（环境工程专业论文）三种酚类环境荷尔蒙物质的监测新方法的研究.pdf

摘要 环境激素( e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e ) 是指外源性干扰生物和人体正常内分泌 机能的化学物质，能导致包括人类在内的各种生物的生殖功能下降、生殖器肿瘤、 免疫力降低，并引起生理异常。它们虽然与一些对人类和动物危害极大的剧毒物 质和致癌物质等不同，但对人类和动物生命的危害程度绝不亚于前两者，都属于 危害很大的有害化学物质。因此，当今世界上很多科学家正致力于环境雌激素污 染物方面的研究，这已成为国际研究的热点。 ， 目前，通过对环境中各类物质的鉴别和筛选，全球约1 0 0 0 万种各类化学物 质( 各种合成化学品) 中已有7 0 种显示雌激素活性，并被确认为环境激素类物质， 其中3 种为重金属( c d 、p b 、h g ) 激素。6 7 种为有机激素。在环境有机激素种类 中，化学农药类4 4 种( 以有机氯农药为主) ，占所有环境激素种类的6 3 。我国 是农业大国，化学农药的产量居世界第二，使用率居世界之最，因此它们对环境 的污染和生态的破坏也更为严重。 酚类环境激素以其毒性大和应用广泛的特点成为环境激素中一类典型的化 学物质。国内外对酚类环境激素物质的监测方法有紫外分光光度法( u 、气相 色谱法( g c ) 、液相色谱法( l c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、质谱联机法( o c m s 、 l c m s 、h p l c m s ) 、荧光光度法及免疫分析法等。其中，免疫分析法以其特异 性高的显著优点逐渐成为检测环境激素物质竞相研究的方法，但因整个分析研究 过程所需时间相对较长，国内外在这方面的报道还比较少。 本文研究了检测两种氯酚类物质( 五氯苯酚和2 ，4 二氯苯酚) 以及双酚a 的两 种新的监测方法。这两种方法用于检测这三种环境激素物质均可达到比较理想的 结果。 用荧光免疫法检测水中五氯苯酚( p c p ) 或2 ，4 二氯苯酚( d c p ) 残留时干扰很 少、特异性很好，这一点对于检测成份比较复杂的水样十分重要。含有p c p 和 d c p 的水样一般成份比较复杂，所以水样的前处理是一个比较难解决的问题， 而免疫法就利用抗原与抗体的特异性反应克服了这一难题。该法用于检测皮革中 的p c p 和水样中的d c p 残留线性范围宽、检出限低、干扰少，是环境激素物质 一种比较理想的新的检测方法。目前为止，国内外没有见过使用荧光免疫法检测 这两种氯酚类物质的报道，用免疫法检测氯酚类物质的报道也很少。 双酚a ( b p a ) 自身能发出荧光，因此通过改变一些相关的实验条件，在最优 条件下测其发出的荧光值即可用以定量。虽然荧光法测定b p a 在国外有过报道， 但由于当时检测仪器的影响及实验时所用条件的不同，最后的检测的结果并不十 分理想。本文中发现，在p h 为l 的酸性介质中，b 环瑚精对双酚a 荧光强度的 增强显著，由此建立了荧光法测定水中双酚a 残留的简单灵敏的方法。该法线性 范围宽( o 和3 0 0 0 p g l ) ，相对标准偏差为1 3 ，检出限低( 2 0 n g l ) ，用以检测p c 膜浸泡液中b p a 的残留量结果也令人满意。 关键词：环境激素五氯酚2 ，4 二氯酚荧光免疫法双酚a 荧光法 s t u d yo nt h em o n i t o r i n gm e t h o do ft h r e ep h e n o l c o m p o u n d so fe n v i r o n m e n t a lh o r m o n e a b s t r a c t e n v i r o n m e n th o r m o n e sa r eo n ek i n do fe x o g e n o u sc o m p o u n d sw h i c ha c ta s e s t r o g e n sa n di n t e r r u p tt h ee n d o c r i n es y s t e mo fa n i m a l sa n dh u m a n t h e yc a nr e s u l t i nm a n yp r o c r e a n ta n o m a l i e s ，s u c ha st h ew e a k e n i n go fp r o c r e a t i o nf u n c t i o n , t h e d e s c e n do fi m m u n i t ya b o r t i o na n dt h ec a n c e ro ft h er e p r o d u c t i v eo r g a n s a l t h o u g h l e ya r ed i f f e r e n tf r o mm a n yv i r u l e n tc o m p o u n d sa n dc a r c i n o g e n ，t h e i rh a r mt ot h e l i v e so fh u m a na n da n i m a l