络的基本性质。细胞生活在复杂多变的内 外环境中，某些基因可能出现突变或缺失，各种营养物质及温度、p h 值会随机发生变化， 细胞内部m r n a 和蛋白的合成也存在着随机涨落。这就要求细胞在内外环境扰动的情况 下，甚至某些基因缺失的情况下，重要的生物学状态和基本的生物学过程应该还是稳定 的。生物鲁棒性是指在受到外部扰动或内部参数摄动等不确定因素干扰时，生物系统保 持其结构和功能稳定的一种特性，它是生物系统的基本特征【凋。目前，已经发现生物鲁 棒性普遍存在于生物系统整体、器官、细胞、分子等各种层次，如细菌趋化、细胞周期、 细胞信号通讯、基因突变、生物发育、基因网络等等。产生生物鲁棒性的作用机制主要 是生物系统的反馈、冗余、模块和结构稳定等。认识生物鲁棒性对预防癌症、a i d s 、糖 尿病等疾病的发生，发展和治疗有重要意义。 鲁棒性的定义非常广泛。一种定义认为鲁棒性是使得系统在面对外部和内部干扰时 仍旧可以维持系统的功能【2 7 】；另一种相近的定义认为鲁棒性是在面对扰动和不确定因素 时，维持系统性能的能力【2 钔。将系统的动力学性质考虑在内，鲁棒性的定义具有更广泛 的理解。要充分认识鲁棒性，需要理解生物系统的鲁棒性、稳定性和自动平衡性之间的 6 大连理工大学硕士学位论文 关系。大量数值和理论研究结果表明不稳定和振荡是大多数系统的遗传动态特征，而不 是稳态【2 9 1 。生物环境条件的改变会相应地引起底物浓度和生化反应饱和度等条件的改 变，致使生物系统远离它的生理状态。在建立的系统理论模型中，由于一组参数确定了 一个雅克比矩阵，这样，参数不可控制的变化就不可避免地导致了系统处于不稳定状态。 从这个角度考虑，系统的动态稳定性是指系统在受到微小扰动后，仍能返回到稳定状态。 同时，系统稳定性的提高与再次达到稳定状态所需时间的减少量是密切相关的。值得注 意的是，稳定不意味着代谢物和底物的浓度不发生改变。当面对持续扰动时，物质的浓 度和流通量是在稳态值附近波动，而不是得到一些确定不变的数值。因而，系统的稳定 性是敏感地依赖于动力学参数和调节作用的。自动平衡性是维持系统的状态而非功能的 性质。从上面的介绍，我们可以认识到鲁棒性是维持系统的功能而非系统的状态，这是 鲁棒性与自动平衡性的重要区别。当系统被保留下来的功能可以维持系统的状态时，鲁 棒性、稳定性和自动平衡是相同的。此外，一个子系统的鲁棒性往往有助于形成系统更 好水平的自动平衡，使系统处于稳定。 一个有用的理论必须能够预测系统的特征和动态行为，这意味着需要建构理论去分 析生物系统的鲁棒性，其中数学模型是生物鲁棒性研究的重要手段。针对具体的生物系 统进行鲁棒性分析的文章有很多。参数鲁棒性线性二次型高斯设计综合方法【3 0 】适用于不 确定参数变化形成结构性扰动的系统鲁棒性设计，该方法利用基于内反馈回路的，d 分 解对参数变化建模，在反映参数变化结构的基础上选取合适的l q g 权阵实现鲁棒控制。 p r o m e t h e e i i 方法【3 1 】是一种多属性决策方法，就p r o m e t h e e i i 参数提出了一种基 于经典规划的鲁棒性分析方法，给出了不完全信息条件下的鲁棒性判别条件和鲁棒性设 计步骤。文【3 2 提出了一种新的估计旋转参数的鲁棒方法，这种方法避免了求解非线性 方程组，所采用的都是线性运算。用模拟数据进行了大噪声条件下的实验，在数值准确 性、鲁棒性和保证旋转矩阵的正交性方面取得令人满意的结果。目前，确立鲁棒性理论 及分析方法的工作仍处于初期，要建立完善的理论还需要完成许多工作。 1 4 本文的主要工作 本文以甘油为底物、采用微生物歧化方法生产1 3 一丙二醇的连续发酵过程为背景， 基于连续发酵酶催化动力学模型，考虑胞外甘油在还原路径中的三种不同的跨膜运输方 式，建立连续发酵酶催化复杂动力系统，并研究系统的基本性质。基因调控连续发酵动 力系统的建立和研究为实验上采用基因敲除等技术培养高产量新菌种提供理论指导。本 课题受到国家“十五”科技攻关计划项目“发酵工程生产1 ，3 丙二醇 ( 编号为2 0 0 1 b a 7 0 8 8 0 1 0 4 ) 和国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) “生物柴油与1 3 丙二醇的联产工 7 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁棒性分析 艺”( 编号为2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) 的资助。