（分析化学专业论文）应对化学生物袭击的微生物传感技术及其应用研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名： 刘牛 导师签名： 日期：2 竺1 2 ：s 日期： 垒! 起 摘要 应对化学生物袭击的微生物传感技术及其应用研究 摘要 关键词：发光细菌，大肠杆菌，传感器，毒性 近几十年来，环境污染物的种类、数量显著增加，由于毒性物质排放所造成 的污染对人类构成严重威胁，因此迫切需要进行毒性鉴定，从而为环境和生态系 统的安全提供早期的预警。现行的毒性测试方法包括浮游生物( d m a g n a ) 、藻类、 鱼类试验，试验周期长、操作复杂。 其中发光菌因其独特的生理特性、与现代光电检测手段相匹配的特点，更由 于其相比于其他生物的快速、经济、节省空间且可靠等优点而备受关注，由此发 展了利用发光菌进行毒性检测的方法。然而，传统的微生物环境监测方法通常采 用离线分析方法，其缺点是分析速度慢、操作复杂且需要昂贵的仪器，不适宜进 行现场快速监测和连续在线分析，因此，建立和发展连续、在线、快速的现场监 测体系尤其重要。 本论文研究了发光细菌及大肠杆菌电化学传感技术，将其用于应对化学生物 袭击毒物毒性的评估，相对于传统的检测方法，具有检测速度快，灵敏度高的优 点；同时也能用于对纳米氧化物紫外屏蔽性能的评估，根据细菌发光强度或电流 响应下降的相对值建立了一种新的纳米氧化物紫外屏蔽性能的评估方法，可对纳 米氧化物在u v a 、u v b 、u v c 区的紫外屏蔽性能分别进行评估。本论文分为两大部 分： 第一部分应对化学生物袭击的微生物传感技术及其应用研究 。绪论 本章分为化学生物袭击物的毒性测试方法概述，微生物传感技术在污染物生 物毒性分析中的应用，微生物传感器的固定化技术三个部分。简要综述了生物毒 性测试方法的发展，在此基础上着重综述了发光细菌毒性测试法的产生和原理以 及发光细菌检测法的应用；综述了微生物传感器研究进展及在污染物生物毒性分 析中的应用；对微生物传感器的固定化技术以及溶胶凝胶生物传感器也进行了综 2 0 0 7 届博士学位论文 1 摘要 述。 2 利用发光细菌和大肠秆菌电化学传感技术对毒鼠强和氰化物的毒性分柝 采用一种发光细菌一青海弧菌，利用其自身发光的特性，当毒物袭击细菌后 发光强度会相应降低，将其用于对氰化物和毒鼠强等的毒性检测。同时制备了一 种纳米p b 0 2 a g o 修饰电极，利用大肠杆菌在一定电位下在电极表面产生电流响 应，该电流大小与待测样品的毒性有关，据此进行毒性检测。上述方法结合g c - m s 及离子色谱法对毒物进行定性和定量测定。结果表明，该方法相对于传统的毒物 测试方法具有反应迅速，灵敏，所需试样量少等特点。同时，该方法还可推广应 用到对其他有毒化学物质的毒物分析。 参发光细菌传感器的硪青g 及其在农药毒性评信中瞻应用 以青海弧菌作为指示生物，利用其自身发光的特性，当毒性物质袭击细菌后 发光强度会相应降低，将其作为传感器的敏感元件，利用溶胶凝胶技术将青海弧 菌固定化成膜，与高灵敏度的硅光片组合，构筑细菌发光传感器，并以几种有机磷 和有机氯农药为毒性对象进行测定，急性毒性实验以传感器与受试物作用后发光 强度被抑制5 0 所需的受试物浓度l l p e c 5 0 表示，实现了对有毒物质急性毒性的快 速检测。本方法具有检测速度快，灵敏度高，重现性好等特点，并能进行在线检 测，在污染物急性毒性检测中有良好的应用前景。 囔，核壳型c d t e s i 0 2 荧光纳米复会粒予的制各及其在发光细蘑传感器毒性评馕 v 申的应甩 利用反相微乳液法，以巯基乙酸( h s c h 2 c o o h ) 修饰的水溶性c d t e 量子点为 核，包裹s i 0 2 ，制备得到c d t e s i 0 2 荧光纳米复合粒子。利用溶胶凝胶技术将青 海弧菌及c d t e s i 0 2 荧光纳米复合粒子固定化成膜，与高灵敏度的硅光片组合， 构筑细菌发光传感器，发现掺杂t c d t c s i 0 2 荧光纳米复合粒子的细菌发光传感 器与未掺杂c d t e s i 0 2 荧光纳米复合粒子的细菌发光传感器相比，信号响应值得 到了提高，这可能是由于细菌的生物发光二次激发了荧光纳米复合粒子的荧光， 从而使响应信号得n t 较大的提高。实验结果表明掺杂了c d t e s i 0 2 荧光纳米复 2 0 0 7 届博士学位论文 2 摘要 合粒子的细菌发光传感器与未掺杂c d t e s i 0 2 荧光纳米复合粒子的细菌发光传 感器相比，对毒性物质的检测灵敏度得到了较大的提高，方法具有很好的应用前 景。 羹a 弹生物发光法在微生物检测中的应慝 a t p 广泛存在于各种活的生物体中，活的细菌菌体中，因此通过测定样品中 的a t p 浓度可换算成活体菌数，并与传统的平板计数法进行比较。采用a t p 生 物发光法，并探讨了实验的最佳条件。与标准方法比较，本方法简单、快速。 