（环境科学专业论文）五种硝基芳烃化合物对虹鳉鱼单一及联合毒性效应研究.pdf

均为小于相加( 独立作用) 或拮抗；2 , 6 - d n t + 2 , 4 - d n t + 4 n t 在2 4 h 至9 6 t l 均为协同。 关键词：硝基芳烃虹鳝鱼( p o e c i l i ar e t i c u l a t a ) 单一毒性联合毒性 a b s t r a c t g u p p i e s ( p o e c i l i a r e f f c u l a t a l w f f r e e x p o s e d t o 2 ，6 一d i n i t r o t o l u e n e ( 2 , 6 - d n t ) ，2 , 4 一d i n i t r o t o l u e n e ( 2 , 4 - d n t ) ，4 - n i t r o t o l u e n e( 4 - m 3 ， m _ d i n i t r o b e n z e n e ( m - d n b ) a n d2 , 4 - d i n i t r o a n i l i n e ( 2 , 4 - d n a n ) a to n e t ot w o w e e k sa g e ds t a g e s 。a s s a y sf o ri n d i v i d u a lt o x i c i t y , w h i c hi n c l u d e da c u t e t o x i c i t yi n9 6 h ，a c c u m u l a t i o nt o x i c i t ya n d s u b a c u t et o x i c i t yi n5 0d a y s ，a n d c o m b i n a t i o nt o x i c i t yw e r eu s e d t h er e s u l t so fa c u t et o x i c i t ys h o w e dt h a tt h e s ef i v ec o m p o u n d sh a d m o d e r a t et o x i c i t y t h er e s p e c t i v e9 6 hm e d i a nl e t h a lc o n c e n t r a t i o n sa n d 9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l sc o n t a i n e dt h a t2 , 6 - d n t = 2 5 3 3 ( 2 4 7 8 2 5 9 4 ) 1 t 叽 2 牟d n r _ _ 2 4 5 7 ( 2 3 9 9 - 一2 5 1 2 ) m g l , 4 - n t - - 5 9 8 1 ( 5 9 0 2 - - 6 0 9 5 ) m g l , m - d n b = 1 9 1 3 ( 1 8 2 0 - q 9 9 5 ) r a g e , 2 , 4 - d n a n = 1 3 8 2 ( 1 3 2 1 1 4 4 9 ) m g l t h e i r t o x i c i t yo r d e r i s4 - n 心斗d 岍2 卢肼仉、锄- d - j b q ，删a na n dt h es a f ec o n c e n t r a t i o n s w e r e2 , 6 - d n t = 0 2 5 r n g , l , 2 , 4 - d n t = 0 s n 矾4 - n t = 0 6 0 【f 扎m - d n b = 0 1 9 m g l , 2 , 4 - d n a n = 0 1 4 m g l i nt h ea c c u m u l a t i o nt o x i c i t y 、x c ma n dl cw e r eu s e da st w oe v a l u a t i o n i n d e x e s t h er e s u l ts h o w e dt h a ta c c u m u l a t i o n so f2 , 4 - d n t , 4 - n ta n dm - d n b w e r ee v i d e n t ，2 , 6 - d n tw a sm e d i u ma n d2 , 4 - d n a nw a ss l i g h tb yk c 。