此项研究将为实现l ，3 丙二醇的产业化生产提 供理论指导，因此，该项目研究具有重要的理论意义与应用价值。本论文的研究内容与 取得的主要结果可概括如下： 1 、对还原路径中克雷伯氏菌胞外甘油和胞内1 3 丙二醇的跨膜运输机理进行分析和 推断。在假设胞内1 3 丙二醇的跨膜运输方式为主被动结合的条件下，分别考虑胞外甘 油的三种不同的跨膜运输方式( 主动、被动、主被动结合) ，根据米氏方程建立连续发 酵酶催化复杂动力系统及其参数辨识模型，证明了系统的基本性质( 解的存在性和唯一 性) 和辨识模型的可辨识性。构造优化算法，依实验数据求得最优辨识参数。辨识后的 模型中1 ，3 丙二醇的计算值与实验值之间的相对误差为3 0 左右，根据实际问题可知建 立的模型适合描述连续发酵过程。 2 、提出生物鲁棒性分析方法。根据模型的稳定性严格依赖于动力系统敏感参数的精 确数值，从对参数进行扰动的角度，建立定量的鲁棒性能指标及其优化算法。对连续发 酵酶催化复杂动力系统中的三个模型分别进行鲁棒性分析，依照目标函数值，选取合理 的模型去更好地反映胞外甘油的跨膜运输机理。复杂动力系统中的三个模型的鲁棒数值 结果表明，参数辨识性能指标作为选取合理系统的唯一标准是不完善的，因而对模型进 行鲁棒性分析是非常必要的。 大连理工大学硕士学位论文 2 预备知识 2 1 常用的几类速度函数 1 生化反应速度常数 生化反应动力学模型即是运用数学函数来体现生化反应速度，因此动力学模型中的 函数又常称为速度函数。典型的生化速度函数把代谢物浓度的空间变化和浓度本身联系 起来。在不包括酶的一级降解反应的最简单情况下，速度直接与浓度成比例。用简单的 符号表示，这种基本化学反应速度方程可以写为： v ( x ) = 一k x( 2 1 ) 其中，x 为底物浓度，速度常数老定义为正值。 2 0 世纪早期，m i c h a e l i s 和m e n t e n ( 19 13 ) 基于h e m i ( 1 9 0 3 ) 的早期思想对酶促反应提 出了反应式，即1 0 0 多年来被广泛应用的米氏速度定律，其形式如下： 1 ， v ( 朋2 茜 亿2 ) 其中，s 为底物，彳为产物，v 雠为最大反应速率，k 为米氏常数。 2 细胞增长速度函数 根据均衡生长模型的假设，细胞生长过程可以用细胞浓度的变化来加以描述。现代 细胞生长动力学模型奠基人m o n o d 早在1 9 4 2 年就指出，细胞的比生长速率与限制性基 质浓度的关系可用下式表示： 胪嚣 ( 2 3 ) 该方程称为m o n o d 方程，其结构与米氏方程一致，其中c 为限制性底物的浓度。此外， 微生物学家根据实验，还提出了各种形式的微生物比生长速率和养料浓度的关系。比较 常用的有以下几种形式： m o n o dh a l d e n c e ： 2 燕 第三类h o l l i n g 功能反应函数：= i 考琴睾巧 i v l e v 功能函数： 卢= 1 一p 。肥 m o n o d 具有内在代谢 2 器一巧 9 连续发酵复杂动力系统参数辨识与鲁捧性分析 除以上介绍的四种模型外，常见的还有t e s s i e t 模型、b l a c k m a n 模型和有抑制阀的 培养模型等，由于本论文并没有涉及到，就不再介绍。 3 物质跨膜速度函数 物质的跨膜转运可分为被动转运和主动转运。被动转运又可分为单纯扩散和异化扩 散。主动转运包括狭义上的主动转运以及出胞和入胞。 被动转运是不耗能的，它是一个顺浓度梯度的转运过程。影响被动运输的主要因素 有两个：膜两侧的溶质分子浓度梯度。浓度梯度大，物质顺浓度梯度扩散就多；浓度 梯度消失，扩散就停止。膜对物质的通透性。因此，被动扩散的扩散速度经常用如下 方程描述： 1 ，= 七( c 卸一) ( 2 4 ) 其中，常数k 体现膜对物质的通透性，c 。，c 。分别为物质的胞内外浓度。 主动转运一般是由膜的低浓度一侧向高浓度一侧转运的过程，因此是一种耗能过 程。在假设能量足够的情况下，主动转运的速度函数经常用米氏方程表示。 