si s n o t h i n gl e s s t h a nt h o s es u b s t a n c e s t h u s ，m a n y s c i e n t i s t si nt h ew o r l dc o m m i tt h e m s e l v e st ot h es t u d yo fe n v i r o n m e n th o r m o n e sa n d t h i sp r o b l e mh a sb e c o m et oai n t e r n a t i o n a lh o t s p o t a tp r e s e n t ，7 0c h e m i c a lc o m p o u n d sa r ea f f i r m e dt ob ee n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s b yd i s t i n g u i s h i n ga n df i l t e r i n g10m i l l i o ns u b s t a n c e sa n d3a r eh e a v ym e t a lh o r m o n e s ( c d ，p b ，h g ) w h i l e6 7a r eo r g a n i co n e sa m o n gt h e m a m o n gt h eo r g a n i ch o r m o n e s ， 4 4a r ec h e m i c a lp e s t i c i d e sa n dt h e yo c c u p y6 3 o fa l lt h ee n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s c h i n ai sa ng r e a ta g r i c u l t u r ec o u n t r y , s ot h eo u t p u ta n dt h eu s i n ge f f i c i e n c yo ft h e c h e m i c a lp e s t i c i d e sa r er e s p e c t i v e l ys t a n d ss e c o n da n df i r s to nt h el i s ti nt h ew o r l d t h ee x t e n s i v eu s em a k et h ec o n t a m i n a t i o no ft h ee n v i r o n m e n ta n dd e s t r u c t i o no f z o o l o g yb e c o m ew o r s ea n dw o r s e p h e n o l i ce n v i r o n m e n t a lh o r m o n e si sat y p i c a lk i n do fe n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s b e c a u s eo ft h e i rg r e a tt o x i c i t ya n de x t e n s i v eu s e t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d si nt h e w o r l da r ea s f o l l o w s ：g a s c h r o m a t o g r a p h y ( g c ) ，l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( l c ) ， h i 曲- p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，g a sc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e d w i t hm a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) ，l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t hm a s s s p e c t r o m e t r y ( l c m s ) ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t l l m a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c - m s ) ，u vs p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d ( u v ) ，f l u o r e s c e n c e m e t h o d ，i m m u n o a s s a ya n a l y s i s ，e t c a m o n ga l lt h e s em e t