t h e a n o t h e rr e s u l tw a st h a t2 , 4 - d n t ，4 - n ta n dm - d n bw e r et e r r i b l yh i 曲 a c c u m u l a t i o n ，m o r e o v e r ，2 , 6 - d n t w a s l l i g ha c c u m u l a t i o nb y 厶 t h er e s u l t so fs u b a c u t et o x i c i t ys h o w e dt h a ti nt h i s s t u d yt h e s ef i v e c o m p o u n d s a f f e c t e da b s o l u t eg r o w t ho f w e i g h to rl e n g t ha n di n s t a n t a n e o u s g r o w t hr a t eo f t h ef i s hp r o m i n e n t l y t h e s ee f f e c t sw e r em o s td i s t i n c ti n2 0 t o3 0d a y sf r o mb e g i n n i n go ft h i se x p e r i m e n t w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f 2 , 4 一d n a nw a s2 2 1 m e l ，2 , 6 - d n t , 2 , 4 - d n ta n d4 - n tw e r e1 4 8 m g l ，t h e c o n c l u s i o n so ftt e s tb e t w e e nt r i a lg r o u p sa n dt h ec o m p a r i s i o nw e r ep o 时，为协同作用；a i 9 8 9 8 9 9 a r a r a r a l d r i c hc h e m c o a l d r i c hc h e m c o a l d r i c hc h e m c o 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 高度1 l c m ) ，1 0 0 0 m l 烧杯( 直径1 1 5 e m ， 实验容器按文献 2 9 认真清洗。在使用前，按下列程序清洗：洗涤 剂一1 0 0 丙酮一自来水一5 硝酸一实验用水。每次实验结束后，先用 去污粉彻底刷洗容器，然后用洗涤剂、丙酮清洗，最后用实验用水冲 洗三次。 2 1 3 试剂的配制 分别将2 , 6 二硝基甲苯( 2 ，6 d n t ) 、2 , 4 一二硝基甲苯( 2 ，4 d n t ) 、 对硝基甲苯( 4 - n t ) 、间二硝基苯( m - d n b ) 和2 , 4 一二硝基苯胺 ( 2 ，4 d n a n ) 以丙酮助溶，再用二次蒸馏水定容，配制成l m g m l 的贮 备液。丙酮助溶剂含量不超过0 5 m l l 。必要时应用超声波分散。需要 其他浓度时，分别以贮备液配得。亚急性毒性实验所用实验试剂母液 按上述方法配制成浓度为o 1 m g m l 的贮备液，丙酮含量小于0 1 m l l 。 母液至少每2 天配制一次。配好后低温、避光存放。 2 1 4 实验用水 实验用水使用曝气三天以上的自来水，总硬度5 0 2 5 0 m g l ( 以碳酸 钙计1 ，p h = 7 1 2 o 1 4 ，溶解氧= 8 4 7 + 0 1 3 m g l ，水温= 2 4 2 2 1 6 8 。 2 2 实验材料 作为亲鱼的虹鳊鱼，从长春市青怡坊花鸟鱼虫市场购得，选择全 长3 4 厘米的同一品种的个体，雌、雄比例为1 ：1 ，经5 食盐水消毒 后进入实验室。在实验室条件下驯养至产子，驯养期间，每天1 2 次 喂食市售复合饲料。驯养期间无死亡。母鱼产完子后，常因饥饿或者 受惊吞食仔鱼，因此，为了保护刚刚出生的仔鱼，在产子前，采用长 1 5 0 毫米、宽1 0 0 毫米、高1 3 0 毫米的纱网f 以仔鱼游得出而大鱼游不 出为宜) 将亲子隔开，待产子完毕，将亲鱼与仔鱼分开喂养。刚出生的 仔鱼会沉入水底，待数分钟后就能游动觅食。 仔鱼产出后当天一般不摄食，第二天开口摄食，即时投喂蛋黄水。 在实验室条件下继续驯养仔鱼。驯养期间，每天将市售复合饲料与蛋 黄粉磨碎混合喂食一次。选同批出生、健康、个体大小相似的1 2 周 龄仔鱼作为实验生物。仔鱼驯养期间死亡率 2 。 实验用鱼鱼体全长0 8 1 0 1 7 c m ( 最长为0 8 9 c m ，最短0 7 2 c m ) ， 鱼体重5 5 8 1 0 5 m g ( 最重6 8 0 m g ，最轻5 2 1 m g ) 。驯养及实验中均采 用自然光照射。 2 3 实验方法 各项实验，采用2 4 h 更换2 3 实验液的静水换液法。判断鱼死亡的 方法是，用镊子轻击鱼的尾部，如果三分钟内，鱼体不产生任何应激 反应，即可判断为死亡【2 9 。死亡的鱼体立即移出容器，以免影响水质。 2 3 1 单一毒性实验 2 3 1 1 急性毒性实验 急性毒性实验，周期为9 6 h ，实验开始前2 4 h 停止投食，实验期间 9 不投食。具体实验方法阶4 8 棚5 0 1 为： 预实验 为确定正式实验的浓度范围，以2 为公比设置4 个预备实验浓度。 