2 2 微生物连续发酵动力学模型 2 2 1厌氧微生物中甘油发酵的代谢途径 在微生物发酵过程中，克雷伯氏菌以甘油为底物的代谢途径如图2 1 所示【3 3 1 。甘 油的歧化过程包含两个平行路线：氧化途径和还原途径。在氧化途径中，甘油被与n a d + 相连的甘油脱氢酶( g d h ) 催化脱氢生成二羟基丙酮( d h a ) ，在二羟基丙酮激酶( d h a k ) 的作用下进一步代谢为丙酮酸( d 扎心) ，生成能量a t p 和还原当量n a d + n a d h 2 及乙酸、乙醇，并伴随着微生物细胞的生长；在还原路径中，甘油被与维生素b 1 相关 联的甘油脱水酶( g d h t ) 催化脱水生成3 羟基丙醛( 3 - h p a ) ，其进一步由与n a d h 相连的1 ，3 p d 氧化还原酶( p d o r ) 还原为产物l ，3 丙二醇( 1 ，3 p d ) ，同时消耗氧化 途径上生成的过量还原型辅酶i ( n a d h 2 ) 。本文的研究重点放在还原路径。 由图2 1 可见，甘油歧化过程所涉及的酶主要有：甘油脱水酶( g d h t ) 、1 3 p d 氧 化还原酶( p d o r ) 、甘油脱氢酶( g d h ) 、二羟基丙酮激酶( d h a k ) 等。其中g d h t 、 p d o r 、g d h 这三个酶的活性对1 3 p d 的形成至关重要，是甘油歧化过程的关键酶。另 外，g d h t 是限速酶 3 4 1 。 图2 1 体现了产物和底物之间的关系，同时可以直接看出底物消耗和产物生成的机 理。3 羟基丙醛( 3 h p a ) 既是g d h t 催化的产物，又是1 , 3 - p d 的底物，所以它直接关系 1 0 大连理工大学硕士学位论文 到嗣标产物的产生。另辨，研究发现3 - h p a 既能翔制细脆的生长，又能抑制氧化途径上 甘油脱氢酶的活性，所以它是一种毒性较强的中间代谢物【3 5 , 3 6 1 。 n 习a d h 2 卜p 溉 砖a t p ， i ， ；， 1 , 3 - p d e x t r a e e u u l a r 乙黢、乙簿、t a c 图2 。1 厌氧微生物中甘油代谢路径简图 f i g 。2 1 a n a e r o b i cm e t a b o l i s mp a t h w a y so f g l y c e r o lf e r m e n t a t i o n 2 2 2 连续发酵适量动力学模型 利用数学模型的方法来描述微生物在培养器内的发酵过程，主要考虑各因素浓度的 变化。首先对甘油歧化l ，3 丙二醇的过程作如下假设： 假设( h 1 ) ：发酵罐中( 即反应器内) 物质组成不随空间位置而发生变化，即反应器内 各物质的浓度是均一的； 假设( i - 1 2 ) ；连续发酵过程中，连续加入的培养基中不含有生物量 0 ，3 5 ( s ) 0 ，当i k i i t o ，恒有0 x ( r ；f o ，而) l i o ，就有l ，i m x ( t ；t o ，x o ) = 0 ，则称x = o 是 渐进稳定的，区域扛i f l x 0 0 ，对于任意的万 0 都存在而与t l t o ，使 ， 则称z = 0 为不稳定的。 定义2 3 3 考虑自治系统 1 6 大连理工大学硕士学位论文 j c ( t ) = f ( x ) ，f c 1 ( q ；r “) ，q r ” 设f ( 0 ) = 0 ，把厂在工= 0 处用带p e a n o 余项的t a y l o r 公式展开，得 j ( ，) = 投+ ( x ) ( 2 11 ) 靴- ( 警卜常数脯她麟条件艘智= o 则称线性系统 竞( f ) = a x( 2 1 2 ) 为系统( 2 1 1 ) 的线性近似系统。 定理2 3 1 ( 1 ) 若系统( 2 1 2 ) 中矩阵么的特征值都具有负实部，则( 2 1 1 ) 的零解是渐进稳定的； ( 2 ) 若矩阵a 至少有一个特征值具有正实部，则系统( 2 1 1 ) 的零解是不稳定的； ( 3 ) 若么没有实部为正的特征根，但有实部为零的特征根，则系统( 2 1 1 ) 的零解的稳 定性由高阶项矽( z ) 决定。 2 4 非线性动力系统的鲁棒性分析 本节主要知识选