h o d s ，i m m u n o a s s a yi st h e m e t h o dw h i c ht e n d st ob et h eo n em a n ys c i e n t i s t sw a n tt os t u d y , b u tr e p o r t sa b o u tt h e a s p e c ta r ec o m p a r a t i v e l yf e w t h i sp a p e rs t u d i e dt w on e wm e t h o d s ，r e s p e c t i v e l yd e t e r m i n e dt w oc h l o r o p h e n o l ( p e n t a c h l o r o p h e n o la n d2 , 4 一d i e h l o r o p h e n 0 1 ) a n db i s p h e n o la t h ed e t e r m i n a t i o no f t h r e ee n v i r o n m e n t a lh o r m o n e sc a na c h i e v ec o m p a r a t i v e l yp e r f e c tr e s u l t sb yu s i n g t h e s et w om e t h o d s t h ei n t e r f e r e n c ei sl i t t l ea n dt h es p e c i f i cc h a r a c t e ri sg o o db yi m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o dt od e t e r m i n ep e n t a c h l o r o p h e n o l ( p c p ) a n d2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o l ( d c p ) r e s i d u ei nw a t e r t h i sp o i n ti sv e r yi m p o r t a n tt od e t e r m i n ec o m p l i c a t e ds a m p l e s t h e s a m p l e sc o m p r i s e dp c pa n dd c pa r ec o m p l i c a t e d ，s ot h ep r e d i s p o s a lo ft h es a m p l e s i sap r o b l e mh a r dt os o l v ew h i l ei m m u n o a s s a ym e t h o do v e r c o m e st h i sd i f f i c u l t y b y u s i n gt h es p e c i f i cr e a c t i o no fa n t i g e na n da n t i b o d y t od e t e r m i n ep c pi nt h el e a t h e r s a m p l ea n dd c p i nt h ew a t e rs a m p l e ，t h i sm e t h o di sn e wa n dp e r f e c t , t h el i n e a rr a n g e i sw i d e ，t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i ti sl o wa n dt h ei n t e r f e r e n t i a lf a c t o ri sf e w u pt on o w , t h e r ei sn or e p o r tt od e t e r m i n et h e s et w oc h l o r o p h e n o l b yi n l r n u n o f l u o r e s c c n c e m e t h o d b i s p h e n o la ( b p a ) e m i t sf l u o r e s c e n c ei t s e l f , s oi tc a l lb eq u a n t i f i e db yc h a n g i n g s o m er e l a t i v et e s tc o n d i t i o n sa n dd e t e r m i n i n gt h ef l u o r e s c e n tv a l u eu n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n a l t h o u g ht h e r ei sar e p o r to fd e t e r m i n a t i o no fb p ab y f l u o r e s c e n c em e t h o d ，t h er