第二部分微生物传感技术在纳米氧化物紫外屏蔽性能评估中的应用 氟发光细菌在纳米氧化物紫纬屏蔽性能评信中的应爝 采用一种发光细菌一青海弧菌，利用其在紫外光照射条件下由于细胞的活性 受到损伤而发光强度降低，将其应用于纳米氧化物紫外屏蔽性能的评估；讨论了 不同材料以及不同浓度的纳米氧化物对紫外光照下细菌发光强度的影响，并根据 细菌发光强度下降的相对值建立了一种新的纳米氧化物紫外屏蔽性能的评估方 法，四种纳米氧化物的紫外屏蔽性能依次为f l u k a - t i 0 2 p 2 5 t i 0 2 c f a t i 0 2 z n o 。 荔大肠细菌电化学传感技术在纳米氧化物紫外屏蔽性能评估中媳应耀 采用电沉积法制备了一种纳米p b 0 2 a g o 修饰电极，大肠杆菌在一定电位下 在该电极表面存在电流响应，氧化电流大小与大肠杆菌的浓度在一定范围内呈 良好的线性关系。因此该电极可作为微生物传感器用于大肠杆菌菌数的测定，其 反应的机理可能是由于在较高电位下，p b 0 2 a g o 修饰电极表面产生的强氧化性 羟基自由基氧化了大肠杆菌细胞壁中的活性物质，并产生了氧化电流。将该电极 用于测定紫外光照条件下大肠杆菌在有无纳米氧化物紫外屏蔽剂时存活率的变 化，为纳米氧化物的紫外屏蔽性能评估和纳米氧化物紫外屏蔽剂的筛选提供了一 种新的电化学手段。 2 0 0 7 届博士学位论文 s t u d yo nt h em i c r o b i o s e n s o rt e c h n o l o g yr e s p o n d i n gt o t h ea t t a c ko fc h e m i c a l sa n dm i c r o b i a i a b s t r a c t k e w o r d s ：l u m i n e s c e n tb a c t e r i a , e c o l i ，s e n s o r , t o x i c i t y i nr e c e n ty e a r s t h ek i n d sa n da m o u n to fc o n t a m i n a n th a v eb e e ni n c r e a s i n g r e m a r k a b l y t h et o x i c i t y a s s e s s m e n ti sn e e d e du r g e n t l yf o rt h es a f e t yo ft h e e n v i r o n m e n t b i o a s s a yt e s t st h a te m p l o y e da w i d e r a n g eo f m e t h o d sh a v eb e e nu s e dt o m o n i t o rt h et o x i c i t yo fc h e m i c a l st oa q u a t i co r g a n i s m s ，i n c l u d i n gp l a n k t o nt e s t , a l g a t e s ta n df i s ht e s t , w h i c ha r et i m ec o n s u m i n ga n d c o m p l i c a t e d l u m i n o u sb a c t e r i ah a sc a u g h tm u c hi n t e r e s tf o ri t s s p e c i f i cp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i ca n dg o o dm a t c ho fp h o t o e l e c t r i cm e a s u r e m e n t sa n da p p l i e dw i d e l yt o t h ee n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g h o w e v e r , t r a d i t i o n a lm i c r o b i o lm e t h o d su s e df o rt h e e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga r en o t0 1 t - l i n e , w h i c hh a st h ed i s a d v a n t a g eo fs l o w a s s e s s m e n t , c o m p l i c a t e do p e r a t i o n , a n du s i n ge x p e n s i v ei n s t n n n e n t t h c r e f o r e ，t h e d e v e l o p m e n to fo n - l i n em o n i t o r i n gs y s t e mt h a tc a nw o r kc o n s t a n t l ya n dr a p i d l yi s v e r yi m