每个染毒组放入5 尾鱼，不设平行，观察4 8 h 。每日3 次纪录各容器内 的死亡鱼数，并及时取出死鱼。如果一次预实验结果无法确定正式实 验所需的浓度范围，另选一浓度范围再次进行预实验。 正式实验 根据预实验结果，按等对数间距设置5 7 个染毒组，包括使鱼2 4 h 全部死亡或接近全部死亡的最低浓度和9 6 h 鱼类全部存括或接近全部 存活的最高浓度。每个染毒组设2 个平行，每一系列均设置空白对照 和o 5 m l l 丙酮助溶剂对照。每个实验容器内投放1 0 尾鱼。同一实验 尽量选同批出生的、活泼、健康、个体大小相差不多的实验用鱼，3 0 分钟内分组完毕。在1 5 h ，3 h ，6 h ，1 2 h ，2 4 h ，4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 分别检 查受试鱼的状况。观察并纪录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。纪 录实验鱼的异常行为( 如：鱼体侧翻、失去平衡、游泳能力和呼吸功能 减弱、色素沉积等) 。 2 3 1 2 蓄积毒性实验 毒性蓄积是发生慢性中毒的基础。当毒物连续不断地或多次反复 地进入机体，进入的速度( 或总量) 超过转化和排除速度( 或总量) 时，体 内毒物量可逐渐增加，这就是毒物的蓄积现象 5 ”。 蓄积实验是检测外来化学物质在机体内蓄积性大小的实验。在亚 急性毒性实验中，最主要的任务之一是在不太长的实验期间内判定毒 物有无蓄积作用，并不经常需要分别的研究物质蓄积或功能蓄积，而 常用综合判定毒物蓄积作用的方法盼5 3 1 。本项研究采用蓄积系数( 匠。) 和蓄积指数法( 酗测定法评价五种受试物的蓄积毒性，讨论各化合物蓄 积毒性趋势。 本项研究以死亡率作为观察指标，此时： 瓦。= l c s o ( n ) l c s o ( ! )( 2 1 ) i e = 1 - l c s o ( 2 w ) l c 5 0 ( 2 4 1 1 )( 2 2 ) 1 0 根据五。值的大小，将化合物的蓄积性分为四级( 表2 - 1 ) e 5 2 周】： 表2 - 1 蓄积性分级 x 蓄积作用 1 2 8 ，可认为基本无蓄积性。 表2 _ 3 剂量定期递增染毒法剂量用表 染毒日期( 天) l q5 89 1 21 3 1 61 7 2 0 2 l 2 42 5 2 8 每天染毒剂量( l c 5 0 ) 0 1 00 1 50 2 20 3 40 5 00 7 51 1 2 每4 天染毒总剂量( l c 5 0 ) 0 4 0 0 6 00 9 01 4 02 0 03 ，0 04 ，5 0 累计染毒总剂量( l c 5 0 ) 0 4 01 0 01 9 03 _ 3 05 3 08 - 3 01 2 8 0 2 3 1 3 亚急性毒性实验 参考文献 6 ，2 9 ，5 1 ，5 4 ，设计实验，观测受试鱼体的绝对生长量， 并根据鱼类生态学 5 5 1 计算瞬时生长率。 每种化合物设3 个实验浓度和一个空白对照，共进行5 0 天。从实 验开始，每隔十天，在每个实验组( 包括空白对照组) 各取3 尾鱼， 测量其体长和体重。测量前，先以酒精麻醉。实验期间，每天投食一 次 2 9 】。 2 3 2 联合毒性实验 按照文献 6 】，根据单一化合物9 6 h l c 5 0 值，按等毒性配比，设置 6 8 个实验浓度，实验方法同急性毒性实验。 2 4 数据处理与分析 计算应用s p s s l l 0 ，作图部分由e x c e l 2 0 0 0 完成。 2 4 1 单一毒性实验 2 4 1 1 急性毒性实验 以浓度的常用对数为自变量，死亡率的概率单位为应变量，应 用直线回归法求得急性实验的主要数据l c 5 0 值和9 5 置信限m 5 6 1 。 按国家环保局2 0 0 2 年最新版水和废水监测分析方法1 4 8 1 中 的相关规定进行化合物毒性分级。 表2 - 4 鱼类急性毒性分级标准 安全浓度的估算参照文献【4 7 】。 2 4 1 2 亚急性毒性实验 亚急性毒性以鱼类生长变化为指标，定期测量经不同化合物染毒 1 2 的鱼体长和体重，分别与空白对照组实验生物的体长、体重进行t 检验， 比较是否存在显著差异。同时，按照鱼类生态学 55 】记载方法： g = ( 1 n w 2 一l n w l ) ( t 2 - t 1 )( 2 3 ) ( 2 3 ) 式中，g 为瞬时生长率，、h 和w a 分别为时间t l 和t 2 的体重。 计算空白对照及在不同染毒条件下受试鱼的瞬时生长率，绘出瞬时 生长率曲线。 2 4 1 3 蓄积毒性实验 根据方法盼5 3 1 要求，计算五种化合物的蓄积系数( 疋。) 和蓄积指数 幔) ，评价它们的蓄积毒性。 2 4 2 联合毒性实验 应用直线回归法求得联合毒性l c 5 0 值及9 5 置信限。根据每组化 合物的9 6 h l c 5 0 值，利用毒性单位分析法【1 5 1 6 1 、毒性单位图解法盼1 7 1 8 1 及相加指数法进行评价。 