e s u l ti sn o tg o o dp r o b a b l yb e c a u s eo ft h ee f f e c to ft h e a p p a r a t u sa n dt h et e s tc o n d i t i o n i nt h i sp a p e r , b a s e do nt h ee n h a n c e de f f e c to fb c d i nt h ea c i d i cm e d i u m ，as i m p l ea n ds e n s i t i v ef l u o r e s c e n c em e t h o di se s t a b l i s h e dt o d e t e r m i n eb p ar e s i d u ei nw a t e r t h el i n e a rr a n g ei sw i d e ( o 4 3 0 0 o r , g l ) ，t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o ni s1 3 a n dt h ed e t e r m i n a t i o nl i m i ti sl o w ( 2 0 n g l ) t h er e s u l tt o d e t e r m i n eb p ar e s i d u ei np cm e m b r a n ed i p p i n gs a m p l ei sa l s op e r f e c t s h u y at a n g ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db yh u i s h e n gz h u a n g ( p r o f e s s o r ) k e yw o r d s ：e n v i r o n m e n t h o r m o n e ；p e n t a c h l o r o p h e n o i ；2 , 4 - d i c h i o r o p h e n o l ； i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d ；b i s p h e n o la ；f l u o r e s c e n c em e t h o d 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的 内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：夕鸯韶节 日期：拶年、月步e t 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密曰，在二l 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位做储硌惭 日期：扩年；月io 日 指删币签毋耋筮 日期：埘年弓月纱日 东华大学硕士学位论文 1 1环境激素概述 1 1 1 环境激素的定义 第一章绪论 环境激素至今还没有一个让大家都能接受的定义，根据目前的研究概况，以 下表述相对简洁准确：环境激素( e n v i r o n m e n th o r m o n e ) 是指环境中存在的能干扰 人类或野生动物内分泌系统诸环节并导致异常效应的物质【l 】。 美国环境保护组织内分泌干扰物筛选测试咨询委员会( e n d o c r i n ed i s r u p t o r s c r e e n i n ga n dt e s t i n ga d v i s o r yc o m m i t t e e ，简称e d s t a c ) 将这些能通过干扰激素 功能，引起个体或人群可逆性或不可逆性生物学效应的环境化合物称为“环境内 分泌干扰物( e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s 或e n d o c r i n ed i s r u p t e r s ) 。e e d s ，有 些学者将之称为“环境激素”，也有学者将之称为“环境荷尔蒙”，日本厚生省则 将环境内分泌干扰物命名为“导致内分泌障碍的化学物质”【2 】。 环境激素在国际组织或杂志上的使用名称也多种多样i b ，如s y n t h e t i c h o r m o n e s ( 合成荷尔蒙) 、e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s ( 环境荷尔蒙) 、内分泌搅乱物质、 e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ( 环境雌激素) 、e n d o c r i n e - m o d u l a t o r s ( 内分泌调节剂) 、 x e n o e s t r o g e n s ( 外源性雌激素) 、e n d o c r i n e a c t i v ec o m p o u n d s ( 内分泌活性物质) 、 e x o g e n o u se n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ( 外因性内分泌干扰物) 、h o r m o n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ( 荷尔蒙干扰化学物质) 、h o r m o n ed i s r u p t o r s ( 荷尔蒙干扰物) 、 e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t o r s ( 环境内分泌干扰物质，e e d s ) 等。 