p o r t a n t i nt h i sp a p e r , t h el u m i n o u sb a c t e r i as e l l s o rt e c h n o l o g ya n de c o l ie l e c t r o c h e m i c a l s e i l s o rw c h n o l o g yw f f f ed e v e l o p e df o rt h ea s s e s s m e n to f t h ee n v i r o n m e n tc o n t a m i n a n t c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s ，t h e s em e t h o d sw e r er a p i da n ds e n s i t i v e b e s i d e s ， t h e s es e n s o r sw e r ea l s ou s e df o rt h ee v a l u a t i o no ft h eu v - s h i e l d i n gp r o p e r t yo f n a n o o x i d e t h i sp a p e ri n c l u d e st w os e c t o r s p a r t1 ( c h a p t e r ”o v e 触w i nc h a p t e r1 ，w ef t r s a yg i v ea ni n t e r v i e wo ft h et o x i c i t ya s s e s s m e n tm e t h o d s d e a l i n g 、析mt h ea t t a c ko ft h ec h e m i c a l sa n dm i c r o b i a l s a n dt h e ni n t r o d u c et h e a p p l i c a t i o no ft h em i c r o b i a ls e = n s o rt e c h n o l o g yi nt h et o x i c i t ya s s e s s m e n t l a s t l y ，w e i n t r o d u c et h ei m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yo f t h em i c r o b i a ls e n s o r 2007属博士学位论文4 a b s t r a c t c h a p t e r2t o x i c i t ya s s e s s m e n to fc y a n i d ea n dt e t r a m e t h y l e n ed i s u l f o e t r a m i n e ( t e t r a m i n e ) u s i n gl u m i n e s c e n tb a c t e r i av i b r i oq i n g h a i e n s i sa n de e o l ie l e c t r 醛 c h e m i c a ls e n s o rt e c h n o l o g y i nc h a p t e r2 ，t h et o x i c i t yo fc y a n i d ea n dt e t r a m e t h y l e n ed i s u l f ot e t r a m i n e ( t e t r a m i n e ) w e r ee v a l u a t e db yt w o m e t h o d s o n ew a sb yu t i l i z i n gv i b r i oq i n g h a i e n s i s - ak i n d o fl u m i n e s c e n tb a c t e r i aw h i c hc a np r o d u c eb i o l u m i n e s c e n e ea n dt h e b i o l u m i n e s c e n e ew i l ld e c r e a s ew i t ht h ea d d i t i o no f t o x i c a n t s a n o t h e rm e t h o d w a sb y u s i n gak i n do fm o d i f i e de l e c t r o d eo nw h i c he s c h e r i c h i ac o l i ( e c o ms h o w s c u r r e n t r e s p o n s ea tac e r t a i np o t e n t i a la n dt h ec u r r e n tw i l ld e c r e a