第3 章结果分析与讨论 3 1 单一毒性效应 3 1 1 急性毒性效应 3 1 1 1 实验结果 空白对照组和助溶剂对照组的实验用鱼，9 6 h 内死亡率均为o 。 2 , 6 - d n t 、2 , 4 一d n t 、4 - n t 、m d n b 和2 ，4 一d n a n 五种受试化合物分别 以不同浓度对虹鲻鱼染毒，各浓度下死亡率概率单位与化合物浓度对 数之间存在明显的剂量效应关系，如表3 - 1 所示： 表3 - 1 五种受试化合物对虹鳊鱼急性毒性剂量效应关系 化合物时间 剂量效应关系式 ， sf p 2 , 6 d n t2 4 y 2 5 2 8 0 7 x - 6 9 3 9 80 8 5 2 0 9 0 31 7 2 8 30 0 2 5 4 8 y 2 4 0 ，1 2 0 x - 5 1 7 5 8 0 9 4 50 3 4 6 3 4 0 2 00 0 2 8 7 2 y 2 4 5 5 6 1 x 一5 9 0 9 809 2 5 0 5 3 23 7 1 2 50 0 0 9 9 6 y 2 5 2 3 2 2 x 一6 8 4 4 40 8 9 4 0 8 0 51 0 4 120 0 4 8 2 ，4 d n t2 4 y = 11 5 6 7 x 一1 5 8 5 7 o 9 0 4 o 8 9 01 8 8 4 90 0 4 8 4 8 y 2 8 1 0 9 1 x 一1 0 9 2 00 8 6 6 0 8 6 91 9 4 6 3 0 0 2 2 7 2 y 2 2 1 2 7 4 x 一2 5 1 0 20 9 9 6 0 0 3 34 6 4 4 70 0 0 2 9 6 y 2 2 2 2 2 3 x 一2 0 3 4 6 0 ，8 7 90 6 9 0 2 9 0 3 80 0 0 6 4 。n t 2 4 y = 4 4 5 0 3 x 一7 4 8 7 40 9 5 7o 1 4 76 6 1 9 5o 0 0 4 4 8 y 26 3 ，5 8 1 x 一1 0 8 8 7 0 8 6 1 o 4 5 12 4 7 6 9o 0 0 8 7 2 y 2 3 7 3 0 7 x 一6 1 4 6 70 9 4 20 1 4 4 4 8 3 6 00 0 0 6 9 6 y 2 3 5 4 7 6 x 一5 8 0 3 30 9 6 7 o 0 9 78 6 9 11 0 0 0 3 m 。d n b 2 4 y = 1 3 6 6 4 x 一1 3 2 4 7o 9 8 500 0 61 3 5 0 4 o 0 0 7 4 8 y 21 0 5 4 7 x - 8 6 7 0 0 o 9 9 00 0 0 5 2 0 4 9 8o 0 0 5 7 2 y 21 3 9 4 8 x - 1 3 ，0 4 1o 9 4 80 1 5 6 3 6 2 1 8o 0 2 7 9 6 y 2 1 7 5 2 7 x - 1 7 4 6 50 9 5 7 o ，0 1 04 3 9 9 1o 0 2 2 2 , 4 d n a n2 4 y 26 6 1 9 0 x - 2 8 0 9 00 9 4 30 1 0 3 3 3 2 5 70 0 2 9 4 8 y 27 5 1 8 0 x - 3 8 1 3 00 9 8 10 0 6 6 1 0 5 1 30 0 0 9 7 2 y 2 2 2 0 4 5 x - 2 0 1 8 30 ，8 6 3 0 7 3 52 5 2 2 0 0 0 0 7 9 6 y 2 2 2 2 2 3 x - 2 0 3 4 60 8 7 9 0 6 9 0 2 9 0 3 80 0 0 6 1 4 由表3 1 ，五种化合物2 4 h 9 6 h 剂量- 效应关系式的相关系数平方( 一) 均在o 8 5 0 9 9 之间，而且显著水平( 即均小于o 0 5 。根据各剂量一效应 关系式，计算得到l c 5 0 值及其9 5 置信限，再根据化合物l c s o 值进行 毒性分级，并估算各自的安全浓度【4 7 ，结果如表3 - 2 所示。 表3 - 2 五种受试化合物对虹鳊鱼急性毒性l c 值及安全性评价 浓度单位：m g ，l 化合物 筹蒿 l c s 。安全浓度毒性分级 注：染毒时间单位为h ：f ) 内为l c 值的9 5 置信区间。 3 1 1 2 中毒症状 在实验过程中，经过五种化合物染毒的实验鱼，均不同程度的表 现出平衡失调、游泳能力下降，大剂量染毒组或长时间染毒的低剂量， 均出现侧翻、腹部向上( 持续时间较长，低染毒组可达9 6 h ) 等症状，同 时，由于1 2 周龄的实验鱼身体较透明，还可以观察到鱼体内脏有发 黑的现象。其中，经2 , 4 一d n a n 染毒的实验动物变黑内脏的位置与其他 组别明显不同。但因实验鱼的形体较小，无法进一步进行解剖，观察、 验证内脏变化情况。各处理组，死亡情况多发生在染毒初期( 2 4 h ) 和染 毒末期( 9 6 1 1 ) ，4 n t 尤为明显。