环境激素通过各种途径直接或间接进入人体后，影响人类生殖系统、免疫系 统、神经系统、心血管系统的正常机能，并引发癌症。因此，环境激素问题己日 益成为科学家关注的重大环境问题，并迅速成为国际环境科学领域中的热点。 1 1 2 环境激素的危害 内分泌系统、神经系统和免疫系统是人类机体的三大信息传递系统，在调节 机体各种功能、维持内环境相对稳定中起重要作用。内分泌系统在包括胚胎发生、 东华大学硕士学位论文 分化和稳态机制在内的许多生理过程中发挥着极其重要的作用。激素是内分泌腺 天然产物，血中以低浓度传递，与靶细胞受体结合，发挥对机体功能的调节作用。 人类可通过消化道、呼吸道、皮肤等途径接触e e d s 。人工合成的脂溶性化 合物大多具有e e d s 效应，它们能在动物和人体脂肪组织中长期滞留，每人都可 能由于以往的暴露或正在摄入而承受一定的e e d s 负荷。当体内蓄积的e e d s 在 应激( 包括某些疾病) 、妊娠及营养不良时，就从脂肪组织中释放出来进入血液， 并可能引起相应的生物学效应【3 l 。环境激素的生物学效应包括对内分泌系统的影 响、对生殖与发育的影响、致癌作用、神经系统毒效应和对免疫系统的影响等。 1 1 3 环境激素问题的产生及国内外研究进展 1 1 3 1 问题的产生 4 1 1 9 2 3 年，人类首次从生物体内提出雌性荷尔蒙活性物质。 1 9 3 8 年，人们首次合成防止流产的药物乙烯雌酚( d e s ) ，这种合成雌性 激素在诞生的同时就被指出有导致恶性肿瘤的危险。 1 9 5 0 年，发现滴滴涕( d d t ) 显示活性雌性荷尔蒙特征。 1 9 5 8 年，美国修改食品包装法，明确规定在包装肉类等油性食品时禁止使 用聚氯乙烯材料。 1 9 6 2 年，雷切尔卡索在其寂静的春天【5 】一书中指出，野生动物的繁殖 能力下降，其原因是撒播的大量农药所致。 1 9 6 8 年，人们发现d d t 对哺乳类动物和鸟类产生雌性激素影响。 1 9 7 0 年，美国为预防流产给孕妇注射合成激素d e s ，导致出生女婴患子宫 癌的恶性事件。此后人们开始担心向环境释放的大量d d t 或多氯联苯( p c b s ) 等 化学物质会产生不良副作用。 1 9 7 2 年，d d t 禁产，世界卫生组织( w h o ) 指出化学物质造成内分泌紊乱。 1 9 7 3 年2 月，经济合作与发展组织( o e c d ) 限产聚氯乙烯。 19 7 5 年，国家环境健康科学研究所( n i e h s ) 在( ( s ci e n c e ) ) 上指出d e s 引起 不育，同时弗州1 4 名工人调查发现精子异常。 1 9 7 6 年，美国禁产p c b s 。 1 1 3 2 国际上环境激素问题的研究进展 东华大学硕士学位论文 1 9 7 9 年，首次“环境雌激素”会议举行。之后，美国在1 9 9 1 、1 9 9 3 、1 9 9 5 年先后举办了3 次环境雌激素学术研讨会1 6 1 。 1 9 8 4 年，日本厚生省发表二恶英类化学物质的有关判断报告【4 l 。 1 9 9 0 年，日本厚生省做出“防止二恶英类污染的标准”【4 】。 1 9 9 2 年，丹麦发表调查结果：在过去5 0 年中男性精子数下降了一半【4 l 。 1 9 9 5 年，丹麦环境厅( d e p a ) 做出报告，内容包括男性生殖与雌性荷尔蒙 之间的影响关系【4 1 。 1 9 9 6 年美国波士顿环境报记者安达玛诺斯基在被偷走的未来一 书总结了世界各国学者对环境物质的研究结果，首先提出“环境激素一词【7 j 。 1 9 9 7 年1 月，在美国白宫召开的会议上进一步讨论了目前各国研究现状， 同时表明了开展国际合作研究的必要性【4 】。 1 9 9 8 年6 月，日本成立了“环境荷尔蒙学会”【4 1 。 2 0 0 1 年5 月2 2 - 2 3 日，来自1 0 0 多个国家的环境部长等高级官员( 包括我国 环境保护总局副局长祝光耀) 在斯德哥尔摩召开的联合国环境会议上1 4 】，讨论通 过并正式签署了关于持久性有机物污染的斯德哥尔摩公约，决定在全世界范 围内禁用或严格限用1 2 种有机污染物：艾氏剂、氯丹、狄氏剂、异狄氏剂、七 氯、灭蚁灵、毒杀芬、滴滴涕( d d t ) 、六氯合苯( 六六六) 、多氯联苯( p e a s ) 、 二恶英和呋喃。其中，艾氏剂、氯丹、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、灭蚁灵和毒杀 芬七种杀虫剂被完全禁止生产和使用；d d t 由于仍是一些国家目前所使用的唯 一有效杀虫剂，已被严格控制使用，并将尽快被其它杀虫剂取代；p c b s 目前仍 需要应用于变压器电容器等工业设备上，将在2 0 2 5 年起被禁用：二恶英和呋喃 是在燃烧和工业生产过程中产生的副产物，各国需要采取措施将其数量限制在最 低范围内。 