s ew i t ht h ea d d i t i o no f t o x i c a n t s h n a l l y , i o n - c h r o m a t o g r a p h ya n dg c m sw e r eu t i l i z e dt oi n d e n t i f ya n d d e t e r m i n ec y a n i d ea n dt e t r a m i n er e s p e c t i v e l y c o m p a r e d 、 ，i t l lt r a d i t i o n a lt o x i c i t y e v a l u a t i o nm e t h o d s ，t h i sm e t h o dw a sr a p i d , s e n s i t i v e ，a n dn e e d e dl i t t l e s a m p l e b e s i d e s ，i tc a r la l s ob ea p p l i e dt od e t e r m i n et h et o x i c i t yo f o t h e rp o i s o n s c h a p t e r ”3t h e “d e v e l o p m e n to ft h el u m i n e s c e n tb a c t e r i ab i o s e n s o ra n di t s a p p l i c a t i o nt ot h ee v a l u a t i o no f t o x i c i t yo f p e s t i c i d e s i nt h i sc h a p t e r , v i b r i oq i n g h a l e n s i s ( ak i n do fl u m i n e s c e n tb a c t e r i aw h i c hl i v e si n 缸s hw a t e r ) w a su t i t i z e da sa ni n d i c a t o ra n df i x e db ys o l - 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c o u n t i n gm e t h o d s p a r t2 ( c h a p t e r 蝣s t u d y0 1 1t h ea p p l k a t i o no fl u m i n e s c e n tb a c t e r i at ot h e e v a l u a t i o na n da n a l y s i so f t h el w - s h i e l d i n g p r o p e r t yo f n a n oo x i d e i nt l l i sc h a p t e r , i tw a sf o u n dt h a tl u m i n e s c e n tb a c t e r i ac o u l db ek i l l e db yu v l i g h t a n dt h eb i o l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw o u l db ed e c r e a s e d w i t ht h ep r o t e c t i o no fn a n o o x i d e ，t h ed e c r e a s eo f t h eb i o l u m i n e s c e n c ec o u l db es u p r e s s e d ，t h e r e f o r el u m i n e s c e n t b a c t e r i ac o u l db eu t i l i z e dt oa n a l y z ea n de v a l u a t et h ew - s h i e l d i n gp r o p e r t yo fn a n o o x i d e v i b r i o q i n g h a i e n s i sq 6 7 ，ak i n do fl u m i n e s c e n tb a c t e r i a , w a su s e dh e r et o s t u d yt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tk i n d sa n dc o n c e n t r a t i o n so fn r t l oo x i d eo nt h e l u m m e s c e n c ei n t e n s i t yo fb a c t e r i a , w h i c hw e r ei l l u m i n a t e db yu vl i g h t am e