同时，2 , 6 d n t ，2 , 4 d n t 和m d n b 染 毒组实验鱼，有体色发白的症状。4 - n t 染毒组，刚刚进入水中时，实 验鱼背部出现黑斑，但可在几个小时内消失。随染毒时间的延长，4 一n t 与2 ，4 d n a n 染毒组鱼体均会出现呼吸困难。 3 1 1 3 分析与讨论 根据表3 2 的毒性分级结果，2 ，6 d n t 、2 , 4 d n t 、4 n t 、m d n b 和2 ，4 d n a n 均属中毒化合物。依据文献 2 9 ，5 4 估算，它们的安全浓 度分别为2 , 6 d n t = 0 2 5 m g l ，2 , 4 一d n t = 0 2 5 m g l ，4 n t = 0 6 0 m g l ， m d n b = 0 1 9 m g l 和2 , 4 - d n a n = 0 1 4 m g l 。 利用表3 2 中五种化合物2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 及9 6 h 半致死浓度数据， 做出化合物急性毒性比较柱形图( 图3 1 ) 。 6 0 毫 5 4 0 篓 蕞 彝2 0 o l 一_1_ 憾 2 ，6 一d n t2 ，4 一d n t 4 一wm d n b 2 ，4 一 化合物 d n a n 图3 - 1 五种化合物急性毒性比较 由图3 - 1 ，我们可得到这五种化合物的毒性大小排序 4 一n t 2 ，4 一d n t 2 ，6 一d n t 2 ，4 d n t 2 ，6 一d n t 2 ，4 一d n a n 。按照蓄积指数厶进行化 合物的蓄积毒性排序，得到：m - d n b 2 ，4 - d n t 4 - n t 2 ，6 - d n t ( 因为缺少 2 ，4 d n a n 的l c 5 0 ( 2 w ) 数据，此排序中不包括2 ，4 一d n a n ) 。 以上两蓄积毒性排序结果基本相同。文献 6 5 】中报道，通过测 定和计算b c f 系数，得出蓄积毒性顺序：2 , 4 一d n t 2 ，6 - d n t 4 - n t 。 以往应用b c f 系数对2 , 6 d n t 和2 , 4 d n t 在绿藻中的蓄积作用进行比 较【6 6 1 ，得到2 , 4 d n t 2 ，6 一d n t 。另外，文献 6 7 应用b c f 系数对有机 物在鲤鱼体内富集的研究，得出4 - n t 富集作用不明显的结论。 本实验应用两种方法评价，都得到蓄积毒性2 ，4 d n t 2 ，6 d n t ， 与前人的结论相符。但对于4 - n t ，应用五。及厶均得到了其蓄积毒性 大于2 ，4 一d n t 和2 , 6 一d n t ，为明显蓄积作用或极强蓄积作用。这两个 结果均与文献 6 7 1 的结论不同。造成这一差别的原因可能与评价蓄积毒 性所选取的指标不同有关。 在以往的研究中，研究者们一直采用b c f 作为衡量化合物在生物 体富集能力的指标。b c f 作为浓缩系数或富集因子主要反映生物浓缩 的程度，也就是指生物机体内某种物质的浓度和环境中该物质浓度的 比值1 6 ”。b c f 的计算，无疑需要检测出生物体内毒物的含量，应该说 应用b c f 来评价毒物的蓄积，更加侧重于毒物在生物体内的物质蓄积。 而机体在毒物反复作用下受损功能的逐渐蓄积最后也可导致中毒或死 亡【5 ”。这就要求用生物方法进行鉴定，以毒物作用的效应受损功 能的累计为观察指标，测定蓄积毒性，即本项研究所进行的，以蓄积 作用的强弱表示受试毒物对生物的毒性。j 匕。和厶通常被看作是反应 物质蓄积及功能蓄积的比较综合的指标【5 2 】。因此，通过b c f 评价4 - n t 富集作用不明显与应用噩。和厶评价其有极强蓄积或明显蓄积作用， 这两个结果本身并不矛盾。 本实验得到的蓄积毒性顺序与急性毒性顺序不完全一致，但蓄 积毒性常被认为是评价化学物能否引起潜在的慢性毒性的依据之一 2 0 1 ，这说明五种受试物对实验生物可能存在亚急性或慢性毒性。 3 1 3 亚急性毒性效应 3 1 3 1 实验结果 亚急性毒性共进行5 0 天。各阶段体重、体长测量结果如表3 - 6 所 不。 表3 - 6 空白对照组虹鳙鱼5 0 天体重、体长测量值 时间：d体重：m g体长：m m 时间体重体长 表3 - 7 五种化合物对虹鳙鱼亚急性毒性数据 时间：d浓度：m g l 体重：m g 体长：m m 注：。与空白对照进行t 检验，p 0 0 5 ：“与空白对照进行t 检验。p 0 0 1 实验期间，2 , 6 d n t 的2 2 1 m g l 染毒组第3 3 天死亡一尾，其他各 染毒组均未出现死鱼现象。观察实验鱼类的形态变化，在第2 9 天时， 对照组鱼尾均已呈明显红色，与成鱼形态特征颇为相似，第4 0 天即可 区分雌、雄。而经不同化合物染毒的各实验组，除以o 7 5 m g l 2 ，4 d n a n 处理的受试鱼在第4 3 天发现有2 尾出现淡红色( 与对照相比) 外，到实 验结束时所有染毒组体色均无明显变化，且无法分辨雌、雄鱼体。