目前，世界卫生组织、联合国协同化学品安全国际规划署、国际纯化学与应 用化学会、野生动物基金会、欧美各国、日本等相继开展了这方面的工作，每年 在自然、科学、g e s & t 等著名的国际性杂志上都有许多研究结果发表【6 】。 1 1 3 3 国内对环境激素问题日益重视 1 9 9 7 年，我国代表参加了在美国华盛顿召开的e e d s 国际会议。此次会议强 调在中国建立和验证e e d s 的甄别方法是当务之急【6 1 。2 0 0 0 年，国家自然科学基 东华大学硕士学位论文 金委员会以“环境激素影响人类健康的机理”为重点项目予以招标，正式启动环 境激素类物质污染、毒效应与机理方面的大规模研究1 6 1 。2 0 0 0 年度国家高技术研 究发展计划纲要“新概念、新构思探索”课题项目中就确立了环境激素效应的研 究课题【针。国家自然科学基金委员会也在2 0 0 1 年的资助项目中重点资助“低剂 量典型环境污染物( 包括内分泌于扰物) 长时期暴露的环境效应和生物效应危险 性在研究方法学上的创新研究 【9 】。 当今，随着e e d s 研究工作的蓬勃发展，国外建立了许多关于e e d s 的网站， 我国清华大学也构建了环境荷尔蒙网站【4 】，收集了近年来有关e e d s 的大多数研 究成果，为这项工作的开展和深化提供了参考资料，也为同行专家们的相互交流 提供了场所。 1 1 4 环境激素的分类 到目前为止，国际上确认为环境激素的物质有7 0 种，包括6 7 种有机物及镉 ( c d ) 、铅( p b ) 、汞( h g ) 三种重金属。其分类方式主要有以下几种： ( 1 ) 按来源可分为四类：天然雌激素、植物性雌激素( p h y t o e s t r o g e n s ) 和真菌 性雌激素( m y c o e s t r o g e n s ) 、人工合成雌激素、环境化学污染物【5 1 。 ( 2 ) 按一般用途可分为八类：除草剂、杀虫剂、杀菌剂、防腐剂、塑料增塑 剂、洗涤剂、副产物如二恶英类、其它化合物如多氯联苯类( p c b s ) 等【6 】。 ( 3 ) 按结构特性可分为五类：含卤素化合物、含硫化合物、不含卤素和硫的 化合物、菊酯类化合物、重金属【1 0 。 ( 4 ) 按作用功能可分为四类：模拟干扰雌激素的环境化学物、干扰睾酮的环 境化学物、干扰甲状腺素的环境化学物、干扰其它内分泌功能的环境化学物【1 1 1 。 ( 5 ) 按化学结构可分为以下几类：多氯联苯类、邻苯二甲酸酯类、氯代烃类、 芳香族碳化氢类、烷基酚类、双酚类、联苯酚类、氯酚类、金属类、硝基苯类、 呋喃类、有机锡类等。 ( 6 ) 另外，世界野生动物基金会( w w r ) 将环境内分泌干扰物分为六类：工业 有机化合物、杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、金属【1 2 】。 东华大学硕士学位论文 1 1 5 环境激素的作用机制【1 3 】 ( 1 ) 与受体直接结合 环境激素模仿天然激素，与激素结合位点结合，形成配体受体复合物，配 体受体复合物再结合在d n a 结合区的d n a 反应元件上，从而影响入和动物的 生殖能力。 ( 2 ) 与生物体内激素竞争靶细胞上的受体 通过竞争的结果，环境激素与靶细胞上的受体结合，减少受体对天然激素的 吸附，从而增强了天然激素的作用。 ( 3 ) 阻碍天然激素与受体的结合 天然激素与受体的结合受环境激素的阻碍，进而影响激素信号在细胞、器官、 组织的传递，导致机体功能失调。 ( 4 ) 影响内分泌系统与其它系统的调控作用 内分泌系统与免疫、神经、生殖等各个系统相互影响、相互制约，内分泌系 统的紊乱使其它系统受到伤害，从而引发致癌性、免疫毒性、神经毒性等。 ( 5 ) 协同作用 环境激素的种类繁多，存在各化学物质的协同作用，协合作用的强度远远高 于单独作用的强度，且它们之间的协同作用因组合的不同而不同，致毒机理十分 复杂。 1 2 酚类环境激素概述 1 2 1 酚类环境激素的种类及用途 卤代芳香族化合物是应用广泛，具有环境毒性的难降解有机物，其中重要的 一类是卤代酚。卤代酚中应用最广泛的是氯酚。氯酚常作为木材的防腐剂、除草 剂、杀菌剂、溶剂、热交换的工业生产废弃物而释放到自然环境中，给自然环境 造成了很大危害。 美国环境保护局( u s e p a ) 在1 9 7 7 年提出的6 5 类1 2 9 种优先污染物 ( p r i o r i t y p o l l u t a n 0 中，包括了1 1 种酚，2 氯酚、2 ，4 ，6 三氯酚、2 ，4 二氯酚、五氯 酚均在其中1 1 4 。到目前为止，已经列入环境激素的典型酚类物质主要为：氯酚 东华大学硕士学位论文 ( c h l o r o p h e n o l s ，c p s ) 、烷基酚( a l k y l p h e n o l s ，a p s ) 、羟基联苯( h y d r o x yb i p h e n y l ) 、 双酚a ( b i s p h e n o la ，b p a ) 等。