t h o d w a se s t a b l i s h e da c c o r d i n gt ot h er e l a t i v ev a l u eo ft h ed e c r e a s eo ft h el u m i n e s c e n c e i n t e n s i t y , w h i c hc a nb eu s e dt oa n a l y z ea n de v a l u a t et h eu v - s h i e l d i n gp r o p e r t yo f 2 0 0 7 届博士学位论文 6 a b s t r a c t n a n oo x i d e t h ed e t e r m i n e du v - s h i e l d i n gp r o p e r t ys e q u e n c eo ff o u rk i n d so fn r n o o x i d ew a s f l u k a - t i 0 2 p 2 5 t i 0 2 c f a - t i 0 2 z n o c h a p t e r 7s t u d yo nt h ea p p f i c a f i o no f e c o l ie l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rt e c h n o l o g y t o t h e e v a l u a t i o na n d a n a l y s i so f t h e u v - s h i e l d i n g p r o p e r t y o f n a n o o x i d e i nt h i sc h a p t e r , an a n o - p b 0 2 a g oe l e c t r o d ew a s p r e p a r e db ye l e c t r o d e p o s i t i o n m e t h o d i ti sf o u n dt h a tw h e nac o n s t a n tp o t e n t i a lo f1 0 vw a sa p p l i e d , u s i n gt h i s e l e c t r o d ea st h ew o r k i n ge l e c t r o d e ，a no x i d a t i o nc u r r e n tw i l lb eo b s e r v e dw i t ht h e a d d i t i o no fe s e h e r i e h i ae o l i ( e c o l i ) t h ec u r r e n ti sp r o p o r t i o n a lt ot h ee d ln m n b c r s f r o m2 x 1 0 5 c f u m lt o1 6 1 0 6 c f u m l ，a n ds ot h i se l e c t r o d ec a nb ea p p l i e da sa m i c r o b i a ls e n s o rt od e t e r m i n et h en u m b e r so fe e o l i t h i se l e c t r o d ew a su s e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h es u r v i v a lr a t i oo fe c o l ie x p o s e du n d e rt h eu v - r a y sw i t ho r w i t h o u tt h ep r o t e c t i o no fi i r u t o - o x i d e w h i e b p r o v i d e dan 钾e l e c t r o c h e n l i c a lm e t h o d t oe v a l u a t et h eu v - s h i e l d i n gp r o p e r t yo fn a n o - o x i d eo rt oc h o o s en a n o - o x i d ea st h e s u n s c 舱e n 2 0 0 7 届博士学位论文 7 第一章绪论 第一章绪论 1 1 化学生物袭击物的毒性测试方法概述 蟊1 1 。化学生物毒性测试方法的重要性及其发展 迈进新世纪人类文明有了更高的发展，但恐怖活动并没有随着新千年的到来 而消失，反而更加频繁。刚刚迈入新世纪的门槛，就发生了举世震惊的“9 1 1 ” 事件。这一事件发生后，“恐怖活动”、“恐怖主义”在过去人们还比较陌生的 名词，已成为各国政要、新闻媒体使用频率最高的词汇之一。在恐怖活动中，投 毒和爆炸仍然是恐怖分子使用的主要方式。在投毒案件中，恐怖分子主要用的是 氰化物和毒鼠强，特别是毒鼠强。