由 于实验用鱼体形较小，无法进行进一步的解剖检验。 3 1 3 。2 分析与讨论 ( 1 ) 五种受试物对虹锵鱼体重、体长绝对生长量的影响 根据表3 - 6 和表3 7 ，可以看出： 对照组在2 0 3 0 天体重、体长的绝对增加量最大，体重由 2 1 7 1 m g 增加到4 0 9 0 m g ，体长由n 1 3 r a m 增长到1 4 0 5 m m 。而第3 0 天各染毒组鱼体重与对照组均呈现极显著差异( p ( o 0 1 ) ，其中2 ，6 - d n t ， 2 , 4 d n a n 各浓度下的实验鱼，体重甚至有所下降。而且，五种受试化 合物对机体的暴露影响导致在第4 0 天甚至更长的时间里，虹鲻幼鱼的 体重即使有所增加，与对照组的差异仍然极为显著( p o 0 1 ) 。染毒后的 第2 0 天，除m d n b 和2 , 4 d n a n 在2 2 1 m g l 染毒组体长与对照比较 具有显著差异( p o o s ) # b ，其他染毒组均与对照无显著差异( 黔0 0 5 ) 。 一般来说，生物的早期发育阶段是生物生命周期中最脆弱的阶段， 根据大量有关报道，这一阶段也是生物对有毒物质最为敏感的阶段 6 9 。 因为实验用鱼为1 2 周龄的幼鱼，所以，根据以上分析，如果虹蝣鱼 在出生后3 0 5 0 天受到硝基芳烃化合物的毒性作用，将直接关系到鱼 体今后的生长和发育，如果接触到的毒物达到一定剂量，还会给机体 带来较大的损伤。 化合物浓度越大，对受试生物的生长抑制作用越明显。但也有 例外，染毒第3 0 天，1 4 8 m g l 2 ，4 - d n t 染毒组实验鱼体重大于o 7 5 m g l 染毒组实验鱼的体重，但仍极显著小于空白对照组( p o 0 1 ) 。 虽然急性毒性实验结果表明4 - n t 的急性毒性小于2 , 6 d n t ， 但从1 4 8 m g l 和2 ，2 1 m g l 两个染毒组5 0 天的体重、体长变化来看， 2 0 天时，2 2 l i n g l 4 n t 染毒组的体重与对照组呈极显著差异【尸 0 0 1 1 ， 而相同浓度2 , 6 一d n t 染毒组的体重比4 - n t 组大，与对照组呈显著差异 c p 0 0 5 ) 。2 0 天后，两种化合物各染毒组的体重均与对照组呈极显著差 异衅0 0 1 ) 。这说明，从亚急性毒性角度讲，4 - n t 的毒性并不小于 2 , 6 d n t 。可见，污染物低剂量长时间接触机体，造成的影响可能与急 性毒性机理不同，仅依靠急性毒性结果评价化合物的安全性并不全面。 五种化合物中，除1 4 8 m g l 和2 2 1 m g l m - d n b ，2 ，9 4 m g l 4 - n t 染毒组体重在第1 0 天与对照组呈显著差异( p 0 0 5 ) # t - ，其他各染毒组 在第1 0 天时，均与对照组无显著差异咿0 0 5 ) 。是否可以由此得出 r n d n b 与4 - n t 与其他三种化合物相比，慢性毒性更强的结论，还需 要迸一步验证。但这一结果与蓄积毒性实验中得到m d n b 和4 - n t 具 有明显或极强蓄积作用的结果基本符合，说明这二者的慢性毒性的确 不容忽视，同时也说明本项研究采用的两种蓄积实验方法是有效、可 行的。 这五种化合物对体长增加的抑制滞后于对体重增加的抑制作 用，这一点在徐镜波等3 卅以一龄鲤鱼为实验材料，研究2 , 6 一d n t ， 2 , 4 d n t 在1 5 天、3 6 天亚急性毒性对生长的影响时，也有所体现。3 0 天后，各染毒组与对照组体长差异有随浓度降低、染毒时间延长而逐 渐减小的趋势。这可能与化合物对骨骼的毒性影响较小有关。 ( 2 ) 五种受试物对虹鲻鱼瞬时生长率的影响 瞬时生长率大多用重量生长表达陋”。所以，应用表3 - 6 和表3 7 中 的体重数据，根据( 2 3 ) 式计算鱼类瞬时生长率 5 ”，绘出空白对照组及 各化合物影响下的瞬时生长率变化曲线( 图3 2 ，图3 3 ，图3 _ 4 ，图3 5 ， 图3 6 及图3 7 ) 。 0 0 8 群o o e 蓑o o t 率o 0 2 天这个阶段，应该是鱼体各组织器官发育的关键时期。 2 , 6 d n t 对实验鱼生长率的影响 图3 - 32 , 6 - d n t 对虹鲻鱼瞬时生长率的影响 据图3 - 3 ，2 , 6 一d n t 使受试鱼生长率在5 0 天内的变化规律与对照 组不同。所有染毒组，在染毒l o 2 0 天时均刺激鱼类生长，2 0 天时生 长率高于对照组。随后生长率迅速降低，到3 0 天时，甚至出现负增长， 3 0 - - - 4 0 天生长率回升，4 0 天后与对照组生长率变化趋势大致相同。这 再次证实，2 , 6 - d n t 对实验鱼体重生长的抑制发生在实验开始后的 2 0 3 0 天。也正是因为这段时间的影响，使得以后的生长率即使与对照 组相差不多，受试鱼的体重仍然明显低于对照组。