其中氯酚类包括：五氯酚、2 ，4 二氯酚，2 ，4 ，6 三氯 酚等；烷基酚类包括：4 壬基酚、4 辛基酚、4 一叔辛基酚、2 叔丁基酚、4 叔丁 基酚、2 仲丁基酚、4 仲丁基酚、4 乙基酚等；羟基联苯类包括：2 羟基联苯、 3 羟基联苯、4 羟基联苯等。 氯酚由于其本身芳环结构和氯代原子的存在而具有很强的毒性和抗降解能 力。这是由于氯原子的p 电子和苯环上的电子形成稳定的共扼体系的缘故。同 时氯原子的存在抑制了苯环裂解酶的活性，从而增加了它们的抗生物降解能力， 并且这种抗降解能力随着氯原子取代位置的不同而变化。 d d t 等有机氯代化合物属于第一代化学合成农药，其中一部分已被禁用。 二恶英主要是垃圾焚烧及氯酚农药生产过程中的副产物，而典型的酚类雌激素的 来源则与日常生活关系十分密切。例如，a p s 大量用于合成非离子表面活性剂烷 基苯酚聚氧乙烯醚( a l k y l p h e n o l e t h o x y l a t e s ，简称a p e o s ) 。a p e o s 广泛用于洗涤 用品和工业加工助剂中，如金属表面、纺织品加工业和食品加工业的清洗剂和家 用洗涤剂及造纸、印染和农药生产中的分散剂、乳化剂和漂浮剂等。又如，双酚 a ( b i s p h e n o la ，b p a ) 是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料。在婴儿奶瓶、微波 炉饭盒及其它许多食品饮料的包装材料中都用到聚碳酸酯和环氧树脂。以b p a 为原料制成的树脂用作牙齿填充物和包封剂时，b p a 可从治疗后的牙齿渗漏到唾 液中。在用聚碳酸酯作衬漆的罐装食物中也检测出了b p a 。因此，自从s o t o 和 k r i s l m a n 分别报道了4 一壬基苯酚( 4 - n o n y l p h e n o l ，简称4 - n p ) 和b p a 在哺乳动物 体内的弱雌激素活性后，与其相关产品的环境和健康影响立即引起人们的普遍关 注【1 5 】。 氯酚在工业、农业和家庭中的使用超过3 0 年，因此，它是环境( 水和土壤) 中最主要的污染源。作为水环境严重的污染源，酚类衍生物被列入美国环保署 ( e p a ) 汇编的一张清单【1 6 - 1 7 】，其中，尤为氯酚毒性最大且有潜在的致癌可能。 1 2 2 酚类环境激素的监测方法 目前用于检测酚类环境激素的方法有：紫外分光光度法( u v ) 、气相色谱法 ( o c ) 、液相色谱法( l c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、质谱联机法( g c m s 、l c m s 、 东华大学硕士学位论文 h p l c m s ) 、极谱法、荧光光度法、免疫分析法等。 免疫分析法不受周围环境和样本内干扰物质的影响，具有灵敏度高、选择性 高、稳定性强及简单方便经济的优点，在国内外的实际应用取得的成就不可低估， 可进行百余项微量物质的检测，产生了良好的社会效益和经济效益。 1 3 本课题的研究对象 1 3 1 五氯苯酚 1 3 1 1 理化性质 五氯酚，白色针状结晶。易溶于乙醇和乙醚，溶于苯，微溶于石油醚，不溶 于水。熔点19 0 - 19 1 ，沸点3 0 9 , - - 310 ( 2 ( 分解) 。英文全名p e n t a c h l o r o p h e n o l ， 简称p c p 。分子式为c 6 ( c l 5 ) o h 或c 6 h c l 5 0 ，分子量为2 6 6 3 4 ，化学结构式如下： o h c i c l c i c i 1 3 1 2 危害及应用 五氯酚( p c p ) 最早引入工业使用是在1 9 3 6 年【1 8 】，是全世界最广泛使用的生 物杀灭剂( 杀真菌剂、杀虫剂、除草剂等) 之一。p c p 在生产和使用中的应用包 括：木材、涂料、皮革、绳索、电缆、合股线、粗麻布及帆布的保存；冷却塔内 藻类及真菌类的抑制；夹板和纤维板的防水试验；照相溶液中菌类和粘液的控制。 作为除草剂，p c p 被用于稻谷、菠萝和甘蔗田。五氯酚及其降解产物多氯酚在我 国长期用于消灭稻田内寄生血吸虫的钉螺。 p c p 的环境来源可能有以下几个方面：( 1 ) 生物杀灭剂的直接应用；( 2 ) 从 处理过的木材中散发；( 3 ) 废水处理装置中常规氯化过程的合成反应；( 4 ) 从工 厂中释放进入空气和水源。 p c p 在获得广泛应用的同时，所造成的环境问题也受到人们的高度重视，美 国环境保护局2 0 世纪7 0 年代已将其纳入优先污染物名单，1 9 8 9 年德国最先禁 止使用【1 9 1 。p c p 被认为是氯酚中最具毒性的一种酚，它可能会造成系统的紊乱， 更有甚者，在高剂量急性中毒时可能导致死亡。皮肤直接接触p c p 也可引起病 东华大学硕士学位论文 变或死亡。p c p 很难降解，在环境中迁移转化后，还会产生极少量的二恶英，后 者对生殖效应影响较大，有致畸效应。p c p 可经口、皮肤及呼吸道进入人体，高 浓度可引起急性中毒，低浓度可蓄积于体内，引起慢性危害。现在五氯酚已经被 列入世界上1 2 种危害大的持久性有机污染物，同时也被确认为环境激素类物质。 