毒鼠强由于其毒性强，性质稳定，在自然条件 下难以降解，对环境污染大，能够造成二次中毒，我国有关部门在1 9 9 1 年和1 9 9 8 年两次规定禁止其生产和使用，但是由于其生产简单，灭鼠效果好，民间仍有大 量非法使用者，因此投毒者有了大量的投毒来源。中国预防科学院中毒控制中心 1 9 9 8 年调查显示，在杀毒剂中毒中，毒鼠强中毒占2 6 ，个别地区甚至占9 0 。 近年来毒鼠强中毒案件频繁发生，2 0 0 2 年9 月南京汤山投毒案造成3 0 0 多人中毒、 4 2 人死亡；2 0 0 4 年1 0 月湖北利川投毒案造成3 3 人中毒、1 0 人死亡，可以说毒鼠强 已成为恐怖分子进行投毒的主要毒物。因此深入研究检测应对化学生物袭击的传 感技术已成为摆在大家面前的重要课题。 在一定条件下，较小剂量即能够对机体产生损害作用或使机体出现异常反应 的外源性化学或生物物质称为毒物。毒物可以是固体、液体和气体，在与机体接 触或进入机体后，能与机体相互作用，发生物理化学或生物化学反应，引起机体 功能和( 或) 器质性的暂时性或永久性损害，严重的甚至危及生命。 人类最早认识的毒物，主要是一些动植物中的天然毒素以及有毒的矿物质， 本世纪以来，随着化学工业的迅速发展，人类生产和使用了许多种类的化学物质， 其中人工合成的约1 0 0 0 余万种，而且每年还有很多新的化学物质进入生产和生 活环境。据估计，目前常用的化学物质有8 万多种，按其用途和分布范围可分为 以下几类： 2 0 0 7 届博士学位论文8 第一章绪论 1 工业化学品如生产用的原料、辅助剂以及生产中产生的中间体、副产品、 废料和成品等。 2 食品添加剂及食品污染物如天然的或食品变质后产生的毒素，以及各种食 品添加剂如糖精、香精、食用色素和防腐剂等。 3 日用化学品如化妆品、洗涤用品、家庭卫生防虫杀虫用品等。 4 农用化学品如化肥、农药、除草剂、植物生长调节剂、瓜果蔬菜保鲜剂和 动物饲料添加剂等。 5 医用化学品 如各种用于诊断、预防和治疗的化学物质，如血管造影剂、医 用消毒剂和药物等。 6 环境污染物如废水、废气和废渣中含有的各种化学物质。 7 生物毒素也称为毒素，它是活的生物体产生的一种特殊毒物。根据其来源可 分为以下几种：动物毒素：即由低等动物产生的毒素；植物毒素：即由植物 产生的毒素，如龙葵素；霉菌毒素：是由某些霉菌产生的毒素，如黄曲霉毒素； 细菌毒素：为细菌产生的毒素，其中存在于细菌细胞内的毒素称为内毒素，在 细菌内合成后排出菌体的毒素称为外毒素。 8 军事毒物 主要指用于军事上的一些化学物质，如芥予气等各种战争毒剂等。 9 放射性核素即具有放射能的元素。 众多毒物的存在对环境造成了极大的污染，对人类的日常生活与身体健康造 成了极大的危害。为了保护人类的生活环境，因此迫切需要对毒物的快速毒性评 价。在对样品的毒性检测方法中，化学分析虽然灵敏、准确，但由于时间、费用 以及对样品的不可知性使其在毒性的实际筛选中受到很大限制，另外，混合样品 中不同的化合物彼此之间存在着协同或拮抗作用，所以最终的毒性作用并非单一 物质作用的加减，因此必须使用生物方法对综合的毒性效应( 尤其对于未知物) 进行测定。早期的生物毒性评价一般采用向哺乳动物如鼠类口服毒物然后观察实 验动物在2 4 7 2 小时内的l d 5 0 ( 半致死量) ，由于该评价方法耗时长，操作复杂， 不能快速反映被测物质的毒性，因此随后渐渐发展为利用鱼类【1 。3 1 ，浮游生物， 藻类【4 ，5 1 及至微生物删来进行毒物的毒性评价。 其中发光菌因其独特的生理特性、与现代光电检测手段相匹配的特点，更由 于其相比于其他生物的快速、经济、节省空间且可靠等优点而备受关注，由此发 2 0 0 7 届博士学位论文 9 第一章绪论 展了利用发光菌进行毒性检测的方法。 1 2 发光细菌毒性检测法的产生和原理 发光菌属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，宽约0 4 - 1 0 l i m ，长约1 0 2 5 | i i l l ， 无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，最适生长温度2 0 - 3 0 2 ，最适生长p h 为6 0 9 0 。常用于生物毒性测试的海洋发光菌，其生长介质中含3 的n a c l 和0 3 的甘油对发光反应很有利。大部分发光菌的栖息地是海洋。在发光菌毒 性测试中应用较多的是明亮发光杆菌，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的 蓝绿色荧光。发光机理是由于发光细菌体内的荧光素酶催化荧光素的氧化作用， 反应如下： f m n h 2 + 0 2 + r - c o - h f m n + r c 0 0 h + h 2 0 + l i g h t t l o l 从而产生生物发光，它直接与细胞的活性及代谢状况相关。发光菌发光的光 谱范围约4 2 0 6 7 0t i m , m a x 在4 7 5 4 8 5 n m 左右，为单一发射峰， m a x 和半高宽有 种属差异。