而且，5 0 天时，除 0 7 5 m g l 染毒组外，受试鱼的瞬时生长率也降低到与对照组基本相同， 2 2 1 m g l 染毒组受试鱼的生长率几乎降低到0 。那么，如果继续接触毒 物，即使受试鱼不会死亡，其体重较对照组的差距也将很大。至于是 否还会引起了鱼体发育不正常，还需进一步实验证实。 2 ，4 一d n t 对实验鱼生长率的影响 0 - 0 8 瞬o0 6 壁。 萎o o 。 o o1 02 03 04 05 06 0 时间( 天) 图3 - 4 2 , 4 - d n t 对虹鳙鱼瞬时生长率的影响 根据图3 - 4 ，中间浓度1 4 8 m g l 染毒组变化规律与其他两组有所 不同。0 7 5 m g l 染毒组在染毒0 2 0 天内刺激受试鱼体生长，1 4 8 m g l 2宝以雌0跳舛 0 o o o 0 o 瞬时生长率 染毒组与对照组生长率相差不多，2 2 1 m g l 染毒组比对照组生长率低。 在这段时间里，基本呈现随染毒浓度增大生长率降低的趋势。1 4 8 m g l 染毒组生长率自2 0 天后一直降低，到第4 0 天基本为0 。0 7 5 m g l 和 2 2 l m g l 染毒组2 0 3 0 天生长率下降，在第3 0 天下降到最低点，3 0 天后有所回升，但仍低于对照组。这表明，化合物以低浓度存在时， 根据受试生物接触时间和浓度的不同，其影响是相当复杂的。很可能 存在一个对生物危害最大的中间浓度，大于或小于该浓度时，产生的 毒作用均低于这一中间浓度。 4 n t 对实验鱼生长率的影响根据 o 0 8 翳o o e 生o 0 4 篓o o z 0 一o 0 2 时间( 天) 图3 - 54 - n t 对虹鲋鱼瞬时生长率的影响 如图3 - 5 ，4 - n t 的中间浓度2 2 1 m g l 染毒组变化规律与其他两组 有所不同。1 4 8 m e , l 和2 9 4 m g l 染毒组在染毒0 1 0 天内生长率低于 对照。在1 0 , , 一2 0 天提高到与对照组基本相同，随后在2 0 3 0 天内迅速 降低，3 0 - - - 4 0 天有所升高，之后再度降低至几乎为0 。而中间浓度 2 2 1 m g l 染毒组，在2 0 天内生长率变化规律与对照相符，2 0 3 0 天 内生长率变化曲线与其他两个浓度相似，3 0 天时生长率降低到负值， 随后继续降低。在3 0 4 0 天之间降到最低，随即开始上升，至5 0 天与 空白对照生长率基本相等。 m - d n b 对实验鱼生长率的影响 根据图3 - 6 ，m d n b 的o 7 5 m g l 染毒组o 1 0 天内，生长率高于 对照组，说明该浓度在短期内对虹鳝鱼生长有刺激作用。总体来讲， 在整个染毒的过程中，m d n b 使受试生物瞬时生长率低于对照组。 司圳圳_ 一置卫l 0 一 j 三 o 1 雏： 辇。0 0 4 。 。墓 图3 - 6m - d n b 对虹鳋鱼瞬时生长率的影响 所有染毒组在2 0 4 0 天内生长率变化趋势基本相同：从2 0 4 0 天内， 体重增长率迅速下降，到4 0 天达到最低点，其中最大浓度2 ，2 1 m g l 染毒组出现负增长。4 0 天后，0 7 5 m g l 和2 2 1 m g l 染毒组有所回升， 其中o 7 5 m g l 组在第5 0 天时回升到与对照组基本相似，2 2 1 m g l 染 毒组已经不再呈现负增长。而1 4 8 m g l 浓度下的生长率继续保持负值， 说明受试鱼体重在继续下降，如果这种下降继续持续下去，该组的受 试鱼体比其他两浓度更可能出现大批死亡。所以，浓度为1 4 8 m g l 时 的m d n b 对虹锵鱼而言更加危险。 2 。4 一d n a n 对实验鱼生长率的影响 0 1 瞬00 8 楚0 0 6 量0 0 4 量篷 0 0 2 o 一0 0 2 时间( 天) 图3 72 , 4 - d n a n 对虹鲋鱼瞬时生长率的影响 根据图3 7 ，2 ，4 - d n a n 的三个染毒组的生长率变化规律基本相同。 o 一1 0 天的变化比较复杂，2 2 1 m g l 染毒组与对照组相差不多，o 7 5 m g l 染毒组刺激鱼类生长，1 4 8 m g l 染毒组生长率稍低。自2 0 天开始各染 毒组的生长率迅速下降，到第3 0 天，三个染毒组均出现负增长，之后 生长率又逐渐上升。从4 0 天开始，按照受试物浓度由低到高的顺序， 生长率依次超过对照组。这表明2 , 4 d n a n 在生物体内的释放可能要比 其他四种化合物快。从长期来看，对体重绝对量的影响可能没有其他 四种化合物大。 ( 3 ) 综合分析 综合以上结果，5 0 天内各染毒组受试鱼死亡率较低，但体重、体 长生长均不同程度上受到影响。这印证了蓄积实验结果五种受试 化合物的蓄积能力较强，可产生亚急性损伤甚至导致慢性毒性影响。 每种化合物三种浓度下的生长率曲线大致相似，但与对照组均有 较大差异。这表明，五种化合物的确对虹鲻鱼的生长有较大影响。化 合物对鱼体重生长不仅仅是简单的抑制作用，在一定时间或剂量下可 能会刺激生长，但长期效应还是抑制。