对五氯酚的毒性、降解性及其污染的生物修复等研究，一直是国际环境学、医学 等学科的研究热点之一。 1 3 1 3 现有检测方法 目前常见的测定p c p 的监测分析方法有g c 法f 2 0 - 2 4 、g c m s 法f 2 5 之7 1 、 g c e c d 法【2 8 - 2 9 1 ，h p l c 法【3 0 - 3 2 1 、分光光度法【3 3 】、酶联免疫法( e l i s a ) 3 4 1 ，另 外，被采用过的检测方法还有高效毛细管电泳一电化学检测方法【3 5 1 、p v c 膜p c p 阴离子电极测定法【3 6 1 、串联质谱法f 3 刀、导数示波极谱法f 3 8 1 等。 1 3 2 2 ，4 _ 二氯苯酚 1 3 2 1 理化性质 2 ，4 二氯苯酚，白色固体。溶于乙醇和四氯化碳，微溶于水。熔点3 7 4 0 c ， 沸点2 0 9 2 1 0 。c 。英文全名2 ，4 d i c h l o r o p h e n o l ，简称d c p 。分子式为c 1 2 c 6 h 2 0 h 或c 6 h 4 c 1 2 0 ，分子量为1 6 3 0 0 ，化学结构式如下： c c j o h 1 3 2 2 危害及应用 2 ，4 一二氯苯酚是一种重要的有机中间体。在农药工业上主要用于生产杀虫 剂酚线磷与除草剂恶草酮、甲酯除草醚、除草醚、2 ，4 一二氯苯氧系列酸( 如乙酸、 丙酸、丁酸) 及其酯：在医药工业上用于生产驱虫药硫双二氯酚；在助剂工业上 用于生产防霉剂。 1 3 1 3 现有检测方法 国内外对2 ，4 二氯酚检测方法报道得比较少，主要的检测方法有g c 3 9 、 h p l c 3 s 】、毛细管电泳电化学检测法( c e e d ) 1 4 0 等。 东华大学硕士学位论文 1 3 3 双酚a 1 3 3 1 理化性质 双酚a ，即2 ，2 二( 4 羟基苯基) 丙烷，结晶或白色鳞片。微有酚的气味。溶 于碱溶液、乙醇、丙酮、乙酸、乙醚和苯，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。熔 点1 5 0 - - 1 5 5 ，沸点2 2 0 ( o 5 3 k p a ) 。约2 6 0 。c 分解，有刺激性。英文全名2 ，4 d i ( 4 一h y d r o x y p h e n y l ) p r o p a n e 或b i s p h e n o la ，简称b p a 。分子式为c 1 5 h 1 6 0 2 ，分 子量为2 2 8 2 9 ，化学结构式如下： 1 3 3 。2 危害及应用 b p a 常用于有机合成，是生产聚碳酸酯( p c ) 树脂及环氧( e p ) 树脂的主要原 料，也可用作酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯( p v c ) 的稳定剂。很多 产品中都能发现b p a 的存在，如罐头内壁、粘合剂、地板、人造牙齿、指甲油、 食品包装材料等h 1 1 。 1 3 3 3 现有检测方法 到目前为止，b p a 的检测方法有：双波长分光光度法 4 2 1 、g c 法 4 3 删、l c 4 5 4 7 】、 g c m s 法 4 8 - 5 6 、h p l c 法【5 7 石”、高效液相色谱一紫外法( h p l c u v ) 【6 4 1 、l c - m s 法【6 5 删、反相液相色谱法【6 7 1 、极谱法【6 8 7 0 1 及e l i s a 法f 7 1 - 7 2 等。而对于荧光法， 国内仍未见报道，国外曾有人作过这方面研究【7 3 。7 4 】，但检测结果并不理想。 1 4 本课题研究的主要内容及其研究目的 1 4 1p c p 及d c p 荧光免疫监测新方法的研究 依靠免疫学的基本理论和生化技术手段，将环境激素中两种氯酚类物质 叫c p 和d c p 以半抗原的形式与载体蛋白连接，得到相应的全抗原，用这两 种全抗原分别免疫动物制备出对小分子分析物有特异性的抗体，通过一系列方法 对所得抗体进行纯化，并采用荧光物质对纯化抗体进行标记。利用抗原抗体的特 东华大学硕士学位论文 异性反应，通过间接和直接竞争荧光免疫的方法对原物质即p c p 和d c p 进行测 定，具有特异、灵敏、准确等特点。从而初步建立荧光免疫法监测酚类环境激素 物质的新技术。 1 4 2b p a 荧光光度监测新方法的研究 b p a 也是环境激素的一种，它自身能发出荧光，对其最佳激发波长加以确定 后，在其发射波长下对其产生的荧光进行检测，荧光强度值与b p a 浓度有良好 的线性关系。通过加入合适的表面活性物质和调整溶液p h 值等反应条件的优化， 使b p a 在浓度较低时也能检测出明显的荧光强度。在优化条件下作标准曲线， 并检测水样中残留的b p a 浓度，从而建立荧光光度法检测水中b p a 残留的监测 新方法。 1 5 技术路线 本课题中采用荧光免疫分析方法检测两种氯酚类环境激素五氯酚和 2 ，4 - 二氯苯酚，并采用荧光光度法检测另一种酚类环境激素双酚a 。其技术 路线分别见图1 - 1 、图l - 2 。 图1 - 1 荧光免疫法检测两种氯酚类环境激素技术路线 f j 晷1 - i t e c h n i c a lr o u t eo ft h ed