发光菌生长初期发光很弱，对数生长中期发光强度达到高峰，稳定期 时发光强度下降。已有研究发现细菌细胞合成的“自诱导物”( a u t o i n d u e e r ) 在对 数中期大量积累，因此导致发光迅速增强【l l 】。目前对细菌发光的调控研究已深入 到基因水平。通过基因分析等方面的研究发现 1 2 1 ，细菌发光现象是细胞内的发光 基因( l u x g e n e ) 及其操纵子表达与调控的结果。 发光菌的发光现象是其正常的代谢活动，在一定条件下发光强度是恒定的， 与外来受试物( 无机、有机毒物，抑菌、杀菌物等) 接触后，毒性物质将改变细胞 的状态，包括细胞壁、细胞膜、电子的转移系统、酶及细胞质的结构，这些变化 最终将导致生物发光的减弱，变化的大小与受试物的浓度呈相关关系，同时与该 物质的毒性大小有关。通过生物发光光强的测定即可计算得到样品毒性的强弱。 t h o m u l k 【i 驯认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光；( 1 ) 直接抑制参与发 光反应的酶类活性；( 2 ) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程( 如细胞呼吸等) 。 发光菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光菌发光强度的影响。毒 物的毒性可以用e c 5 0 表示，即毒物与发光菌作用使其发光强度降低5 0 时所需 毒物的浓度。实验结果显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而 可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光强度表征毒物所在环境的急 2 0 0 7 届博士学位论文1 0 第一章绪论 性毒性。 薹1 3 发光细菌梭测法的应餍 发光菌在二十世纪3 0 年代首先用于快速评价药物的毒性作用【1 4 1 。2 0 世纪 5 0 年代起，由于工业污染日益严重，其在环境中的应用因此开始受到重视。由 于研究水生生态系统复合污染的潜在影响越来越依赖毒性实验，需要发展一种短 期、经济、快速的测试体系来代替传统的长期毒性检验。1 9 7 8 年，美国b a c k m a n 公司研制成一种生物发光光度计( 或称生物毒性测定仪) 商标名称“m i c r o t o x ”，所 用菌剂是明亮发光杆菌( p h o t o b a e t e r i u mp h o s p h o r e u m ) ，测试采用细菌冻干粉或菌 悬液，接触受试样品所引起的发光强度的变化由光电倍增管及放大器组成的测试 仪上记录。其灵敏度可与鱼类9 6 小时急性毒性试验相媲美，因其快速、简便、 费用低廉而独具特色，从此，发光细菌毒性测试( l u m i n e s c e n tb a c t e d a t o x i c i t yt e s t ， l b d 技术在全世界范围内得到了广泛应用i ”5 2 1 ，其应用主要包括以下几个方 面： a 测定纯化合物( 包括有机物、无机金属离子) 的急性毒性： 1 9 8 1 年，c h a n g 等人 7 1 用m i c r o t o x 测定了许多有机化合物、农药、呼吸抑制 剂的毒性。1 9 8 4 年，i n d o r a t o 等人【2 9 悃m i c r o t o x 筛选那些至今无急性毒性资料 的化合物，发现许多化合物的e c s 0 值与被这些化合物污染的水体l c s o 值( 鱼体 半致死毒物浓度) 存在正相关性，证明该法是一种可满足环境水样毒性测定的方 法。1 9 9 4 年n 6 等【3 0 】利用发光细菌及胆碱酯酶两种分析方法对六种有机磷农药 进行了毒性分析，结果表明二者的分析结果有很好的相关性。2 0 0 0 年g e o r g 3 l l 将发光细菌用于对几种不同的重金属离子以及有机物的毒性评估，并将评估结果 与其他评估方法的结果进行了比较。2 0 0 0 年t a u r i a i n e n 等【3 2 】利用重组发光细菌 对自然水源中的几种金属离子和金属络合物进行了测定，结果表明该方法灵敏， 快速，测定效果甚至高于化学分析的测定方法。2 0 0 1 年j e n n i n g s 等人【3 3 埔三种 发光菌测试系统( t o x a l e r t1 0 ( r ) ，m i c r o t o x ( r ) a n dl u m i s t o x ( r ) ) 测定了8 0 多种 化合物的毒性并将结果进行了比较，认为三种测试系统有很好的相关性。 b 测定工业排放废水和受污染水质毒性： 2 0 0 7 届博士学位论文 第一章绪论 s a n c h e z 等人 2 0 3 4 - 3 6 利用发光细菌对工业废水的毒性进行了监测，并和其他的 监测方法进行了比较，证实发光细菌毒性监测法和其他的监测方法具有很高的相 关性。k y u n g h o 等 ”】利用m i c r o