染毒期间，仅2 ，6 d n t 最高染毒 组一尾鱼死亡，但从5 0 天后各染毒组和对照组的形态特征来看，这五 种化合物使鱼的体色改变缓慢，其中2 ，4 d n a n 对鱼体色变化的影响较 其他四种化合物为轻。研究者曾对重金属镉对鲑鱼的5 5 天亚急性毒性 进行研究川，得出镉的蓄积多发生在死亡率较高的染毒组。这进一步 提醒我们，硝基芳烃的毒性作用机理与重金属不同，它虽然致死效应 不及某些重金属明显，但可以对水生生物的生长发育产生影响，至于 是否会影响到鱼体的生殖能力及后代的性别比例还需要进一步研究。 受试物对鱼生长的绝对量和瞬时生长率的影响，在染毒的2 0 3 0 天内最明显，可能因为这一阶段是鱼体生长的关键时期，能量需求较 大，也可能是因为化学物质的毒性机制造成的【7 。它们仅在o 7 5 m g l 或 1 4 8 m g l 浓度时就会严重影响幼鱼的生长发育，这要比它们的9 6 h l c 5 0 值 小1 0 , - 4 0 倍。可见，小剂量、长时间接触危险更大。 最后，需要特别指出的是，m d n b 作为五种化合物中急性毒性排 在第二位的化合物，蓄积及亚急性毒性均相当明显，它存在于环境中 可能带来的生态危害性影响不容忽视。 3 2 联合毒性效应 3 2 1 实验结果 以2 , 6 一d n t 为基础，进行二元、三元混合。按毒性1 ：1 进行实验， 结果如表3 - 8 ： 一与o墨爵。口一 一茜口l饥。峙i|一避譬 一葛。掣葛=)6心一 一乱焉n毒罢i)6誉i| 卜n _ 寸 一。昏=占c9一on口 一。罨卜占n崎口一。嗣卜 一occ0咕n旨凸也卜 一00冀西占芒一。罨 卜z o t n 一。专卜占与崞)0。卜 一on乱卜0嗣一。簧卜 【0饕0姜一。z6卜 一o嚣0姜】00宕 卜z年n 一譬嗣矗已口”。n h冀cn蛩n)9l n n 一冀卜，罱no。c_葛 一=。了。口n)。西昌 i i = 1 _n_革卜；呻矗+工吾_9n o。芒占警鲁一nh o一：占驾旨三 一。h苫s旨8h o。c8on旨n磊 l i v n 迕n 蔫ci，薹ni|一cci 一cc一o小2一蔓cl 葺!ein；一 一书夏一；蕞!】9! 卜n - 9 n 募。叩10。nao。n 乱啦。叩昌口一一nn o n ccnn矗三n一竺一 一书寸盘c盈岜乱nn 三 【v，it罕b2印口n oa一卜og_9)on。卜 。冀卜苦薹口一。口= 一。nqa0n巴。誉卜 一onq穹。寻一。18 一。西美苫西8)oq奇 一ont乱占口16)0凸节岳 一=n一i。h一瓮。一 一号n一oli一一c9一一 一口口一品=vc。一 一。=一占19l|一。也一 一吼cin&n=一墨i| acii|警i)荨。n i l ，口目 卜z 口- 9 n zoe占z口啦n onn一，nn n一一卜寸寸n 一nnh；寸nnn寸n 一口寸。ho卜n寸n一。n”n 一卜母non。nn一”n。一 一口。一0宣口一暑。一 三。一0趁口一蕞oi| i|兰一三吨。一一n卜。一 一口h_ii9。i|三一一 一盆o：e)磊鬲 一套西”叩簧ne)g鬻 一譬高占喜葛一gn c8冀8寸啦c)in高 i i z 寻 _ 7 o 9 n 卜z寸+lzo啦n 一是i|一毒n。一一罱。一 一n一一占舍1)8竺_ 一n竺i6zii)91一 一&n一9口nd9a篁 一冀=02。o=一一 一ni|：。一=一h卜= 一=竺oc9=)0= 一卜o c l o寸。ci并c_n一 一。nn6口ooe_ 一乱乱高品一)0icn 一乱乱瓮二直no篡n 一苌口notnn一一e_四一 三 卜z 凸寻n，h口，h 卜z凸tn+上zo_9n s 如基 ri，暑目逍辞巡蠼 ；。迫井厘曾 账好掣黼舡餐霉舡晕熏臣岬h，i-9n呻n懈 3 2 2 联合毒性评价 3 2 2 1 计算毒性单位及相加指数 计算混合物中各化合物的毒性单位及相加指数，如表3 - 9 所示 表3 - 9 毒性单位法评价化合物联合毒性 化合物时间兀，刖 2 ，6 一d n t + 2 ，4 - d n t 2 4 4 8 7 2 1 0 2 ( 0 5 2 + 0 5 0 ) 0 9 0 ( 0 4 5 + 0 4 5 ) 0 9 1 ( 0 4 6 + 0 4 5 ) o 0 2 0 1 1 0 1 0 ! ! ：堕! ：! 竺! ：竺! ! ：! 1 2 4 o 8 6 ( 0 4 4 + 0 4 2 1 0 1 7 2 ，6 d n t + 4 - n t 4 8 7 2 0 ，8 2 ( 0 4 1 + 0 4 1 ) 0 8 2 ( 0 4 1 + 0 ，4 1 1 0 ；2 2 0 2 3 墅! ：! 型：! ! ! ：! ! ! ! ：丝 2 4 0 8 6 ( 0 4 5 + 0 4 1 1 0 1 6 2 ，6 - d n t + m - d n b 4 8 7 2 0 8 0 ( 0 4 0 + 0 4 0 、 o 7 4 ( o 3 7 + 0 3 7 ) 0 2 5 0 3 6 堑! ：竺堕! ! ：! ! ! ! ：! 1 2 4 1